全 文 ：第 34卷　第 1期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2009年 2月
Vol.34　N o.1 　　Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition) Feb. 2009
文章编号:1000-5471(2009)01-0129-04
蒲苇愈伤组织的诱导和再生体系的建立①
韩　娇 , 　易小林 , 　张华峰 , 　李名扬
西南大学 园艺园林学院 花卉研究所 , 重庆 400716
摘要:以蒲苇成熟种子为外植体 , MS 为基本培养基并附加不同激素组合 , 筛选出诱导蒲苇愈伤组织产生和分化
的最佳培养基 , 成功建立蒲苇的再生体系.试验结果表明:蒲苇种子最佳灭菌方式是将种子灭菌前用无菌水浸泡
24 h 左右 , 然后用 75%酒精消毒 20 s , 再用 0.1%(W/ V)氯化汞消毒灭菌 10 min.愈伤组织诱导的最佳培养基为
MS+2 , 4-D 3.0 mg/ L+6-BA 0.1 mg/ L;愈伤组织分化的最佳培养基为 MS+6-BA 2.0 mg/ L+NAA 0.1 mg/ L;
分化继代的最佳培养基为 MS+6-BA 1.5 mg/ L+NAA 0.2 mg/ L;生根最佳培养基配方为 1/ 2MS+NAA 0.8 mg/
L+ 6-BA 0.2 mg/ L+(0.02%)AC.
关　键　词:蒲苇;成熟种子;愈伤组织;再生体系
中图分类号:Q949.71+4.2 文献标识码:A
蒲苇(Cortaderia sel loana)系禾本科(Gramineae)蒲苇属植物 , 是一种多年生草本植物[ 1] , 是著名的观
赏草 , 其株型优美 , 株高 1.5 m 左右 , 常绿 , 耐寒性强 , 叶聚生于基部 , 长而狭 , 呈线形自然下垂 , 叶色深
绿;花期 9 ～ 10月 , 花穗从叶鞘中抽出 , 成纺锤状圆锥花序 , 粉红色 , 观赏性可保持至春季[ 2] .近年来 , 随
着城市绿化种植品种的丰富 , 观赏草类越来越受到园林爱好者和设计者们的青睐.
目前 , 植物组织培养技术已应用于多种植物的人工培养 , 包括单子叶和双子叶植物 , 并成功获得了再
生植株 , 特别是禾本科植物的组培研究更是一个重要的突破[ 3-8] .但是对于观赏草这些逐渐成为城市园林绿
化新宠的植物 , 目前还未见有对其组织培养的大量研究 , 也未见有关于蒲苇愈伤组织诱导和植株再生的报
道.本试验采用蒲苇的成熟种子作为外植体 , 通过诱导愈伤组织分化得到再生植株 , 以期为蒲苇的遗传转
化和基因工程育种奠定基础 , 以利于品种的改良和新品种的开发;同时 , 也给其它一些禾本科观赏草的组
织培养提供参考.
1　材料和方法
1.1　试验材料
本试验所用材料为蒲苇种子 , 由浙江虹越花卉有限公司提供.
1.2　试验方法
1.2.1　种子的最佳灭菌方式选择
实验前 , 将蒲苇种子在常温下浸泡 18 ～ 24 h左右 , 去除漂浮于水面的不饱满的种子 , 取成熟饱满的种
子 , 无菌水冲洗 3次 , 然后对种子进行 75%酒精和 0.1%(W/V)氯化汞不同时间组合的灭菌处理 , 边消毒
边振荡 , 以使灭菌充分.具体处理方式为:①酒精处理时间分别选择 10 , 20和 30 s , 然后用无菌水冲洗 3
次;②氯化汞灭菌时间分别选择 8 , 10和 12 min , 无菌水冲洗 6 ～ 7次.最后 , 将灭菌过的种子接种在制备
好的 MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的培养基上 , 每个培养瓶接种 10粒 , 每个处理 6个重复 , 接种
完后 , 放入培养室中 , (25±1)℃, 观察并记录种子萌发和污染情况.
1.2.2　愈伤诱导的适宜激素浓度的筛选
蒲苇种子的愈伤组织诱导是植株再生的关键 , 本实验以 MS 培养基为基本培养基 , 蔗糖 30 g/L , 琼脂
① 收稿日期:2008-09-08
基金项目:重庆市建委项目(城科字 2007第 53号).
作者简介:韩　娇(1983-), 女, 重庆长寿人 , 硕士研究生 , 主要从事生物技术与花卉育种.
通讯作者:李名扬 , 教授 , 博士生导师.
DOI :10.13718/j.cnki.xsxb.2009.01.026
5 g/ L , 6-BA 0.1 mg/ L并附加不同浓度 2 , 4-D , pH 值调节至 5.8左右 , 高压灭菌:保持 121 ℃的高温 , 灭
菌消毒 20 min , 配制成愈伤组织的诱导培养基.无菌条件下 , 取消毒灭菌后的蒲苇种子接种在不同激素浓
度的诱导培养基上 , 每个培养瓶接种 10颗 , 每个不同浓度梯度的培养基接种10瓶.接种完后 , 放入培养室
中 , 黑暗条件下培养 , 观察并记录种子愈伤组织的发生情况 , 研究 2 , 4-D在蒲苇种子的愈伤组织诱导中的
作用效果 , 筛选蒲苇种子愈伤组织诱导的激素适宜浓度.
1.2.3　愈伤组织分化和增殖
将培养了 2个月后生长较好的愈伤组织转接到含有不同浓度的 6-BA 分化培养基上进行分化培养:
(25±1)℃, 光照 12 h/d , 观察并记录愈伤分化情况.
分化培养一个月后 , 将分化的组培苗连同愈伤组织一起继代 , 并对其进行增殖培养 , 在含有不同 6-BA
浓度的培养基中观察植株增殖情况.
1.2.4　生根培养
选择选择 3 ～ 4 cm 高的健壮无根苗 , 切掉基部愈伤转接到以 1/2MS 为基本培养基 , 附加不同浓度的
NAA并含有 6-BA以及活性炭作为对照 , 研究蒲苇组培苗生根的适宜条件.
1.2.5　炼苗和移栽
当幼苗根系生长发达后 , 将其封口膜去掉并在组培室炼苗 2 d , 然后将其移至自然环境下培养 2 d , 随
后加水进行水培 1 d后就将其小心的从培养瓶中取出来 , 洗净根部附着的培养基 , 然后将其移栽到含有珍
珠岩的沙土中培养.
1.3　数据处理
将实验中统计的数据进行以下处理:
种子萌发率(%)=(萌发的幼苗数÷接种的种子数)×100
种子污染率(%)=(污染的种子数÷接种的种子数)×100
愈伤组织诱导率(%)=(产生愈伤组织的种子数÷接种的种子数)×100
愈伤组织分化率 (%)=(分化出苗的愈伤组织块数÷接种愈伤组织块数)×100
再生植株移栽成活率(%)=(移栽存活的苗数÷移栽的总苗数)×100
2　结果与分析
2.1　蒲苇种子灭菌的最佳方法
在组织培养过程中 , 选择外植体的最佳处理方式是实验成功的基础.对蒲苇种子的消毒处理方式的研
究表明 , 只有当75%酒精处理20 s和0.1%氯化汞处理10 min相结合时 , 才能达到最佳的发芽率高和污染
率低的组合(图 1).
1.10 s 75%酒精+8 min 0.1%氯化汞;2.20 s 75%酒精+8 min 0.1%氯化汞;3.30 s 75%酒精+8 min 0.1%氯化汞;
4.10 s 75%酒精+10 min 0.1%氯化汞;5.20 s 75%酒精+10 m in 0.1%氯化汞;6.30 s 75%酒精+10 min 0.1%氯化汞
7.10s 75%酒精+12 min 0.1%氯化汞;8.20 s 75%酒精+12 m in 0.1%氯化汞;9.30s 75%酒精+12 min 0.1%氯化汞
图 1　不同处理方式对蒲苇种子灭菌效果的影响
2.2　愈伤组织诱导的适宜浓度配比
由于禾本科单子叶类草的组织培养研究起步比多数的双子叶植物的组织培养研究较晚 , 所以对其研究
的报道也不是很多 , 其主要原因是它们的愈伤诱导和分化再生有一定难度.在预实验中 , 我们将蒲苇种子
分别接种到添加了 2 , 4-D 、以及 2 ,4-D+6-BA 的培养基上 , 发现只有添加了 2 ,4-D的培养基上才有愈伤长
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成 , 而 6-BA 对愈伤的形成有一定的辅助作用.在无菌条件下 , 我们将蒲苇种子接种在 5个梯度的2 , 4-D
(1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 ,5.0 mg/L)附加0.1 mg/L 6-BA的 MS培养基上 , (25±1)℃的黑暗条件下培养 , 愈伤
诱导结果表明 , 诱导愈伤组织产生的最短时间是12 d , 到第30 d时统计 , 当 2 ,4-D浓度为3.0 mg/ L 时 , 不
仅愈伤组织诱导时间较短 , 其诱导率是最高的且生长状态最好(表 1).
表 1　不同浓度 2 ,4-D对愈伤组织诱导的影响
2 , 4-D浓度
/(mg· L-1)
接种数
/块
出愈时间
/d
出愈率
/ % 愈伤生长形态
1 100 17 38 体积很小 , 白色 , 但有幼苗生长较好
2 100 15 67 体积大小不一 , 乳白色 , 同时也有幼苗生长
3 100 13 74 形态整齐 , 乳白色颗粒状
4 100 12 71 形态也较整齐但开始变浅黄
5 100 14 69 体积减小 , 并严重黄化
2.3　愈伤分化的最佳培养方法
将继代培养后生长良好的愈伤组织转接到6-BA浓度为 0.5 ,1.0 ,1.5 ,2.0和 2.5 mg/L 5个浓度梯度并含
有0.1 mg/L NAA的 MS分化培养基上 , 分化的具体结果为:当 6-BA 浓度为2.0 mg/L 和2.5 mg/L时 , 分化
所需时间最短 , 仅 1 d便能观察到有绿色小点出现 , 其他浓度分化时间也很短 , 在第3 ,4 d便基本能看到小
绿点了.同时各浓度的分化率也很接近 , 都在 80%以上 , 其中当 6-BA 浓度为 2.5 mg/ L 时分化率达到了
92.3%, 但是其长势不是很好.分化一个月后进行的增殖培养发现 , 高浓度的 6-BA 会抑制幼苗的生长 , 有
的甚至致死 , 只有当 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 时幼苗表现出最好的生长情况(表 2).
表 2　不同浓度 6-BA对愈伤组织分化的影响
6-BA 浓度
/(mg· L-1)
接种数
/块
分化时间
/ d
分化率
/ % 幼苗生长状态 增殖培养幼苗生长情况
0.5 58 3 84.4 幼苗的数量和高度生长都比较缓慢
幼苗生长缓慢 , 且出现不同程度的
黄化死亡
1.0 65 2 84.6 幼苗分化多 , 但是苗子长不高 ,长势慢 愈伤分化能力减弱 , 幼苗生长好转
1.5 62 2 88.7 幼苗的分化数量和高度基本一致
幼苗生长粗壮 , 且高度一致 , 颜色
翠绿
2.0 61 1 91.8 生长较快 , 且幼苗高度一致 , 整体较繁茂
幼苗生长势减弱 , 且有黄化现象和
愈伤死亡现象
2.5 52 1 92.3 生长速度不一致 , 有的幼苗疯长 愈伤和幼苗都有很大程度的死亡
2.4　植株的再生与存活
刘用生研究发现 , 在培养基中加入活性炭可吸收非极性物质和色素等大分子物质 , 减少一些有毒物质
的影响 , 有利诱导生根[ 9] .我们对蒲苇生根进行了预实验:采用添加活性炭和不添加活性炭的相同 1/2 MS
培养基诱导根的生成 , 结果发现未添加活性炭的蒲苇几乎没有根生成 , 活性炭在蒲苇组培苗生根过程中产
生了重要作用.因此在研究 NAA 不同浓度对组培苗生根影响时添加了浓度为 0.2 mg/L 6-BA 和 0.02%
AC , 其具体结果见表 3.
表 3　不同浓度 NAA对幼苗生根的影响
NAA 浓度/(mg · L-1) 生根时间/d 生根率/ % 根生长状态
0.2 11 80 根比较细小且单一 , 无须根 , 浅黄色
0.4 9 90 主根细小但长度较长 , 有少量须根 , 浅黄色
0.6 8 100 形态开始变得有些粗 , 有须根 , 白色
0.8 8 100 须根生成较多 , 且根比较粗壮 , 白色
1.0 10 100 须根多 , 褐黄色 , 老化
　　由表可以得出 , 当 NAA 浓度为 0.6 mg/ L 和 0.8 mg/L 时蒲苇再生苗生跟时间都是 8 d开始生根 , 生
长一段时间后发现 NAA浓度为 0.8 mg/L 时幼苗的根生长势最好 , 所以 , 蒲苇组培幼苗的适宜生根培养基
为 1/2M S+NAA 0.8 mg/ L+6-BA 0.2 mg/L +(0.02%)AC.
经过 2 d的组培室炼苗 , 2 d的自然环境炼苗和 1 d的水培后 , 移栽到含珍珠岩的沙土中的蒲苇再生植
株存活率达到了 85%.
131第 1 期　　　　　　　　　韩　娇 , 等:蒲苇愈伤组织的诱导和再生体系的建立
3　小　　结
为有效提高种子的发芽率 , 同时减少污染率 , 从而获得最好的外植体的处理方式 , 对蒲苇种子选择用
75%酒精处理 20 s 和 0.1%氯化汞处理 10 min相结合的方法.
2 ,4-D是蒲苇组织培养中起决定作用的物质 , 2 , 4-D 的使用浓度直接影响到蒲苇愈伤组织的诱导的成
败 , 蒲苇愈伤组织诱导随 2 ,4-D浓度的增加而提高 , 但是高浓度的激素浓度对愈伤组织的生长有毒害作
用 , 因而选择了 3.0 mg/ L的 2 ,4-D作为蒲苇愈伤组织诱导的最佳激素浓度.
蒲苇愈伤组织分化成苗主要依靠 6-BA 的诱导推动 , 但是其诱导率却没有很大的影响 , 也许还和其他
的激素组合有相关性 , 但是幼苗的生长却受 6-BA 浓度的影响较大.因而在蒲苇分化时选择浓度为 2.0
mg/L 的 6-BA , 而继代时则选择 1.5 mg/ L 的 6-BA.
在蒲苇再生植株生根过程中 , 无意间发现活性炭对蒲苇的生根具有决定性的作用 , 而不仅仅是促进作
用 , 也许还有其他物质对蒲苇组培苗的生根具有决定性的作用 , 或者说激素浓度对生根质量有影响 , 这些
都还有待更深入的探索以建立最佳的蒲苇再生体系.
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Callus Induction and Establishment
of the Plant Regeneration System for Cortaderia selloana
HAN 　Jiao , 　YI Xiao-lin , 　ZHANG Hua-feng , 　LI Ming-yang
School of Hort iculture andLandscape Architecture , Inst itute of Ornamental Plants , Southwest University , Chongqing 400716 , China
Abstract:Mature seeds o f Cortaderia sel loana were used as explants and cultured on MS medium supple-
mented w ith dif ferent combinations of phy toho rmones.The optimal tissue culture system fo r callus induc-
tion and plant le t reg eneration fo r this species w as identi fied.The seeds we re soaked in sterili zed w ate r fo r
24 h before ste rilizat ion wi th 75% alcoho1 fo r 20 s and w ith 0.1%(w/v)hydrarg yrum chlo ride fo r 10
min.The best medium fo r callus induction w as M S+2 ,4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L .The best medium
fo r cal lus cy todif ferentiation w as M S+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L , and the best medium for plant
upg row th w as MS+6-BA 1.5 mg/L +NAA 0.2 mg/ L.The best ro oting medium was 1/2MS+NAA 0.8
mg/L+6-BA 0.2 mg/L +(0.02%)AC.
Key words:Cortaderia sel loana;mature seed;callus;regene rat ion sy stem
责任编辑　欧　宾　　　　
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