全 文 ：书小花碱茅组织培养植株再生体系的建立
王雪芳１，王春梅２，张金林１，段丽婕１，王锁民１
（１．兰州大学草地农业科技学院 草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州７３００２０；
２．中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州７３００５０）
摘要：以小花碱茅成熟种子为外植体，研究了脱颖处理和不同激素配比对愈伤组织诱导和分化的影响，成功建立了
其组织培养植株再生体系。结果表明，种子脱颖处理显著提高了种子发芽率，降低了污染率；诱导愈伤组织的最佳
培养基为添加５．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ的 ＭＳ培养基，诱导率可达５５．２％，２周可见白色愈伤组织；最佳芽分化培养基为添
加１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ和０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ的 ＭＳ培养基，分化率可达３１．７％，同时伴随根毛的发生，生根率达８１．７％，
诱导时间为２周；分化后的再生苗移植于１／２ＭＳ培养基上，１００％生根，炼苗移栽后可全部成活。从小花碱茅种子
诱导愈伤组织到植株再生共需１６周左右。小花碱茅组织培养植株再生体系的建立为进一步探究小花碱茅耐盐碱
分子机制奠定了基础。
关键词：小花碱茅；成熟种子；组织培养；植株再生
中图分类号：Ｓ８１２；Ｓ５４３＋．９；Ｑ９４３．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０６０３５５０６
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０６４３
小花碱茅（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪）又名星星草，属多年生禾本科碱茅属草本植物，生长于草甸草原、盐渍化土
壤碱斑周围［１］，多分布于哈萨克斯坦、阿尔泰到亚库梯地区以及我国东北、内蒙古、华北、西北等地。由于其较强
的耐盐碱性，小花碱茅常成为草原区盐化或碱化草甸的优势种，如今更逐渐成为改良和利用盐碱地草原草甸的建
群种，我国从２０世纪８０年代开始利用小花碱茅改良盐碱地，取得了良好的效果。小花碱茅不仅可以绿化盐碱
地、改善生态环境，而且还可以改善土壤的理化性质，为其他农作物和牧草栽培提供可生存的环境，这些优点使它
成为了生物改良盐碱地的首选草种之一［２］。
近年来，科学家们对小花碱茅的生理生态特性、对土壤理化性质的影响、抗盐碱的解剖结构及离子吸收与分
配的生理机制等方面进行了大量的研究［３７］，亦克隆和鉴定了与其耐盐性相关的一批基因［８１１］，但要进一步深入
分析这些基因在小花碱茅适应盐生境中的作用机制，尚亟待建立小花碱茅组织培养植株再生体系。本研究以小
花碱茅成熟种子为外植体，成功建立了完整的小花碱茅组织培养植株再生体系，为进一步探究其耐盐碱的分子机
制奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
小花碱茅成熟种子于２００９年８月采自兰州大学榆中校区试验田，阴干后置于－２０℃冰箱中，次年选取籽粒
饱满的种子备用。
１．２ 种子脱颖处理及消毒
选取成熟饱满的种子置于研钵中，轻研数下后得到脱颖的褐色种子，分别将脱颖和未脱颖的种子置于超净工
作台中，用７５％的酒精消毒３ｍｉｎ，再用５％的次氯酸钠消毒１０ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗３～５次。
１．３ 愈伤组织的诱导
以 ＭＳ＋３％蔗糖＋０．７％琼脂（ｐＨ７～８）为基本培养基，分别添加１）３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ；２）５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ；３）３
第２３卷 第６期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
３５５－３６０
２０１４年１２月
收稿日期：２０１２１２０３；改回日期：２０１３０４２２
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７０４３１，３１２０１８４１）和教育部博士点基金优先发展领域项目（２０１３０２１１１３０００１）资助。
作者简介：王雪芳（１９８６），女，山西忻州人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｆ＿ｗａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｍｗａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；４）５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；５）７ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；６）５
ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．３ｍｇ／Ｌ６ＢＡ作为愈伤组织的诱导培养基。然后将消毒后的种子接种于上述培养基上遮光培
养，每个培养皿接种７０粒种子，每种培养基１０个重复。分别在２和４周后观察、统计愈伤组织生长情况，并选择
生长良好的愈伤组织继代２次，继代周期为４周。
１．４ 愈伤组织的分化
以 ＭＳ＋３％蔗糖＋０．７％琼脂（ｐＨ７～８）为基本培养基，分别添加１）０．３ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；２）０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；３）
１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ；４）１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ；５）１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ；６）３．０ｍｇ／Ｌ６
ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ作为愈伤组织的分化培养基。选取直径约１ｃｍ左右生长良好的黄色颗粒状胚性愈伤组织
接种于上述培养基上光照培养，每个培养皿转接１０个愈伤组织块，每种培养基６个重复。分别在２和４周后观
察、统计芽点分化情况。
１．５ 生根培养与移栽
愈伤组织分化出芽点再经４周生长后，移植于１／２ＭＳ＋１％蔗糖＋０．７％琼脂的培养基上进行生根培养。待
组培苗生长至１０ｃｍ左右时，开盖后炼苗１周，然后将完整的再生植株移栽于营养土∶蛭石为３∶１的基质中，并
保证温室湿度，隔天浇水。
１．６ 培养条件
培养室温度恒定保持（２５±１）℃，愈伤组织分化和植株再生阶段的光照强度为５０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光周期为
１６ｈ／ｄ。
１．７ 统计分析方法
用ＳＰＳＳ１７．０进行方差分析和显著性分析，用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００３制图。
２ 结果与分析
２．１ 种子脱颖处理
种子脱颖后，发芽率显著提高，由７．６％增至
５０．８％，且污染率也有显著降低（图１），由此可见种子
脱颖对种子发芽以及愈伤组织的诱导是至关重要的。
因此，本研究后续试验采用脱去颖壳的种子为外植体。
２．２ 愈伤组织的诱导
将脱颖的小花碱茅种子接种于愈伤组织诱导培养
基上，３～４ｄ后发芽，２周后在纤细的胚芽基部可见白
色的愈伤组织，４周后的愈伤组织直径约３ｍｍ左右，
呈白色团状，经１次继代后，部分逐渐转化为黄色颗粒
状。愈伤组织诱导率在一定范围内随着２，４Ｄ浓度的
增加而升高，当培养基中２，４Ｄ浓度为５．０ｍｇ／Ｌ时，
愈伤组织诱导率最高，达５５．２％，此后，随着２，４Ｄ浓
度继续增加到７．０ｍｇ／Ｌ时，反而会抑制愈伤组织的
诱导（表１），同时，在培养基中添加６ＢＡ时，愈伤组织
诱导率会下降，且水化状态加重、生长缓慢。结果表
明，诱导小花碱茅愈伤组织最适的激素配比浓度为５．０
ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ，不添加６ＢＡ。
表１ 不同浓度激素配比对愈伤组织诱导的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狏犪狉犻狅狌狊犺狅狉犿狅狀犲狉犪狋犻狅狊狅狀
犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮狋犻狅狀犻狀犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
激素浓度
Ｈｏｒｍｏｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／Ｌ）
２，４Ｄ ６ＢＡ
愈伤组织诱导率
Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
１ ３ ０ ５２．１±２．２ａｂ
２ ５ ０ ５５．２±２．１ａ
３ ３ ０．１ ４２．４±１．９ｃｄ
４ ５ ０．１ ４６．９±２．０ｂｃ
５ ７ ０．１ ３８．６±１．４ｄ
６ ５ ０．３ ４３．７±２．８ｃｄ
注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示差异显著 （犘＜０．０５，
Ｄｕｎｃａｎ测验），下同。
Ｎｏｔｅ：Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓ±ＳＥ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５（Ｄｕｎｃａｎｔｅｓｔ）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．３ 愈伤组织的分化
将小花碱茅胚性愈伤组织转接于分化培养基上光照培养，２周后开始出现绿色芽点，随着６ＢＡ浓度的增加，
愈伤组织分化率逐渐提高，当６ＢＡ的浓度增加到１．０ｍｇ／Ｌ时，分化率最高，达３３．３％，进一步提高６ＢＡ浓度
６５３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
至３．０ｍｇ／Ｌ时，分化率明显下降（表２），由此可见促
进胚性愈伤组织分化的最佳６ＢＡ浓度为１．０ｍｇ／Ｌ。
实验还发现在培养基中添加 ＮＡＡ后，分化率虽没有
显著提高，但随着培养时间的延长，大部分胚性愈伤组
织表面都会分化出许多毛状根（图２Ｃ），且ＮＡＡ浓度
越高，生根越明显，其中当 ＮＡＡ的浓度为０．５ｍｇ／Ｌ
时，生根率达到了８１．７％。结果表明，诱导分化的最
适激素浓度配比为０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１．０ｍｇ／Ｌ６
ＢＡ。
２．４ 生根和移栽
将分化出芽点并带有根毛的愈伤组织移入１／２
ＭＳ＋１％蔗糖＋０．７％的培养基上，生根率达１００％，
且其根系发达（图２Ｄ）。待组培苗生长至１０ｃｍ左右
时，开盖炼苗１周，移栽后全部成活，生长良好（图２Ｇ）。
表２ 不同浓度激素配比对小花碱茅愈伤
组织芽分化和生根的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狏犪狉犻狅狌狊犺狅狉犿狅狀犲狉犪狋犻狅狊狅狀犫狌犱犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀
犪狀犱狉狅狅狋犻狀犵犳狉狅犿犮犪犾狌狊犻狀犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
激素浓度 Ｈｏｒｍｏｎｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｇ／Ｌ）
ＮＡＡ ６ＢＡ
愈伤组织分
化率Ｃａｌｕｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
胚性愈伤组织
生根率 Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｒａｔｅｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｃａｌｕｓ（％）
１ ０ ０．３ ２１．７±７．０ａｂ ４５．０±１０．８ｂ
２ ０ ０．５ ２６．７±４．２ａ ３５．０±１１．８ｂｃ
３ ０ １．０ ３３．３±４．２ａ １０．０±５．２ｃ
４ ０．２ １．０ １８．３±４．８ａｂ ６０．０±９．３ａｂ
５ ０．５ １．０ ３１．７±３．１ａ ８１．７±９．８ａ
６ ０．２ ３．０ １０．０±５．２ｂ ６５．０±１３．８ａｂ
图１ 小花碱茅种子脱颖处理对其发芽率和污染率的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犺狌狊犽狅犳犳狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅狀狊犲犲犱犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犪狀犱犮狅狀狋犪犿犻狀犪狋犻狅狀狉犪狋犲狊犻狀犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
不同小写字母表示差异显著 （犘＜０．０５，Ｄｕｎｃａｎ测验）。Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５（Ｄｕｎｃａｎｔｅｓｔ）．
图２ 小花碱茅组织培养植株再生体系
犉犻犵．２ 犘犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿狏犻犪狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲犻狀犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
Ａ：愈伤组织诱导Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｂ：胚性愈伤组织Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃａｌｕｓ；Ｃ：愈伤组织分化Ｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｄ：植株再生Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；Ｅ：炼
苗Ｅｘｅｒｃｉｓｉｎｇｐｌａｎｔｓ；Ｆ：移栽Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ；Ｇ：生长健壮的再生植株Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
７５３第２３卷第６期 草业学报２０１４年
３ 讨论
３．１ 种子脱颖处理对小花碱茅组织培养的影响
小花碱茅种子细小，呈纺锤形，外包被颖壳。颖壳显著影响小花碱茅种子的发芽率，脱去颖壳后，种子发芽率
提高了４３．２％，污染率也得到了显著降低（图１）。这可能是由于种子颖壳潜伏的微生物使种子消毒困难，颖壳中
含有的某种抑制物或颖壳妨碍了种子的呼吸从而抑制了种子的萌发。赵昕等［１２］研究发现种子颖壳、种皮透性以
及种子内含有的发芽抑制物质是结缕草种子休眠的主要原因；马彩云等［１３］研究发现，野生结缕草种子去颖后愈
伤组织诱导率有显著提高；李晓玲等［１４］在建立小花碱茅组织培养体系时也发现去颖处理能够得到较好的实验结
果。由此可见，脱颖处理对以种子为外植体的禾本科植物种子萌发和愈伤组织培养具有显著的促进作用。
３．２ 不同激素配比对小花碱茅愈伤组织诱导的影响
生长素类激素对禾本科植物的愈伤组织诱导、胚状体的产生以及试管苗的快繁和生根有很重要的作用［１４］，
２，４Ｄ是禾本科植物组织培养中公认的诱导愈伤组织效果最好的生长素类似物，这在高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪
犮犲犪）、早熟禾（犘狅犪）等［１５１６］禾本科牧草及农作物大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）［１７］中都得到了证实，李晓玲等［１４］的研究
结果也表明，２，４Ｄ在小花碱茅和朝鲜碱茅愈伤组织的诱导及继代培养中起着重要的作用。一般认为以成熟种
子作为外植体诱导愈伤组织时需要较高浓度的２，４Ｄ，且单子叶植物所需２，４Ｄ的浓度是双子叶的１０～２０
倍［１８］，本研究发现，当２，４Ｄ浓度增至５．０ｍｇ／Ｌ时，小花碱茅种子的愈伤组织诱导率达５５．２％，较李晓玲等［１４］
研究的愈伤诱导率高１．９％，在２，４Ｄ浓度达到７．０ｍｇ／Ｌ时，愈伤组织诱导率反而降低到３８．６％（表１）。钱海
丰和薛庆中［１９］的研究也发现，当２，４Ｄ浓度高于１２ｍｇ／Ｌ时，高羊茅种子愈伤组织的诱导会受到严重抑制，这可
能是因为生长素浓度过高提高了植物组织内多酚氧化酶的活性，从而增加了愈伤组织的褐化、降低了愈伤组织的
诱导［２０］。在植物愈伤组织诱导中，一般配合使用低浓度的细胞分裂素可提高愈伤组织的质量和诱导率，本研究
中却得到了相反的结果：０．１和０．３ｍｇ／Ｌ６ＢＡ均在一定程度上抑制了小花碱茅愈伤组织的诱导（表１）。李俊
琴等［２１］在研究新麦草（犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪）幼胚愈伤组织诱导时也发现，添加６ＢＡ反而会抑制其愈伤组织
的形成。
３．３ 不同激素配比对小花碱茅胚性愈伤组织分化和生根的影响
ＮＡＡ是植物组织培养中常用的生长素类激素之一，在诱导愈伤组织分化时使用较多，其使用的浓度范围是
０．１～１．０ｍｇ／Ｌ。有研究报道禾本科牧草高羊茅和黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）在分化时所用ＮＡＡ浓度均为０．５
ｍｇ／Ｌ［２０，２２］，本研究中也发现当ＮＡＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ时，小花碱茅分化率最高，达３１．７％（表２）。也有研究报
道ＮＡＡ不仅有利于愈伤组织芽点的分化，同时还可促进组培苗生根［２３］，本研究中也发现当 ＮＡＡ浓度为０．５
ｍｇ／Ｌ时，生根率达到了８１．７％。生长素浓度低于细胞分裂素浓度时会促进植物芽的形成，且细胞分裂素起主导
作用，６ＢＡ是促进植物细胞分裂分化的激素，在愈伤组织分化中起主导作用，其浓度使用范围为１．０～３．０
ｍｇ／Ｌ，本研究中发现０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的激素配比是诱导小花碱茅愈伤组织分化与生根的最
适激素配比，钱海丰和薛庆中［１９］也在２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ的分化培养基上诱导了高羊茅芽的分化
和生根，本研究与其结果基本一致。
许多植物组织培养的研究证实，无任何激素的１／２ＭＳ培养基是组培苗生根的最适培养基，它能很大程度地
提高组培苗移栽的成活率，本研究结果与其一致，小花碱茅胚性愈伤组织在１／２ＭＳ培养基上的生根率为１００％。
４ 结论
小花碱茅组织培养体系以脱颖后的种子为外植体，诱导愈伤组织的最适培养基为：ＭＳ＋５．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋
３％蔗糖＋０．７％琼脂；愈伤组织分化的最适培养基为：ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋３％蔗糖＋
０．７％琼脂，同时伴随大量毛状根的发生；生根培养基为：１／２ＭＳ＋１％蔗糖＋０．７％琼脂培养基，生根率可达
１００％，且移栽后全部成活。本研究建立的小花碱茅植株再生周期为１６周左右。
８５３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
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犳犾狅狉犪ａｎｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈ犗狊犎犓犜２；１ｆｒｏｍｒｉｃｅｉｎｙｅａｓｔａｎｄ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，
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９５３第２３卷第６期 草业学报２０１４年
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０６３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６