全 文 ：书犆犺犻基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得
张茹１，２，李金花１，３，柴兆祥３，张俊莲１，２，张金文２，王蒂１，２
（１．甘肃省作物遗传与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学农学院，
甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：为了提高马铃薯对真菌病害的抗性，本试验进行了马铃薯转基因抗病育种的初步研究。通过ＰＣＲ扩增，从
生防木霉菌犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲的ｃＤＮＡ中克隆到一个内切几丁质酶基因犆犺犻，构建了植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ
犆犺犻。通过农杆菌介导的转化方法将犆犺犻基因转化到马铃薯栽培品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”试管薯片中。经侵染
和共培养后，用卡那霉素和羟苄青霉素筛选抗性芽，共获得１８株植株，对所得转化植株进行ＰＣＲ检测，结果１２株
为阳性，占６７％。本试验为利用基因工程技术提高马铃薯的生防能力奠定了基础。
关键词：马铃薯；根癌农杆菌；转基因植物；犆犺犻基因
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５３２．０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０６００５１０８
　 马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是世界上广为种植的粮、菜、饲兼用型作物［１］，也是我国干旱和半干旱地区重要
的经济作物，对病害属敏感型，而植物病害中真菌病害占绝大多数［２］。
甘肃省是中国马铃薯种植面积最大的地区，但病害的发生制约着本省马铃薯产业的深入发展。马铃薯干腐
病（ｐｏｔａｔｏｄｒｙｒｏｔ）是贮藏期发生严重的病害［３，４］，影响产后产量与质量。因此，培育抗病马铃薯新品种十分重要。
然而，起源单一的普通栽培马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物，其遗传背景狭窄、抗性基因缺乏、基因分离复杂、
花粉败育率高、杂交结实较难等，制约着马铃薯抗病新品种的选育［３，５］。因此，利用优质抗性基因进行马铃薯新
品种的培育依然是抗病育种工作的热点。
优质抗性基因是马铃薯基因工程抗病育种十分重要的资源基础。研究表明，利用几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）能够
降解真菌菌丝的细胞壁，破坏病原真菌的结构，从而达到抑菌的目的［６］。其中，生防木霉菌（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｓｐｐ．）
来源的几丁质酶基因（犆犺犻ｇｅｎｅ）与其他来源的同类基因相比较，具有更稳定、活性更高的特点［７，８］。因此，转入从
木霉菌中克隆得到的几丁质酶基因是提高马铃薯抗病性的有效途径之一。
外源基因导入马铃薯的方法有农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿）介导法、基因直接转化原生质体法和基因枪法［５］。农
杆菌介导法以其简便、高效、低拷贝数等特点得到普遍应用，使用的外植体主要有叶片、茎段、块茎、微型薯和试管
薯等，其中试管苗的茎段和叶片以及试管薯具有取材方便、无需灭菌的特点，被广泛使用。特别是试管薯具有周
期短（４～５周）、转化效率高和不定芽直接再生的特点，因而成为马铃薯遗传转化较理想的外植体［５，９］。
本研究从生防木霉菌深绿木霉菌株（犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲）中扩增得到几丁质酶基因，并构建植物表达载体
ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻，通过农杆菌介导法，将犆犺犻基因高频率导入马铃薯，为抗真菌病害马铃薯种质资源的创新和高抗真
菌性病害品种的培育奠定了良好的基础。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
１．１．１　植物材料　马铃薯普通栽培品种“费乌瑞它”（Ｆａｖｏｒｉｔａ）和“夏波蒂”（Ｓｈｅｐｏｄｙ）试管薯，在 ＭＳ基本培养
基（ｐＨ５．８）上培养，每１５ｄ继代繁殖１次。将茎切段转入有滤纸支持物的 ＭＳ液体培养基（ｐＨ５．８）培养２５ｄ，
倒出培养基，加入试管薯诱导培养基，在３０００ｌｘ下连续光照２ｄ后于黑暗中（２２±１）℃诱导试管苗结薯。
第１８卷　第６期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
５１－５８
２００９年１２月
 收稿日期：２００９０５０４；改回日期：２００９０７０９
基金项目：转基因抗逆耐盐及抗病马铃薯新品系培育研究（ＧＮＳＷ２００６０１），马铃薯优质高效配套生产技术研究与示范（２００６ＢＡＤ２１Ｂ０５３）和
马铃薯镰刀菌干腐病原学及抗病种质资源筛选研究（ＧＫＬＡＵ０６０３）项目资助。
作者简介：张茹（１９７８），女，甘肃兰州人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｏｕｒｕｅｒ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．１．２　菌种及载体　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＬＢＡ４４０４（由
甘肃农业大学重点实验室保存），抗性标记为Ｒｉｆｒ 和Ｓｔｒｒ，ｐＭＤＴＭ１８ＴＶｅｃｔｏｒ（购自 ＴａＫａＲａ公司）、表达载体
ｐ３３ＥＣＲ（东北农业大学馈赠），抗性标记为Ｋａｎｒ。
１．１．３　工具酶及主要分子生物学试剂　各种限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；Ｘｇａｌ和ＤＮＡ
回收试剂盒购自北京赛百盛生物技术公司；ＩＰＴＧ购自默克公司；抗生素为Ｓｉｇｍａ产品，其他生化试剂为国产分
析纯。
１．１．４　培养基　马铃薯葡萄糖培养液（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅｂｒｏｔｈ，ＰＤＢ）（２００ｇ马铃薯，１５ｇ葡萄糖，１０００ｍＬ水）；
ＬＢ培养基（１０ｇ胰蛋白胨，５ｇ酵母提取物，１０ｇＮａＣｌ定容至１Ｌ，ｐＨ７．０，固体培养基加１５％琼脂粉）；试管薯
诱导培养基为 ＭＳ＋５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．１５％活性炭＋８０％蔗糖的液体培养基；试管薯片分化培养基为 ＭＳ＋１
ｍｇ／ＬＩＡＡ＋０．２ｍｇ／ＬＧＡ３＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２ｍｇ／ＬＺＴ的固体培养基。
１．１．５　优质生防木霉菌的获得　２００７－２００８年，采集甘肃马铃薯种植地土壤分离筛选生防木霉菌，并通过对引
起马铃薯干腐病病原真菌接骨木镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿）的拮抗试验［１０］，获得对接骨木镰刀菌抗性强的
深绿木霉菌株（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲）。
１．２　方法
１．２．１　生防木霉菌株总ＲＮＡ的提取以及ｃＤＮＡ的合成　利用Ｔｒｉｚｏｌ（天为时代）试剂盒提取ＲＮＡ［所用溶液、
器皿均经焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｌｏｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，ＤＥＰＣ）特殊处理］：将木霉接种于ＰＤＢ中，２８℃，１８０ｒ／ｍｉｎ培养
２４ｈ，过滤干燥后将菌丝放入研钵加液氮研磨成粉末，以５０～１００ｍｇ组织加１ｍＬＴｒｉｚｏｌ研磨；研磨液室温放置
５ｍｉｎ，转入１．５ｍＬ离心管中，加入０．２ｍＬ氯仿，盖紧离心管，用封口膜封口后剧烈振荡离心管１５ｓ，在室温静
止２～３ｍｉｎ；４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液至新离心管中；按１ｍＬＴｒｉｚｏｌ液加入０．５ｍＬ的异丙
醇，涡旋混匀，室温放置１０ｍｉｎ；４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后，离心管边缘和底部形成的沉淀即为制备的
ＲＮＡ；弃上清液，加入１ｍＬ７５％的乙醇，涡旋混匀，４℃，７５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；小心弃去上清液，室温或真空干
燥５～１０ｍｉｎ；溶解ＲＮＡ沉淀，加入５０μＬ无ＲＮａｓｅ的０．１％ＤＥＰＣ水溶液，于５５～６０℃孵育１０ｍｉｎ，置－７０℃
保存。
利用ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒合成ｃＤＮＡ：在冰浴的无ＲＮａｓｅ的离心管中加入如下反应混合物：１～５μｇ总
ＲＮＡ，２μＬｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５或２μＬＲａｎｄｏｍ或２μＬｐｍｏｌｅ基因特异引物，２μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），补ＲＮａｓｅｆｒｅｅ
ｄｄＨ２Ｏ２ 定容至１３．５μＬ；７０℃加热５ｍｉｎ后迅速在冰上冷却２ｍｉｎ；简短离心收集反应液后加入以下各组分：４
μＬ５×ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ，１μＬ０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ，０．５μＬＲＮａｓｉｎ；加１μＬ（２００Ｕ）ＴＩＡＮＳｃｒｉｐｔＭＭＬＶ，轻轻用
移液器混匀。如果用随机引物，将离心管放置２５℃温浴１０ｍｉｎ；４２℃温浴５０ｍｉｎ；９５℃加热５ｍｉｎ终止反应，置
冰上进行后续试验或冷冻保存；用ＲＮａｓｅｆｒｅｅｄｄＨ２Ｏ２ 将反应体系稀释到５０μＬ，取２～５μＬ进行ＰＣＲ扩增反应。
１．２．２　犆犺犻基因的克隆　根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的木霉菌几丁质酶基因序列（ＤＱ４６２４１５．１），设计合成引物对：
ＤＪ１（５′ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣ３′，划线为 犅犪犿 ＨＩ酶切位点），ＤＪ２（５′ＧＣＧ
ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＴＴＡＴＣ３′，划线为犛犪犮Ｉ酶切位点），上海生工合成。
ＰＣＲ反应体系包括１０×Ｔａｑｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的引物１μＬ，模板ＤＮＡ１
μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．２５μＬ，超纯水将反应体系补至２５μＬ。ＰＣＲ反应热循环参数设置为：预变性９４℃４ｍｉｎ；
９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，进行３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。扩增产物在１％琼脂糖凝胶上
进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。
ＰＣＲ产物回收后与ｐＭＤＴＭ１８Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，得到重组子ｐＭＤＴＭ１８Ｔ犆犺犻并送至上海
生工生物工程公司测序。测序后于ＮＣＢＩ中进行序列同源性分析。酶切，连接和重组质粒的转化方法参考《分子
克隆实验指南》［１１］。
１．２．３　植物表达载体的构建　将重组质粒ｐＭＤＴＭ犆犺犻和ｐ３３ＥＣＲ质粒进行酶切，电泳回收犆犺犻基因片段及载
体片段，用Ｔ４ＤＮＡ 连接酶连接，得到ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻（图１），转化大肠杆菌 ＤＨ５α，进行酶切验证。将重组子
ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻质粒通过冻融法转化到农杆菌ＬＢＡ４４０４中，提取质粒再次用引物ＤＪ１和ＤＪ２进行扩增鉴定。
２５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
图１　载体狆３３犈犆犚犆犺犻构建示意图
犉犻犵．１　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狅犳狆３３犈犆犚犆犺犻
１．２．４　转化植株　挑取ＬＢ平板上含质粒ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻的单菌落，接种于３０ｍＬＬＢ培养液（含５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋
５０ｍｇ／ＬＳｔｒ＋２５ｍｇ／ＬＲｉｆ），在２８℃、２４０ｒ／ｍｉｎ摇床上振荡培养至ＯＤ６００值约为０．５，在６０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０
ｍｉｎ，弃上清液，沉淀用同体积 ＭＳ培养液重新悬浮备用。
当试管薯长至直径约为０．８ｃｍ、外表皮光滑有光泽时取下，除去薯皮与芽眼，切成１～２ｍｍ厚的薄片；将薄
片在农杆菌重悬液中浸泡１０ｍｉｎ（期间不断摇动菌液使充分侵染），无菌滤纸吸干后转入试管薯分化培养基，在
２８℃、黑暗条件下共培养２ｄ。
将暗培养２ｄ的薯片转至含４００ｍｇ／ＬＣａｒｂ和５０ｍｇ／ＬＫａｎ的薯片分化培养基上（将薯片嵌入培养基中，减
少假转化体产生），２５℃、２０００ｌｘ连续光照培养（期间每２周换１次新鲜培养基）。当分化的抗性芽长至１．０～
１．５ｃｍ时，切下小芽转至含２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ和５０ｍｇ／ＬＫａｎ的 ＭＳ基本培养基上进行抗性植株生根筛选，以获
得完整植株。
１．２．５　转基因植株ＰＣＲ检测　根据ＣＴＡＢ法提取转基因植株幼嫩组织总ＤＮＡ［１１］。利用引物ＤＪ１和ＤＪ２进行
转基因植株ＰＣＲ检测，以非转基因植株为阴性对照，ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻质粒为阳性对照。ＰＣＲ扩增体系为２５μＬ，扩
增程序为９４℃３ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５０℃１ｍｉｎ，７２℃９０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。取５μＬＰＣＲ产物进行
１％琼脂糖凝胶电泳成像。
２　结果与分析
２．１　犆犺犻ｃＤＮＡ的克隆及序列分析
经过ＲＴ－ＰＣＲ扩增从深绿木霉菌中得到１个约１２７３ｂｐ的特异性片段（图２），经过双酶切（犅犪犿 ＨＩ和
３５第１８卷第６期 草业学报２００９年
犛犪犮Ｉ）验证后（图３）将扩增产物克隆至ｐＭＤＴＭ１８Ｔ上进行序列测定，序列分析（图４）发现其结构与在ＧｅｎＢａｎｋ
上注册号为Ｘ７９３８１．１的哈茨木霉（犜．犺犪狉狕犻犪狀狌犿）（ＩＭＩ２０６０４０）的内切几丁质酶基因同源性达９９％。进而构建
得到植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻。
２．２　植物表达载体的构建
ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ双酶切质粒ｐ３３ＥＣＲ和ｐＭＤ１８Ｔ犆犺犻质粒，回收后，连接，获得重组质粒ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻，酶
切鉴定（图５）。
２．３　ｐ３３ＥＣＲｃｈｉ工程菌的获得
将ｐ３３ＥＣＲ犆犺犻质粒通过冻融法转化感受态根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４菌株，在含利福平（５０μｇ／ｍＬ）、链霉素
（２５μｇ／ｍＬ）和卡那霉素（５０μｇ／ｍＬ）平板上获得白色菌斑，挑菌落，提取质粒，经ＰＣＲ（图６）鉴定，表明ｐ３３ＥＣＲ
犆犺犻植物表达载体已导入农杆菌中。
图２　犆犺犻犵犲狀犲犚犜－犘犆犚扩增结果
犉犻犵．２　犚犜－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犺犻
１，２：ＰＣＲ扩增产物ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲ
Ｍ：ＭａｒｋｅｒλＥｃｏＴ１４Ⅰｄｉｇｅｓｔ
图３　狆犕犇１８犜犆犺犻双酶切（犅犪犿犎犐、犛犪犮犐）结果
犉犻犵．３　犚犲狊狌犾狋狅犳犲狀狕狔犿犲狊犱犻犵犲狊狋犻狅狀
１，２：酶切产物Ｐｒｏｄｕｃｔｂｙｅｎｚｙｍｅｓｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍ１：ＭａｒｋｅｒＶＩ；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒλＥｃｏＴ１４Ⅰｄｉｇｅｓｔ
２．４　转基因植株的获得
薯片经农杆菌侵染和共培养后，分别置含５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋３００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的薯片分化培养基上培养。１０ｄ
后薯征开始膨大并且逐渐变绿，２０ｄ后薯片中央出现绿色凸起，３０ｄ后绿色芽点抽出绿色单芽（图７ａ）或丛生芽
（图７ｂ）。抗性芽经生根诱导培养，５ｄ后切口处生根（图７ｃ）形成完整植株，而未转基因植株、白化苗和芽眼苗
均不能在切口处生根。经芽分化和诱导生根２个阶段筛选，获得１８株抗性植株。
２．５　转基因植株的ＰＣＲ分析
抗性植株ＤＮＡ扩增到１．２ｋｂ的特异性片段，与试验预期片段和阳性对照吻合（图８）。在１８株抗性植株中
有１２株扩增到特异性条带，占６７％。
３　讨论
３．１　几丁质酶基因的克隆
木霉菌（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｓｐｐ．）作为一类重要的植病生防因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ，ＢＣＡｓ），一直受到普
遍关注［１２，１３］。研究表明，真菌寄生（ｍｙｃｏｐａｒａｓｉｔｉｓｍ）是木霉菌主要拮抗机制之一［１３］。木霉菌分泌产生的一系列
细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要的作用，其中以几丁质酶尤为重要。木霉菌
几丁质酶对植物病原真菌的拮抗作用具有以下几下特点［１４～１６］：１）广谱性：对丝核菌（犚犺狀犻狕狅犮狋狅狀犻犪ｓｐｐ．）、镰刀
菌（犉狌狊犪狉犻狌犿ｓｐｐ．）、交链孢菌（犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪ｓｐｐ．）、黑粉菌（犝狊狋犻犾犪犵狅ｓｐｐ．）、黑星菌（犞犲狀狋狌狉犻犪ｓｐｐ．）、腐霉菌
４５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
图４　深绿木霉菌犆犺犻基因的犮犇犖犃核苷酸序列
犉犻犵．４　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲犆犺犻犌犲狀犲犮犇犖犃
本基因在ＧｅｎＢａｎｋ注册号为ＦＪ６０３０６１，表达产物为内切几丁质酶Ｎｏ．ｏｆｔｈｅ犆犺犻ｇｅｎｅｉｎＧｅｎＢａｎｋｉｓ
ＦＪ６０３０６１ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｓｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ
５５第１８卷第６期 草业学报２００９年
图５　载体狆３３犈犆犚犆犺犻酶切（犅犪犿犎犐、犛犪犮犐）鉴定
犉犻犵．５　犚犲狊狌犾狋狅犳犲狀狕狔犿犲狊犱犻犵犲狊狋犻狅狀狋狅狆３３犈犆犚犆犺犻
１～４：酶切产物ＰｒｏｄｕｃｔｏｆＥｎｚｙｍｅｓｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍ１：ＭａｒｋｅｒλＥｃｏＴ１４Ⅰｄｉｇｅｓｔ；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶＩ
图６　农杆菌中犆犺犻犵犲狀犲扩增结果
犉犻犵．６　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犆犺犻犵犲狀犲犻狀犃．狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
１～４：ＰＣＲ扩增产物ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲ
Ｍ：ＭａｒｋｅｒλＥｃｏＴ１４Ⅰｄｉｇｅｓｔ
图７　转基因外植体在犓犪狀选择培养基上芽分化和植株再生
犉犻犵．７　犛犺狅狅狋犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犳狉狅犿狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犲狓狆犾犪狀狋狊狅狀狋犺犲狊犲犾犲犮狋犻狏犲犿犲犱犻狌犿犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵犽犪狀犪犿狔犮犻狀
ａ：试管薯分化单生苗Ｓｉｎｇａｌｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｄｉｓｃｓ；ｂ：试管薯分化丛生苗Ｓｈｏｏｔｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｄｉｓｃｓ；
ｃ：转基因植株在Ｋａｎ培养基上生根：１）非转基因对照植株在含５０ｍｇ／ＬＫａｎ的 ＭＳ培养基上；２）非转基因对照植株在 ＭＳ培养基上；
３～４）转基因植株在含５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的 ＭＳ培养基上ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｔａｔｏｅｓｒｏｏｔｉｎｇｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈＫａｎ：
１）ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｌａｎｔｏｎＭＳｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ５０ｍｇ／ＬＫａｎ；２）ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｌａｎｔｏｎＭＳｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ；
３～４）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｌａｎｔｏｎＭＳ＋５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋２００ｍｇ／Ｌｃａｒｂ
（犘狔狋犺犻狌犿ｓｐｐ．）、疫霉菌（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪ｓｐｐ．）、灰霉菌（犅狅狋狉狔狋犻狊ｓｐｐ．）等植物病原真菌有拮抗作用，能抑制菌丝
生长，抑制孢子萌发及芽管的伸长；２）对真菌细胞壁的降解作用：不仅能降解病原真菌成熟的菌丝顶端，同时也
能降解具有几丁质———葡聚糖复合结构的老熟细胞壁以及菌核；３）协同增效作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）：与其他细胞壁降
解酶、植物病程相关（ＰＲ）蛋白、杀菌剂、其他生防因子具有协同增效作用。木霉菌几丁质酶基因于一个位点上，
单拷贝，克隆的基因能在真菌、酵母、细菌及植物中表达，可用来进行酶的生产或基因调控。几丁质酶基因编码
３２０～６００个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有约２０个氨基酸的ＮＨ２ 末端序列。木霉菌内切几丁质酶基因与酵
母、植物的几丁质酶基因序列是不同的，但与细菌及其他丝状真菌的几丁质酶基因有高度同源性，并且木霉菌来
源的几丁质酶更具稳定性与活性。因此，通过筛选鉴定，发现对病原真菌具有高抗、广谱的优质木霉菌是利用其
几丁质酶基因的资源基础。本研究从深绿木霉菌株中克隆的几丁质酶基因，经过序列分析与在ＧｅｎＢａｎｋ上注册
号为Ｘ７９３８１．１的哈茨木霉（ＩＭＩ２０６０４０）的内切几丁质酶基因同源性达９９％。
６５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
图８　部分转化植株中犘犆犚扩增结果
犉犻犵．８　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犘犆犚犻狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
１：阳性对照ＰｏｓｉｔｉｖｅＣＫ；２：阴性对照ＮｅｇａｔｉｖｅＣＫ；３～１０：转基因植株ＰＣＲ扩增产物 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；Ｍ：ＭａｒｋｅｒＶＩ
３．２　植物表达载体的构建
构建植物表达载体是有一定策略的，构建载体时目的基因与载体的连接可分为同源粘末端的连接、平末端的
连接、定向克隆、接头连接和同聚物加尾连接等［１７］。本研究中，为了消除载体自身连接和片段多拷贝插入，用了
高浓度的Ｔ４ＤＮＡ连接酶，并适当延长连接时间，最后得到植物表达载体的重组质粒及菌株并通过酶切鉴定与
ＰＣＲ鉴定，确定连接正确。用农杆菌介导并由强启动子３５Ｓ控制，已成功地将内切几丁质酶基因犜犺犈狀４２转入
烟草等双子叶植物中［１８］。本研究中所采用的植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ所携带的启动子为ｐ３５Ｓ，该启动子有较普
遍的使用范围，因此对本研究中的植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ携带的３５Ｓ启动子并无改动。
３．３　转基因植株的获得与ＰＣＲ鉴定
采用试管薯薯片作为受体有较高的转化率，说明试管薯是马铃薯遗传转化的理想外植体。在试管薯转化过
程中，采用的抑菌抗生素为羟苄青霉素，其浓度为４００ｍｇ／Ｌ，与本试验同类研究中所用头孢青霉素（２００ｍｇ／Ｌ）
相比［１９］，抑菌效果较差，经常有外植体被大量污染最终导致薯片死亡，但是头孢青霉素却对外植体薯片愈伤组织
的分化有一定的抑制作用。设想经过共培养之后，可以先用头孢青霉素进行抑菌，然后再转移至含有羟苄青霉素
进行诱导分化；或者加大羟苄青霉素的浓度，寻找既可抑菌又可诱导薯片高分化的最适浓度，这对转化体系有更
加完善的作用。
本试验所获得的转基因植株，经过ＰＣＲ检测（图８）结果表明，犆犺犻基因已经初步转入马铃薯植株中，若要从
转基因植株的抗性基因的拷贝、调控表达与功能等方面进行研究，还要做ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ以及
ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ，对转入基因进行全面了解，对其相应的蛋白功能做全面研究。目前，对获得的抗性马铃薯植株的
进一步检测，以及蛋白分析与表达产物的生物活性检测试验仍在进行之中。
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犆犾狅狀犻狀犵狅犳犪犮犺犻狋犻狀犪狊犲犵犲狀犲犪狀犱狋犺犲犪犮狇狌犻狊犻狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆狅狋犪狋狅狆犾犪狀狋狊
ＺＨＡＮＧＲｕ１，２，ＬＩＪｉｎｈｕａ１，３，ＣＨＡＩＺｈａｏｘｉａｎｇ３，ＺＨＡＮＧＪｕｎｌｉａｎ１，２，ＺＨＡＮＧＪｉｎｗｅｎ２，ＷＡＮＧＤｉ１，２
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＣｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，
Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｏｔａｔｏａｇａｉｎｓｔｆｕｎｇａｌｄｉｓｅａｓｅｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄｂｙａｃｑｕｉｒｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｔａｔｏ
ｐｌａｎｔｓｖｉａｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＡｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｖｉａＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｆｒｏｍｃＤＮＡｏｆ犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狋狉狅
狏犻狉犻犱犲．Ｔｈｉｓｇｅｎｅｗａｓｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐ３３ＥＣＲａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓ
ｆｒｏｍｆｌａｓｋｓｏｆｔｗｏｖａｒｉｅｔｉｅｓ（ＦａｖｏｒｉｔａａｎｄＳｈｅｐｏｄｙ）ｏｆｐｏｔａｔｏｖｉａ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，１８ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｃｑｕｉｒｅｄｔｈｒｏｕｇｈＫａｎａｍｙｃｉｎａｎｄＣａｒ
ｂｅｎｉｃｉｌｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔｓ．ＡｆｔｅｒＰＣＲｔｅｓｔｓｆｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，６７％ｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｓ（１２ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）ｗｅｒｅｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓｗｉｌｇｉｖｅｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｈｉｇｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐｏｔａｔｏｖａｒｉｅｔｉｅｓｉｎｆｕｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｏｔａｔｏ；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；犆犺犻ｇｅｎｅ
８５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６