全 文 ：书细胞工程技术选育的草地早熟禾
新种质的耐热性分析
王婷婷，徐国荣，张举仁，杨爱芳
（山东大学生命科学学院，山东 济南２５０１００）
摘要：通过对离体培养的草地早熟禾丛生芽块进行高温处理，筛选出一批耐热性好的小芽。小芽成苗后移栽到花
盆在自然条件下生长。半年后对这些株系和原品种的植株进行热胁迫处理，同时测定叶绿素荧光、丙二醛含量、离
子渗漏率、叶绿素含量等生理指标的变化，得出细胞工程株系的植株耐热性明显较高，热胁迫处理后损伤程度小于
原品种植株。表明利用细胞工程技术能有效获得耐热性显著提高的草地早熟禾植株，为选育草地早熟禾耐热新种
质提供材料。
关键词：草地早熟禾；细胞工程；耐热性；生理指标
中图分类号：Ｑ９４３；Ｓ５４１＋．９０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０２００６００６
草地早熟禾（犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊）是一种优良的冷季型草坪草，是温带地区重要的草坪草种之一。它具有多种优
良特性，常用于草坪和绿地的建植。但草地早熟禾耐热能力差，在盛夏季节生长停止，甚至部分死亡［１］。若使草
地早熟禾品种获得良好的耐热性，不仅能在盛夏维持草坪绿色，而且可在夏季炎热地区被广泛利用，具有重要的
经济效益和环境效益。
有关草地早熟禾育种研究的报道相对较少，主要采用筛选自然突变体［２，３］或传统杂交［４，５］等方法培育新品
种。由于草地早熟禾兼性无融合生殖方式［６］，传统育种方法的利用受到很大的制约。随着细胞工程技术的发展，
将传统育种与细胞工程技术结合，利用体细胞无性系变异，进行突变体筛选，可以获得抗逆性增强的新品种。
１９９７年，Ｍｏｏｎ和Ｏｔｔｏｂｏｎｉ［７］将玉米（犣犲犪犿犪狔狊）愈伤组织培养在含有铝离子的培养基上，直接筛选出了耐铝的突
变体。１９９８年，张举仁和高树芳［８］利用玉米愈伤组织为材料，筛选出了对小叶斑病毒素具有抗性的愈伤组织并
再生植株。２００７年，宋玲玲［９］在加ＮａＣｌ培养基上连续３代筛选离体培养的高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犲犾犪狋犪）丛生芽芽块，
获得了耐盐耐旱性明显提高的株系。
温度对植物的生长发育有着重要的影响［１０］。植物在高温下的生理生化变化是反应植物耐热性的重要指
标［１１～１３］。在对冷季型草坪草高温条件下生理指标的测定中发现，叶绿素相对含量下降慢、细胞质膜透性和ＭＤＡ
含量低的品种其耐热性要好［１４，１５］。热胁迫下，草地早熟禾不同品种的生长发育均受到不同程度的影响，表现为
生长减缓、叶色变浅、伤害表现明显［１６］。另外，高温条件下，不同的光照条件对牧草的性状也有着重要的影响［１７］。
本研究以利用细胞工程技术获得的耐热性有一定提高的草地早熟禾株系为材料进行耐热性分析，确定这些株系
的耐热性与原品种相比是否有显著提高和它们的利用价值。
１ 材料与方法
１．１ 材料
所用的草地早熟禾品种为纳苏（Ｎａｓｓａｕ）和 Ｍａｒｄｏｎａ。
草地早熟禾无菌种子苗待胚轴伸长至２～５ｃｍ时，切取约５ｍｍ左右的上胚轴和茎尖部位，接种到诱导培养
基（ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋３０ｇ／Ｌ蔗糖）上培养１５～２０ｄ。待切段基
６０－６５
２００９年４月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第２期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
收稿日期：２００８０７１０；改回日期：２００８１０１６
基金项目：国家高技术研究发展（８６３）计划项目（２００７ＡＡ０９１７０１）资助。
作者简介：王婷婷（１９８３），女，陕西兴平人，硕士研究生。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｔｉｎｇｔｉｎｇ７２２＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｎｉｈａｏｈｕａ＠２６３．ｎｅｔ
部膨大后，将上面多余部分切去并剥离包裹在基部膨大部位的叶鞘，取基部约５ｍｍ切段转移到丛生芽继代培养
基（ＭＳ＋３．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋３０ｇ／Ｌ蔗糖）上培养１５～２０ｄ，逐渐有许多小芽从基部生出
形成丛生芽。将培养１５～２０ｄ后形成的丛生芽块剥去基部较老的叶鞘，切成３～４个小芽为单位的小芽块转移
到新的继代培养基上继续培养，每１５～２０ｄ继代１次，小芽不断扩增［１８］。
将继代培育半年的草地早熟禾丛生芽块切成大小一致的小块，在４９℃高温下处理１ｈ，然后放回正常生长条
件下（２５／２０℃ 光／暗，光照１６ｈ／ｄ，光强２０００ｌｘ）恢复培育２ｄ，再在４９℃下高温下处理１ｈ，然后恢复培养。在
恢复培养２周后将存活小芽中萎蔫程度轻、生长状态较好的小芽选出，生根后移栽至花盆。生长半年后，分株移
栽到纸杯，放于人工气候室中（２３／１８℃ 光／暗，光照１６ｈ／ｄ，光强１２０００ｌｘ）培养３０ｄ，选择生长状态基本一致的
植株进行耐热性分析。
耐热性分析所用株系有：１）Ｍ２６、Ｍ９７、Ｍ２５和 Ｍ９７，为耐热性筛选产生的 Ｍａｒｄｏｎａ细胞工程株系，ＭＣＫ为
Ｍａｒｄｏｎａ对照；２）Ｎ１、Ｎ５、Ｎ６３和Ｎ２１，为耐热性筛选产生的纳苏细胞工程株系，ＮＣＫ为纳苏对照。
１．２ 草地早熟禾植株热胁迫处理条件
人工气候室中培养的草地早熟禾按照下列温度变化在光照培养箱中进行热处理。
２３℃→３８℃（２ｈ）→４０℃（２ｈ）→４２℃（２ｈ）→４４℃（２ｈ）→４６℃（５ｈ）→２３℃（７ｄ）。
分别于处理前、处理结束后２和７ｄ时照相。其中部分材料热处理结束后将叶片全部剪去，观察生长情况，
生长１０ｄ后照相。
１．３ 叶绿素荧光的测定
图１ 热胁迫处理前后草地早熟禾的生长状态
犉犻犵．１ 犌狉狅狑狋犺狊狋犪狋狌狊狅犳犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犫犲犳狅狉犲犪狀犱犪犳狋犲狉犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊
Ａ：处理前；Ｂ：２３℃恢复生长２ｄ；Ｃ：２３℃恢复生长７ｄ；Ｄ：热胁迫处理后
剪去叶片在２３℃恢复生长１０ｄＡ：ｐｌａｎｔｓｂｅｆｏｒｅｓｔｒｅｓｓ；Ｂ：ｐｌａｎｔｓ
ｒｅｖｉｖｅｄｆｏｒ２ｄａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；Ｃ：ｐｌａｎｔｓｒｅｖｉｖｅｄｆｏｒ７ｄ
ａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；Ｄ：ｐｌａｎｔｓｈａｄｃｕｔｏｆｆｌｅａｖｅｓ
ｆｏｒ１０ｄａｎｄｇｒｅｗａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ
用便携式荧光测定仪（ｍｉｎｉＰＡＭ）在热激处理
前、３８，４０，４２，４４和４６℃处理完成时及２３℃恢复培
养１２和２４ｈ时分别测定草地早熟禾叶片叶绿素荧
光。测定前暗适应３０ｍｉｎ。
１．４ 丙二醛、离子渗漏率和叶绿素含量的测定
分别在热处理前、４６℃处理完成、２３℃恢复２和
７ｄ后４个时间点上取草地早熟禾叶片测定丙二醛
含量、离子渗漏率和叶绿素含量。丙二醛含量根据
赵世杰等［１９］方法进行测定，叶片离子渗漏率和叶绿
素含量按照王晶英等［２０］方法进行测定。
１．４．１ 丙二醛含量的测定 取不同胁迫时间的叶
片，加５ｍＬ提取液（１０％ 三氯乙酸）研磨离心，取上
清液２ｍＬ，加入０．６％ 硫代巴比妥酸２ｍＬ（内含
１０％ 三氯乙酸），摇匀，于沸水浴中煮沸１５ｍｉｎ，立
即放于冰上冷却，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清
液测定５３２，６００和４５０ｎｍ波长下的吸光度值。
１．４．２ 离子渗漏率的测定 取下叶片用蒸馏水洗
净、擦干，将叶片置于２５ｍＬ双蒸水中在真空干燥
器中于０．５×１０５Ｐａ负压下抽气１０ｍｉｎ，然后于室
温振荡２ｈ，再将样品煮沸１５ｍｉｎ，期间加水以避免
蒸干，冷却至室温后定容至２５ｍＬ测定电导率。
１．４．３ 叶绿素含量的测定 取胁迫处理的植株叶
片，剪碎后放于离心管中，８０％丙酮浸泡，避光放置，
直到叶片发白后将叶绿素丙酮提取液倒入比色杯中
１６第１８卷第２期 草业学报２００９年
用分光光度计分别在波长６６３和６４５ｎｍ下测定吸光度值。
１．５ 数据处理与统计学分析
叶绿素荧光测定设５个重复，丙二醛含量、离子渗漏率和叶绿素含量测定均设３个重复，所得数据用Ｅｘｃｅｌ
和ＳｉｇｍａＰｌｏｔ９．０进行统计分析。细胞工程植株与同条件下的原品种植株（野生型对照）相比较，犘＜０．０５和犘＜
０．０１为差异显著（表示）和极显著（表示）。
２ 结果与分析
２．１ 热胁迫对草地早熟禾表型的影响
胁迫处理前植株叶片鲜绿、挺拔，热胁迫处理完成时植株虽轻度萎蔫，但株系间差异不明显。２３℃恢复２ｄ
后，植株叶片萎蔫下垂，叶尖干枯，受损严重，细胞工程植株明显较好。２３℃恢复生长７ｄ时，各株系植株与胁迫
后２ｄ时相比萎蔫程度明显减轻，对照植株与经耐热性筛选的工程植株差异明显，对照植株恢复正常生长所需时
间较长（图１）。在恢复生长１０ｄ后，对照株系的生长状态明显差于各细胞工程株系的（图１Ｄ），细胞工程株系在
受胁迫后恢复快，１周后生长速率恢复到处理前水平。
２．２ 热胁迫对早熟禾叶片叶绿素荧光的影响
叶绿素荧光最大量子产量犉狏／犉犿（光化学效率）反映了ＰＳⅡ的最大光能转化效率。随着胁迫温度的升高，
草地早熟禾叶片的犉狏／犉犿值逐步下降（图２）。来自Ｍａｒｄｏｎａ的各个株系的下降程度低于对照Ｍａｒｄｏｎａ，即细胞
工程植株叶片的ＰＳⅡ损伤程度较轻。来自纳苏的各株系除Ｎ２１外，其犉狏／犉犿 值的下降程度也小于对照纳苏。
将热胁迫处理后的植株转入２３℃下恢复生长，犉狏／犉犿 在初期仍继续下降，然后逐步回升，但恢复速率不同。来
自 Ｍａｒｄｏｎａ的各细胞工程株系和除Ｎ２１外的来自纳苏的各细胞工程株系的犉狏／犉犿值在２３℃ 恢复２４ｈ时基本
回到胁迫处理前水平，而对照植株恢复慢，２３℃恢复２４ｈ仍明显低于胁迫处理前。
２．３ 丙二醛含量的变化
热激胁迫前，各株系间 ＭＤＡ含量差异不明显，均在１１ｎｍｏｌ／ｇＦＷ 左右。在４６℃处理５ｈ，不同株系的
ＭＤＡ含量均有上升，但上升幅度有差异。在胁迫恢复前期，ＭＤＡ含量继续上升，且对照植株比其细胞工程植株
上升速度快。其中来自 Ｍｏｒｄｏｎａ的３个细胞工程株系在２３℃恢复２ｄ时，ＭＤＡ含量均与 Ｍｏｒｄｏｎａ差异显著，
来自纳苏的Ｎ５和Ｎ１株系与纳苏相比ＭＤＡ含量也差异显著，即对照植株 ＭＤＡ含量最高。在恢复处理７ｄ时，
各株系的ＭＤＡ含量已停止上升或下降，说明细胞受损状态已部分恢复（图３），此时Ｍ２５和Ｎ６３等的ＭＤＡ含量
与对照之间仍存在显著差异，这些株系热胁迫处理后恢复速度较快。
２．４ 离子渗漏率的变化
离子渗漏率是反应细胞膜受损程度的一个重要的指标。在热胁迫处理前，对照和细胞工程植株叶片的离子
渗漏率差异不明显，均在４％左右。４６℃处理５ｈ，多数株系的离子渗漏率上升，其中对照植株上升幅度最大。热
胁迫后的恢复早期，叶片离子渗漏率继续上升，各株系间出现显著差异。与对照植株相比，多数细胞工程株系的
植株细胞膜受损程度小。随着恢复时间的延长，各株系的离子渗漏率都有所下降（图４），细胞膜受损程度得到明
显恢复。
２．５ 叶绿素含量的变化
环境胁迫可引起叶绿素合成受阻，降解加快，造成叶绿素含量下降。叶绿素含量对热胁迫的响应速度比较
慢。结果显示（图５），４６℃热处理５ｈ，不同株系的叶绿素含量无明显变化。在胁迫处理后的恢复早期，叶绿素含
量出现下降，但 Ｍ２６和 Ｍ９７变化不大，而对照 Ｍｏｒｄｏｎａ和 Ｍ２５则下降明显。在恢复生长后期，除对照外的各株
系的叶绿素含量都有增加，与对照相比达到差异显著水平。并且由于取样时新生叶片比例高导致叶绿素含量高
于胁迫处理前的（图５）。
２．６ 耐热植株后代的表现
经历耐热性试验的植株在恢复生长后，于次年春天开花结种。各株系均自然开花授粉，种子发育正常。其中
Ｍ２７和Ｍ９７的开花时间明显早于对照Ｍａｄｏｒｎａ，提前２０ｄ左右（图６）。有可能热胁迫对野生型植株造成较大损
２６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
伤，以致在恢复期生长较慢，开花时间推迟；也可能是耐热筛选时，产生了开花提前的突变体。不同的细胞工程株
系和对照相比，叶色和叶片性状在适宜温度条件下均无明显差异，但耐热性明显提高。
３ 讨论
作为一种冷季型草坪草，草地早熟禾最适的生长温度地上部为１５～２４℃，根系为１０～１８℃。这一特性使得
草地早熟禾在炎热地区难以越夏，大大制约了其应用。目前，对于草地早熟禾的耐热性的提高仅仅局限于利用适
当的水、肥、修剪等管理措施来提高其耐热性，有关利用生物工程的方法提高其耐热性未见报道。本研究利用生
图２ 热胁迫对草地早熟禾叶片犉狏／犉犿的影响
犉犻犵．２ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳狋犺犲犉狏／犉犿犻狀犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犾犲犪狏犲狊犱狌狉犻狀犵犺犲犪狋狊狋犲狉犲狊狊犪狀犱狉犲犮狅狏犲狉犻狀犵
图３ 热胁迫对草地早熟禾叶片丙二醛含量的影响
犉犻犵．３ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳犕犇犃犮狅狀狋犲狀狋犻狀犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犾犲犪狏犲狊犱狌狉犻狀犵犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊犪狀犱狉犲犮狅狏犲狉犻狀犵
２３℃２ｄ、２３℃７ｄ分别表示热胁迫处理后在２３℃恢复生长２和７ｄ。下同２３℃２ｄａｎｄ２３℃７ｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔ
ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇｆｏｒ２ａｎｄ７ｄａｔ２３℃ａｆｔｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
３６第１８卷第２期 草业学报２００９年
图４ 热胁迫对草地早熟禾叶片离子渗漏率的影响
犉犻犵．４ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳犲犾犲犮狋狉狅犾狔狋犲犾犲犪犽犪犵犲犻狀犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犾犲犪狏犲狊犱狌狉犻狀犵犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊犪狀犱狉犲犮狅狏犲狉犻狀犵
物工程技术获得了耐热性显著提高的早熟禾株系，该
图５ 草地早熟禾叶片叶绿素含量在热胁迫处理前后的变化
犉犻犵．５ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾犮狅狀狋犲狀狋犻狀犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊
犾犲犪狏犲狊犱狌狉犻狀犵犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊狋狉犲犪狋犿犲狀狋
株系植株可望在盛夏维持草坪绿色，并在炎热地区得
到推广利用。尽管这些株系的后代是否仍具有耐热性
有待进一步研究，但这些株系的无性繁殖体无疑有重
要应用价值。这进一步说明利用生物学技术可以很大
程度的提高牧草的生物学特性［２１］。
试验结果表明，草地早熟禾在高温条件下犉狏／犉犿
值和叶绿素含量均降低，说明植株光合系统受到破坏，
但随着温度回落，这种损伤在一定程度上是可以恢复
的。另外，ＭＤＡ含量和离子渗漏率在高温条件下降
低，说明细胞膜也出现一定的损伤。这些结果都与前
人的研究结果一致［２１］。本工作得出，可以通过诱变－
筛选等方法获得抗逆性增强的草地早熟禾。组织培养
图６ 经热胁迫处理后草地早熟禾开花时间上的差异
犉犻犵．６ 犜犺犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳犾狅狑犲狉犻狀犵狋犻犿犲狅犳犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犪犳狋犲狉犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊狋狉犲犪狋犿犲狀狋
的丛生芽经过耐热处理后选择抗性优异的小芽，并对这些小芽进行无性繁殖，然后再生植株。后者移栽到花盆中
进行耐热性测定，部分再生植株表现出比未经热处理的对照植株显著提高的耐热性，而且植株生长发育和形态特
征未出现异常。经过细胞工程筛选的株系在经历热胁迫处理后萎蔫程度轻，受损程度较低，恢复生长快。并且，
４６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
叶绿素荧光测定数据、叶绿素含量、叶片 ＭＤＡ含量和离子渗漏率变化的测定结果与形态学观察结果相一致［２２］。
可以认为细胞工程产生的耐热株系在热胁迫处理过程中耐热性明显高于野生型对照植株，这不仅能在盛夏维持
草坪绿色，而且可在炎热地区得到推广和应用，具有重大的经济效益和社会效益。
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（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５０１００，Ｃｈｉｎａ）
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５６第１８卷第２期 草业学报２００９年