全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：２８３ ２８８
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０２８３０６
松材线虫 Ｂｘｐｅｌ２基因的克隆及 ＲＮＡ干扰载体构建
邱秀文１，吴小芹２，黄 麟２，叶建仁２
（１．九江学院鄱阳湖生态经济研究中心，江西 九江 ３３２００５；
２．江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室，南京林业大学林学院，江苏 南京 ２１００３７）
收稿日期：２０１５１０２３
基金项目：国家“十二五”科技支撑专题“南方松林重大病虫综合控制技术集成与示范”（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０７０３）
作者简介：邱秀文（１９８４—），男，博士，讲师，主要研究方向：森林病理，Ｅｍａｉｌ：ｑｉｕｘｉｕｗｅｎ３＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：Ｅｍａｉｌ：ｊｒｙｅ＠ｎｊｆｕ．ｃｏｍ．ｃｎ
摘要：［目的］为了构建松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）果胶酶 Ｂｘｐｅｌ２基因干扰载体。［方法］通过 Ｔｒｉｚｏｌ法提
取松材线虫总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，设计带Ｔ７启动子的果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因引物，以ｃＤＮＡ为模板扩增出果胶酶
Ｂｘｐｅｌ２基因片段，连接到ＲＮＡ干扰载体，再以干扰载体为模板，ＰＣＲ扩增出目的片段后进行测序鉴定，合成果胶酶
Ｂｘｐｅｌ２基因双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），采用ＲＴＰＣＲ检测松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因干扰后的表达情况。［结果］表明：１）提取的
松材线虫总ＲＮＡ完整性好，无降解；２）成功克隆出松材线虫果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因片段（７９０ｂｐ）并将其连接至ｐＭＤ１９
Ｔ载体；３）以ＲＮＡ干扰载体为模板合成ｄｓＲＮＡ，浓度分别为１．３１３ｍｇ·ｍＬ－１和１．１５２ｍｇ·ｍＬ－１；４）ＲＴＰＣＲ结果显
示，松材线虫经过ｄｓＲＮＡ干扰后，Ｂｘｐｅｌ２基因表达基本受到抑制。［结论］成功构建松材线虫果胶酶 Ｂｘｐｅｌ２基因干
扰载体，为进一步研究Ｂｘｐｅｌ２基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础。
关键词：松材线虫；Ｂｘｐｅｌ２基因；ＲＮＡ干扰
中图分类号：Ｓ７６３ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓＰｅｃｔａｔｅＬｙａｓｅ２Ｇｅｎｅａｎｄ
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｔｓＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＶｅｃｔｏｒ
ＱＩＵＸｉｕｗｅｎ１，ＷＵＸｉａｏｑｉｎ２，ＨＵＡＮＧＬｉｎ２，ＹＥＪｉａｎｒｅｎ２
（１．ＰｏｙａｎｇＬａｋｅＥｃｏｅｃｏｎｏｍｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＪｉｕｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｕｊｉａｎｇ ３３２００５，Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；２．ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒ
ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＩｎｖａｓｉｖｅＳｐｅｃｉｅｓ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅｉｎＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．［Ｍｅｔｈ
ｏｄ］ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｉｎｔｏｃＤＮＡ．ＴｈｅｐｒｉｍｅｒｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅ．ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒ
ａｎｄｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｘｐｅｌ２
ｇｅｎｅｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）．［Ｒｅｓｕｌｔ］（１）ＴｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＴｒｉｚｏｌｍｅｔｈ
ｏｄｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．（２）ＴｈｅＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅ（７９０ｂｐ）ｏｆＢ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｃｏｎｎｅｃｔ
ｅｄｔｏｐＭＤ１９Ｔｖｅｃｔｏｒ．（３）ｄｓＲＮＡｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒｔｅｍｐｌａｔｅ，ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｏｆ１．３１３ａｎｄ１．１５２ｍｇ·ｍＬ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（４）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｄｓＲＮＡｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅａｂｅｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｏｌｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＢｘｐｅｌ２ｇｅｎｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ｐｒｏｃｅｓｓｏｆＢ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂｘｐｅｌ２ｇｅｎｅ，ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
松材线虫病又称松树萎蔫病（ＰｉｎｅＷｉｌｔＤｉｓ
ｅａｓｅ），是由松材线虫 （Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ
（Ｓｔｅｉｎｅｒ＆Ｂｕｈｒｅｒ）Ｎｉｃｋｌｅ）引起松属植物毁灭性死亡
的一种世界性森林病害［１－３］。目前，松材线虫致病
林 业 科 学 研 究 第２９卷
机制尚不清楚［４－５］。基因组学和分子生物技术的快
速发展，为进一步研究松材线虫致病相关基因的作
用和功能提供了技术支持。双链 ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）进
入细胞内在内切酶的作用下被分解为小的双链
ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ），ｓｉＲＮＡ分子与同源ｍＲＮＡ结合，
导致ｍＲＮＡ断裂，在核酸酶的作用下断裂形成的小
分子ｍＲＮＡ被降解，从而导致目的基因的沉默，这种
现象称为 ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）。自
从１９９８年发现小ＲＮＡ双链能有效干扰生物体内特
定基因的表达以来［６］，ＲＮＡ干扰技术已经在基因功
能和细胞研究领域得到了广泛应用。ＲＮＡ干扰具
有高效性的特点，低浓度的 ｄｓＲＮＡ便可以发生明显
的抑制效应，即少量的 ｄｓＲＮＡ分子就可以使大量的
内源性 ｍＲＮＡ降解，达到阻抑靶基因表达的效果。
ＲＮＡ干扰技术已经在秀丽线虫的生长发育、基因功
能鉴定等研究中取得了一定的成果［７－８］。
Ｋｉｋｕｃｈｉ等［９］对松材线虫食道腺分泌的果胶裂
解酶进行了研究，成功克隆出果胶酶基因 Ｂｘｐｅｌ２
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＢ２３２９０８），发现该基因只在线
虫食道腺细胞中表达。果胶是植物细胞壁的主要成
分之一，松材线虫首先需要分泌果胶酶来破坏植物
细胞壁从而成功侵入寄主细胞，因此，松材线虫将果
胶酶分泌到植物的组织内对其取食与迁移有很大帮
助。有研究认为松材线虫的致病力与其繁殖能力密
切相关［１０］。寄主被强致病力松材线虫感染后发病
速度快且死亡率高，其体内松材线虫繁殖也快；被弱
致病力株系感染后发病速度慢，体内松材线虫繁殖
率低。目前，果胶酶基因 Ｂｘｐｅｌ２在松材线虫致病过
程中的功能和作用仍不清楚。构建果胶酶基因 Ｂｘ
ｐｅｌ２ＲＮＡ干扰载体，对进一步研究 Ｂｘｐｅｌ２基因在松
材线虫致病过程中功能具有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
供试松材线虫选用南京林业大学森林保护重点
实验室保存的强毒力虫株 ＡＭＡ３，该虫株于２００４年
１０月从安徽省马鞍山市林场白马山病死松树上分
离得到，将松材线虫接种至灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅ
ｒｅａ）上，置于 ２５℃生化培养箱中培养 ７ｄ，保存于
４℃冰箱备用。
１．２ 松材线虫总ＲＮＡ提取与纯化
松材线虫总ＲＮＡ采用Ｔｒｉｚｏｌ法［１１］进行提取，然
后用ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ试剂盒（ＱＩＡＧＥＮＧｍＢＨ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）对提取的ＲＮＡ进行纯化。
１．３ 松材线虫 ｃＤＮＡ的合成
以提取纯化的总ＲＮＡ为模板，采用Ｔｒａｎｓｇｅｎ公
司（中国）生产的ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ试剂盒合成松材线虫 ｃＤＮＡ，反应体
系为：ＴｏｔａｌｍＲＮＡ５００ｎｇ，ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ（Ｎ９）（０．１
μｇ·μＬ－１）１μＬ，２×ＥＳＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ１０μＬ，Ｅａｓｙ
Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ／ＲＩＥｎｚｙｍｅＭｉｘ１μＬ，添加 ＲＮａｓｅｆｒｅｅ
Ｗａｔｅｒ至１０μＬ，轻轻混匀后置于２５℃孵育１０ｍｉｎ，
４２℃孵育３０ｍｉｎ，８５℃加热５ｍｉｎ后冰上放置。
１．４ Ｂｘｐｅｌ２基因片段的克隆
根据已发表的松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因的序列（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登录号为ＡＢ２３２９０９．１），利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０
软件，设计合成两对带有Ｔ７启动子的特异性引物（引
物有下划线部分为 Ｔ７启动子），Ｂｘｐｅｌ２１上游引物：
５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴ
ＴＧＴＡＧＣ３′；Ｂｘｐｅｌ２１下游引物：５′ＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣ
ＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧ３′；Ｂｘｐｅｌ２２上游引物：５′ＴＴＴＴＧ
ＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＴＡＧＣ３′；Ｂｘｐｅｌ２２下游引物：ＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＴＧ
ＴＡＡＧ。以合成的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ
试剂购自 ＴａＫａＲａ公司（日本），ＰＣＲ反应条件为：
９５℃预变性５ｍｉｎ，９５℃３０ｓ，５４℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，
３５个循环，７２℃ １０ｍｉｎ。
１．５ Ｂｘｐｅｌ２扩增片段切胶回收
按Ａｘｙｇｅｎ公司（美国）提供的 ＡｘｙＰｒｅｐＤＮＡ凝
胶回收试剂盒说明进行切胶回收。
１．６ 感受态细胞制备
挑取５个大肠杆菌单菌落接种于５ｍＬＬＢ液体
培养基，３７℃，２００ｒ·ｍｉｎ－１振荡过夜。将上述菌液
按 １∶５０ １００比例接种到装有１００ｍＬＬＢ培养基
的２５０ｍＬ三角瓶中，３７℃，２００ｒ·ｍｉｎ－１振荡５ ６
ｈ，将菌液置冰上冷却，４℃，５０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ５
ｍｉｎ，回收菌体，加入预冷的 ０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＣａＣｌ２重
悬，４℃，５０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，回收沉淀，向细
胞沉淀中加入冰上预冷的含１５％甘油的ＣａＣｌ２溶液
重悬，分装后置于－８０℃保存备用。
１．７ Ｂｘｐｅｌ２片段与质粒载体连接
Ｂｘｐｅｌ２片段采用Ｐｆｕ高保真酶（购自 ＴａＫａＲａ公
司，日本）进行扩增，扩增产物３’端为平末端，胶回
收ＰＣＲ平末端产物，进行３′末端加 Ａ反应，然后连
接到克隆载体 ｐＭＤ１９Ｔ上，连接产物转化至大肠杆
菌感受态细胞中，涂布在含有Ａｍｐ５０ｍｇ·Ｌ－１的Ｘ
ｇａｌ／ＩＰＴＧ的ＬＢ培养基上，３７℃培养１６ｈ。挑选白色
单菌落进行菌液 ＰＣＲ，扩增产物送华大基因测序公
司进行测序鉴定。
４８２
第２期 邱秀文，等：松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因的克隆及ＲＮＡ干扰载体构建
１．８ ＲＮＡ线性模板扩增
以构建好的质粒载体为模板，通过带有Ｔ７启动
子的引物序列进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系：ＥｘＴａｇ
Ｍｉｘ２５μＬ，引物（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）各 １．０μＬ，模板
ＤＮＡ２．０μＬ，补 ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬ，反应条件为：９５℃
预变性５ｍｉｎ，９５℃ ３０ｓ，５４℃ ３０ｓ，７２℃ ４５ｓ，３５个
循环，７２℃ ７ｍｉｎ。扩增完毕，１％琼脂糖电泳检查。
１．９ 双链ＲＮＡ合成及完整性分析
在体外通过 ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司生产的 ＭＥ
ＧＡｓｃｒｉｐｔＲＮＡｉＫｉｔＰｒｏｔｏｃｏｌ试剂盒合成ｄｓＲＮＡ，使用
分光光度计测定合成的 ｄｓＲＮＡ含量，１％琼脂糖凝
胶电泳检测ｄｓＲＮＡ完整性。
１．１０ 松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因沉默方法构建
将松材线虫用无菌水洗３次，加入０．９％的硫酸
链霉素溶液１０ｍＬ浸泡５ｍｉｎ，２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心３
ｍｉｎ，弃上清，用无菌水洗３次，把表面消毒的松材线
虫离心收集并制备成线虫悬液，吸取２０μＬ（约８００
条）线虫悬液至２０μＬ松材线虫果胶酶基因 Ｂｘｐｅｌ２
的ｄｓＲＮＡ（８００ｎｇ·μＬ－１）溶液中，用移液器轻轻混
匀后置于２０℃摇床中１７５ｒ·ｍｉｎ－１浸泡４８ｈ。为了
评估ｄｓＲＮＡ对松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因的沉默效果，采
用实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）检测松材线虫果胶酶基
因Ｂｘｐｅｌ２的表达量，以Ａｃｔｉｎ基因作为内参照。
２ 结果与分析
２．１ 松材线虫总ＲＮＡ提取
采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂法提取松材线虫 ＡＭＡ３四组样
品的总ＲＮＡ。用紫外分光光度计测定Ａ２６０／Ａ２８０比值
（见表１），纯度均符合要求。总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电
泳后，可见２８Ｓ、１８Ｓ两条明显的主带，说明 ＲＮＡ完
整性良好，无降解（见图１）。
表１ 总ＲＮＡ测定结果
样品名称 浓度／（μｇ·μＬ－１）体积／μＬ总量／μｇ Ａ２６０／Ａ２８０ 结果
１ １．３６ ６０ ８１．６０ １．９３ 合格
２ １．６８ ６０ １００．８０ １．９５ 合格
３ １．３５ ６０ ８１．００ １．８９ 合格
４ １．４５ ６０ ８７．００ １．９１ 合格
２．２ 松材线虫果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因片断克隆
将提取的松材线虫总 ＲＮＡ反转录成 ｃＤＮＡ，以
ｃＤＮＡ为模板对目的片段（长度为７９０ｂｐ）进行 ＰＣＲ
扩增，扩增结果如图２所示，琼脂糖凝胶电泳条带单
一，在７９０ｂｐ处可见特异性片段，对 ＰＣＲ产物进行
切胶回收，４℃保存备用。
２．３ 松材线虫果胶酶基因片段 ｄｓＲＮＡ表达载体的
构建
将克隆的松材线虫果胶酶基因片段连接到ｐＭＤ
图１ 总ｍＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果
图２ 松材线虫果胶酶基因琼脂糖凝胶电泳结果
１９Ｔ载体，转化至大肠杆菌中，在含有氨苄抗生素的
ＬＢ琼脂培养基上培养 １２ｈ，挑选菌落进行菌液
ＰＣＲ。取１０μＬＰＣＲ扩增产物在１．２％ 琼脂糖凝胶
中电泳２５ｍｉｎ（电压 １２０Ｖ），在凝胶成像仪观察结
果，如图３所示，琼脂糖凝胶电泳条带清晰，且大小
与目的条带基本一致，说明松材线虫 Ｂｘｐｅｌ２片段已
成功克隆至ｐＭＤ１９Ｔ载体。
图３ Ｂｘｐｅｌ２基因琼脂糖凝胶电泳结果
５８２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
２．４ 重组质粒测序鉴定
重组质粒测序结果（图４）经 ＮＣＢＩ网站 ＢＬＡＳＴ
分析，原始序列与ＮＣＢＩ网站的已知序列完全一致，
无碱基缺失、突变，表明松材线虫果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因
已成功克隆至ｐＭＤ１９Ｔ载体中，符合预期设计。
图４ 重组质粒测序鉴定结果
６８２
第２期 邱秀文，等：松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因的克隆及ＲＮＡ干扰载体构建
２．５ 松材线虫果胶酶基因模板线性化和ｄｓＲＮＡ的
合成
松材线虫果胶酶基因经过带有 Ｔ７启动子引物
扩增，连接ｐＭＤ１９Ｔ载体，转化到大肠杆菌中。提
取大肠杆菌中带有松材线虫果胶酶基因片段的质
粒，以质粒为模版进行扩增，再以 ＰＣＲ产物（线性
ＤＮＡ，图５）为模板合成 ｄｓＲＮＡ（图６）。经测定，合
成ｄｓＲＮＡ的浓度分别为：Ｂｘｐｅｌ２：１．３１３ｍｇ·ｍＬ－１，
Ｂｘｐｅｌ２′：１．１５２ｍｇ·ｍＬ－１。
图５ 松材线虫果胶酶基因线性ＤＮＡ模板电泳结果
图６ 松材线虫果胶酶基因ｄｓＲＮＡ电泳结果
２．６ 松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因沉默效果分析
为了检测 ｄｓＲＮＡ干扰对松材线虫果胶酶基因
的沉默效果，我们通过实时荧光定量 ＰＣＲ（ＲＴ
ＰＣＲ）测定ｄｓＲＮＡ干扰后松材线虫 Ｂｘｐｅｌ２基因的表
达情况。实验结果如图 ７所示，经过果胶酶基因
ｄｓＲＮＡ干扰后，Ｂｘｐｅｌ２基因表达量与Ａｃｔｉｎ基因表达
量之比为 ０．０６７。实验结果表明：松材线虫经过
ｄｓＲＮＡ干扰后，Ｂｘｐｅｌ２基因表达基本受到抑制。
３ 讨论与结论
Ｆｉｒｅ等［６］在１９９８年发现了 ＲＮＡｉ现象，这种现
图７ ｄｓＲＮＡ干扰后松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因表达量
象广泛存在于生物体内。目前，ＲＮＡｉ的干扰机制已
被初步阐明：生物细胞内的双链 ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄ
ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）被核酸内切酶分割成长度在２１ ２３
ｎｔ之间的小片段ＲＮＡ，这种小片段ＲＮＡ会与细胞内
的多种酶结合形成 ＲＮＡ诱导的沉默复合物 ＲＩＳＣ
（ＲＮＡｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ），ＲＩＳＣ通过与 ｍＲ
ＮＡ的同源区结合，致使 ｍＲＮＡ降解，最终导致相应
基因的沉默，从而抑制基因的表达。
引物设计是本实验成功的关键，引物长度通常
在１５ ３０ｂｐ之间，ＧＣ含量应该低于４０％。由于
引物设计好后添加了Ｔ７启动子，使得引物长度过长
和ＧＣ含量较高，导致合成引物相对困难。另外，引
物自身不能有互补序列，否则容易自身互补配对形
成发夹结构。本研究借助ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件设
计Ｂｘｐｅｌ２特异性扩增引物，从松材线虫转录组中克
隆 Ｂｘｐｅｌ２基因片段，将 Ｂｘｐｅｌ２基因片段连接至
ｐＭＤ１９Ｔ载体，成功构建了松材线虫果胶酶基因
Ｂｘｐｅｌ２的ＲＮＡ干扰载体，并已合成出 ｄｓＲＮＡ，为下
一步利用 ＲＮＡ干扰技术研究 Ｂｘｐｅｌ２基因功能提供
了技术支撑。ＲＮＡｉ经常会引起非靶基因的沉默，这
种现象在早期研究中经常被忽略，然而越来越多的
研究表明，ｓｉＲＮＡ作用过程中存在非特异性，即可以
对靶基因之外的其他基因发挥作用，从而导致非靶
基因沉默，这种现象被称为脱靶效应（Ｏｆｔａｒｇｅｔ
Ｅｆｅｃｔｓ，ＯＴＥｓ）［１２］。在ＲＮＡｉ中，发挥主要作用的是
ｓｉＲＮＡ，Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖ等［１３］研究表明，高浓度的 ｓｉＲＮＡ
会导致更严重的脱靶效应，降低 ｓｉＲＮＡ的剂量可以
减少脱靶效应。Ｃａｆｅｒｅｙ等［１４］发现当细胞给予相对
低剂量的ｓｉＲＮＡ（但仍足以有效沉默目的基因）时，
脱靶效应会降低，甚至消除。因此，在以后的 ＲＮＡｉ
实验中可以通过筛选合适的ｓｉＲＮＡ浓度来降低脱靶
７８２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
效应。
松材线虫致病相关基因大多数在食道腺细胞内
表达，目前已经在其食道腺内发现了多种与致病相
关的酶类，如纤维素酶系、果胶酶等［１５－１６］。Ｍａ
等［１５］对松材线虫纤维素酶基因进行了 ＲＮＡ干扰，
发现该基因沉默后降低了松材线虫的繁殖和迁移能
力。有研究发现，在松材线虫致病过程中，其繁殖和
迁移能力与致病性有重要的联系［１７－１８］。Ｓｈｉｎｙａ
等［１９］研究表明，松材线虫的繁殖能力越强，其毒性
和致病能力也越强。因此，通过 ＲＮＡｉ技术研究果
胶酶基因在松材线虫致病过程中的作用和功能对从
分子水平阐明松材线虫致病机理具有重要意义。目
前，我们已成功建立松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因沉默方法，
松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因沉默效果分析结果表明，松材
线虫Ｂｘｐｅｌ２基因在 ｄｓＲＮＡ干扰后其表达基本受到
抑制（图７）。然而，松材线虫 Ｂｘｐｅｌ２基因沉默后是
否对松材线虫的形态、迁移、繁殖和致病性有影响，
还需要通过进一步的实验验证。
参考文献：
［１］ＺｈｕＬＨ，ＹｅＪＲ，ＮｅｇｉＳ，ｅｔａｌ．ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｓｅｐｔｉｃＢｕｒｓａｐｈｅ
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ｃｉｅｓ，ＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓａｎｄＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ
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ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ ｌｏｃｉ［Ｊ］． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８
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（责任编辑：崔 贝）
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