全 文 ：书紫花苜蓿 犠犚犓犢转录因子基因的
克隆与亚细胞定位
陈婷婷１，２，杨青川２，丁旺２，康俊梅２，张铁军２，张新全１
（１．四川农业大学草业科学系，四川 雅安６２５０１４；２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：ＷＲＫＹ转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ结合的方
法获得１个紫花苜蓿 ＷＲＫＹ转录因子家族成员的ｃＤＮＡ序列，命名为犕狊犠犚犓犢５６。该序列长１２６７ｂｐ，包含１个
９５１ｂｐ的最大开放阅读框，编码３１７个氨基酸；构建该基因的瞬时表达载体，通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编
码蛋白进行亚细胞定位研究，结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核，符合转录因子的亚细胞定位特征，为进一步
研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。
关键词：紫花苜蓿；ＷＲＫＹ转录因子基因；瞬时表达载体；亚细胞定位
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１５９０９
　　 植物生长发育受多种生物和非生物因素的影响。在长期自然选择压力下，植物逐渐形成由转录因子调控的
基因网络，进而产生多种生理生化机制来感知和响应各种外界信号［１，２］。在植物体内的转录因子中，ＥＲＦ［３］，ｂＺ
ＩＰ［４］，ＭＹＢ［５］，ＮＡＣ［６］和 ＷＲＫＹ［７］家族由于其重要功能而被广泛研究。ＷＲＫＹ家族最早由Ｉｓｈｉｇｕｒｏ和 Ｎａｋａ
ｍｕｒａ［８］在白薯（犐狆狅犿狅犲犪犫犪狋犪狋犪狊）中发现，随后在野生燕麦（犃狏犲狀犪犳犪狋狌犪）［９］、荷兰芹（犘犲狋狉狅狊犲犾犻狀狌犿犮狉犻狊狆狌犿）［１０］、
拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）［１１］、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）［１２１５］、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［１６，１７］、棉花
（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犪狉犫狅狉犲狌犿）［１８］和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［１９］中相继克隆了该家族的成员。目前，小立碗藓（犘犺狔狊犮狅犿犻
狋狉犲犾犾犪狆犪狋犲狀狊）中发现３７个 ＷＲＫＹ 家族成员，而在大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）中估计有超过２００个该家族成员。
ＷＲＫＹ家族成员都包含 ＷＲＫＹ 构结域和锌指结构，根据 ＷＲＫＹ构结域的个数以及锌指结构的特征可将
ＷＲＫＹ蛋白家族成员分为三类：第Ⅰ类含有２个 ＷＲＫＹ构结域，第Ⅱ和第Ⅲ类含有１个 ＷＲＫＹ构结域，第Ⅰ
类和第Ⅱ类的成员含有Ｃ２Ｈ２（ＣＸ４５ＣＸ２２２３ＨＸＨ）锌指结构，第Ⅲ类的Ｃ２Ｈ２型锌指结构被Ｃ２ＨＣ（ＣＸ７
ＣＸ２３ＨＸＣ）代替［２０，２１］。该家族成员与多种生物和非生物胁迫相关，此外还有研究表明该家族成员与植物衰
老［２２］，物质代谢［２３］，种子休眠［２４］等相关，总之，植物体内多种生理生化反应都有 ＷＲＫＹ蛋白家族成员的参与。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是一种优质的豆科牧草［２５，２６］，近年来在农业种植结构调整过程中发挥越来越重要的
作用。本研究利用表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）电子克隆技术结合反转录－聚合酶链式反应
（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）成功从苜蓿中克隆到１个 ＷＲＫＹ转录因子基因的
ｃＤＮＡ序列，运用生物信息学工具对该序列编码蛋白进行分析；通过构建瞬时表达载体，运用基因枪轰击洋葱
（犃犾犾犻狌犿犮犲狆犪）表皮细胞的方法对该基因编码蛋白进行亚细胞定位，为进一步验证该基因功能奠定了基础。
１　材料与方法
１．１　植物材料
“中苜１号”紫花苜蓿由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草研究室提供。挑选干净饱满的种子接种于
１／２ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ（１／２ＭＳ）培养基，置于培养箱中２８℃培养，２周后取幼苗于液氮中速冻，－８０℃保存备
用。实验于２０１０年７月－２０１１年３月进行。
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１５９－１６７
２０１２年８月
收稿日期：２０１１０６２９；改回日期：２０１１０７１８
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：ＣＡＲＳ３５）资助。
作者简介：陈婷婷（１９８７），女，山东曹县人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｔｉｎｇｔｉｎｇ８７０１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｑ＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．２　菌株、试剂与载体
大肠杆菌感受态菌株ＤＨ５ａ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物公司；克
隆载体ｐＭＤ１９Ｔ和 ＭＭＬＶ反转录酶购自Ｔａｋａｒａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自北京博迈德生物公司；瞬时表达载体
ｐＡ７ＧＦＰ由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草研究室保存及提供；其他常用试剂采用进口分装或国产分
析纯。
１．３　方法
１．３．１　电子克隆　以公布的大豆犠犚犓犢５６基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＥＵ３７５３４８．１）为探针搜索美国国立生物技
术信息中心（ｎａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｅｒｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）的苜蓿属
ＥＳＴ数据库，获得的ＥＳＴ序列使用ＣＡＰ３软件（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｕｎｉｖｌｙｏｎ１．ｆｒ／ｃａｐ３．ｐｈｐ）拼接为重叠群，运用ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）对获得的重叠群进行开放阅读框分析。
１．３．２　ＲＴ－ＰＣＲ扩增　参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书提取苜蓿幼苗的总ＲＮＡ，提取的总ＲＮＡ根据 ＭＭＬＶ反转录
酶说明书反转录获得ｃＤＮＡ第一链。以获得的ｃＤＮＡ第一链为模板，根据电子克隆获得的序列设计正向引物
Ｐ１：５′ＡＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＣ３′和反向引物 Ｐ２：５′ＴＡＴＡＴＡＴＣＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣ
ＣＣ３′进行聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增。反应体系为：Ｈ２Ｏ３４．５μＬ、ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、
ｄＮＴＰ４μＬ、Ｐ１和Ｐ２各２μＬ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ、模板２μＬ；反应程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０
ｓ，５３℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３０个循环后，７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的
条带，回收产物连接克隆载体ｐＭＤ１９Ｔ，连接产物转化大肠杆菌感受态菌株ＤＨ５α，在含有氨苄青霉素的Ｌｕｒｉａ
Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）固体培养基过夜培养后挑取单菌落，菌液ＰＣＲ检测后阳性单菌落送北京华大基因公司测序。
１．３．３　生物信息学分析　目的基因编码蛋白的等电点和分子量预测运用瑞士生物信息学研究所网站的Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｐＩ／Ｍｗ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）进行；疏水性轮廓运用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ软件（ｈｔｔｐ：／／
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）预测；二级结构使用ＰＢＩＬＬＹＯＮＧＥＲＬＡＮＤ数据库在线预测，信号肽使用
ＳｉｇｎａｌＰ３．０软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）预测；亚细胞定位情况使用ＰｒｏｔＣｏｍｐＶｅｒｓｉｏｎ
９．０（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ）软件预测。用目的基因氨基酸序列利用“ＢｌａｓｔＰ”程序进行相似
性比对，下载与之匹配的氨基酸序列，用ＣｌｕｓｔａｌＸ软件进行多重比对，用进化树表示目的基因编码产物与已知同
类蛋白质的序列相似性。
１．３．４　克隆载体ｐＭＤＭｓＷＲＫＹ５６构建　根据获得的ｃＤＮＡ序列设计引物Ｐ３：３′ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＴ
ＴＣＡＴＣＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣ５′（下划线部分为酶切位点犡犺狅Ⅰ）和Ｐ４：３′ＡＣＴＡＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＣＴ
ＴＣＣＴＧ５′（下划线部分为酶切位点犛狆犲Ⅰ），以ｃＤＮＡ第一链为模板，扩增带有酶切位点的犕狊犠犚犓犢５６基因完
整编码区，ＰＣＲ产物连接克隆载体ｐＭＤｌ９Ｔ并转化大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ。菌体ＰＣＲ检测后将含有目的条带
的阳性克隆送北京华大基因公司测序。
１．３．５　表达载体 ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰ构建　限制性内切酶犡犺狅Ⅰ和犛狆犲Ⅰ酶切带有绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的植物表达载体ｐＡ７ＧＦＰ和克隆载体ｐＭＤＭｓＷＲＫＹ５６，目的片段连接到载体上，
构建表达载体 ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰ。
１．３．６　洋葱转化　构建好的表达载体通过基因枪轰击洋葱表皮细胞，以空载体ｐＡ７ＧＦＰ作为对照，通过绿色
荧光蛋白基因在洋葱表皮细胞内的表达情况对目的基因编码蛋白进行亚细胞定位。
２　结果与分析
２．１　犕狊犠犚犓犢５６基因ｃＤＮＡ序列的获得
以大豆犠犚犓犢５６基因为探针搜索苜蓿属ＥＳＴ数据库，由获得的ＥＳＴ序列ＥＳＴ４８８３０７（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：
ＢＧ５８６５３９．１）、ＥＳＴ４８４４５８（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＢＧ５８２７１２．１）、ＥＳＴ４８９８０３（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＢＧ５８８０２８．１）、ＭＴＹ
ＣＤ１３ＴＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＥＶ２５４７６９．１）、ＥＳＴ４３０６８９（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＢＥ９９８９６６．１）、ＮＦ０３７Ｈ１２ＥＣ１Ｆ１１０３
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＢＦ６４５５６９．１）和ＭＥＵＢ９５６ＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＧＥ３５２０１４．１）拼接获得１个长１２６７ｂｐ的重
叠群，根据拼接的序列设计引物进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，获得１条１２００ｂｐ左右的条带（图１），测序后比对发现该
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序列与其他物种的 ＷＲＫＹ家族成员有很高的同源性，
图１　犕狊犠犚犓犢５６基因犚犜－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．１　犚犜－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犕狊犠犚犓犢５６犵犲狀犲
　　　Ａ：犕狊犠犚犓犢５６基因ＲＴ－ＰＣＲ产物 ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犕狊犠犚犓犢５６
ｇｅｎｅ；Ｂ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００．
将此序列命名为 犕狊犠犚犓犢５６（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号：
ＪＮ００８７１０．１），包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框，编
码３１７个氨基酸（图２）。
２．２　犕狊犠犚犓犢５６基因编码蛋白的理化性质分析
生物信息学分析表明犕狊犠犚犓犢５６基因编码蛋白
等电点为８．５３，相对分子量为３５．４ｋＤａ，大部分区域
表现为亲水性（图３）；二级结构预测表明该蛋白含有
大量螺旋和无规卷曲结构（图４）；该蛋白不包含信号
肽，定位于细胞核中。通过系统发育树（图５）分析发
现，该蛋白与来自大豆的 ＷＲＫＹ５６蛋白聚为紧密一
支，说明它们的亲缘关系较近。
２．３　亚细胞定位载体的构建和重组子鉴定
利用犡犺狅Ⅰ和犛狆犲Ⅰ对ｐＭＤＭｓＷＲＫＹ５６载体
和亚细胞定位载体ｐＡ７ＧＦＰ进行双酶切，然后纯化
酶切产物、连接，构建重组表达载体。单克隆经菌落ＰＣＲ检测，可扩增出１条１０００ｂｐ左右插入片段，与目的片
段（９５１ｂｐ）分子量基本相符；通过双酶切鉴定可在１０００ｂｐ左右检测到目的条带（图６），重组质粒经测序表明，
与克隆序列完全一致，开放阅读框正确，表明亚细胞定位载体构建成功。
图２　犕狊犠犚犓犢５６基因序列及推测的氨基酸序列
犉犻犵．２　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱狆狉犲犱犻犮狋犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狋犺犲犕狊犠犚犓犢５６
划线部分为 ＷＲＫＹ结构域 ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｉｓＷＲＫＹｄｏｍａｉｎ．
１６１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图３　犕狊犠犚犓犢５６基因编码蛋白的疏水性结构
犉犻犵．３　犜犺犲犺狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狊犠犚犓犢５６狆狉狅狋犲犻狀
图４　犕狊犠犚犓犢５６基因编码蛋白的二级结构
犉犻犵．４　犜犺犲狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犕狊犠犚犓犢５６狆狉狅狋犲犻狀
蓝色：α螺旋；红色：β折叠；紫色：无规卷曲；绿色：β转角。Ｂｌｕｅ：Ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ；Ｒｅｄ：Ｂｅｔａｆｏｌｄ；Ｐｕｒｐｌｅ：Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ；Ｇｒｅｅｎ：Ｂｅｔａｔｕｒｎ．
２．４　亚细胞定位分析
利用基因枪轰击洋葱表皮细胞后，使用共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞内绿色荧光蛋白基因的表达情况。
结果显示，没有导入目的基因的空载体轰击洋葱表皮细胞后，整个细胞内都有绿色荧光，而轰击表达载体
ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰ的洋葱表皮细胞只在细胞核内有绿色荧光（图７），表明该基因编码蛋白定位于细胞核，与之前
的生物信息学分析结果相符。
２６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图５　犕狊犠犚犓犢５６与其他 犠犚犓犢蛋白的进化树
犉犻犵．５　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犕狊犠犚犓犢５６犪狀犱狅狋犺犲狉犠犚犓犢狊
　犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 紫花苜蓿；犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 大豆；犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 葡萄；犘犲狋狉狅狊犲犾犻狀狌犿犮狉犻狊狆狌犿 欧芹；犔犪狉狉犲犪狋狉犻犱犲狀狋犪狋犪 拉瑞阿；犃狉狋犲犿犻狊犻犪犪狀狀狌犪 黄花
蒿；犅狅犲犪犺狔犵狉狅犿犲狋狉犻犮犪牛耳草；犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊甘蓝型油菜；犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 西红柿；犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊黄瓜；犅狉狌犵狌犻犲狉犪犵狔犿狀狅狉犺犻狕犪木榄；犌狅狊
狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿 陆地棉；犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿 甜椒；犌狅狊狊狔狆犻狌犿犪狉犫狅狉犲狋狌犿 木本棉；犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 小麦；犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲大麦．
３　讨论
图６　表达载体 犕狊犠犚犓犢５６犌犉犘酶切鉴定
犉犻犵．６　犈狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
犕狊犠犚犓犢５６犌犉犘
　　　１：双酶切 ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰＴｗｏｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰ；Ｍ：
分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００．
转录因子在生物体生命周期每一过程中发挥重要
作用，研究转录因子对于揭示生物体生长发育以及对
外界环境响应的基因调控网络具有重要意义。
ＷＲＫＹ家族参与调节植物的多种生物学途径，目前对
该家族的研究主要集中于基因克隆与功能鉴定等初级
阶段，作为一种诱导型转录因子，其作用模型尚不清
楚。Ａｓａｉ等［２７］的研究表明 ＷＲＫＹ转录因子的功能
受丝裂原激活蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉ
ｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）的调节，植物体内的 ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫ激
酶（ＭＡＰＫＫ）和 ＭＡＰＫＫ 激酶 （ＭＡＰＫＫＫ）构成
ＭＡＰ激酶级联，通过一系列的磷酸化反应将外界信
号逐步放大并传递到细胞内，引发各种生理生化反应。
田云等［２８］推测，各种环境诱导因子与细胞膜上的受体
作用，通过某种机制激活体内的 ＭＡＰ激酶级联系统，
ＭＡＰ激酶级联系统通过一系列的磷酸化反应激活
ＷＲＫＹ转录因子的活性，ＷＲＫＹ转录因子通过与 Ｗ
３６１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
ｂｏｘ元件发生特异性结合，调节启动子中含有该元件的
图７　洋葱表皮细胞犌犉犘荧光观察
犉犻犵．７　犉犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀犻狀狋犺犲狅狀犻狅狀狊犽犻狀狊犮犲犾狊
　　　Ａ，Ｂ，Ｃ：ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰ瞬时表达 ＭｓＷＲＫＹ５６ＧＦＰｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄ，Ｅ，Ｆ：空载体瞬时表达 Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｅｍｐｔｙ
ｖｅｃｔｏｒ；Ａ，Ｄ：暗场图像Ｄａｒｋｆｉｅｌｄ；Ｃ，Ｆ：明场图像Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ；Ｂ，Ｅ：荧光
检测Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
相关功能基因或其他调节因子基因的表达，参与植物
各种重要生理应答反应。
基于表达序列标签的电子克隆策略，是近年来发
展起来的一门快速克隆基因的新技术，其技术核心是
利用生物信息学技术组装延伸ＥＳＴｓ序列，获得基因
的部分乃至全长ｃＤＮＡ 序列。从 ＧｅｎＢａｎｋ的核酸
（ｎｒ）数据库中检索已测序列植物的目的基因，获得目
的基因ｃＤＮＡ序列，以该序列为模板对另一种未测序
列植物ＥＳＴ数据库进行ＢＬＡＳＴ检索，获得与之部分
同源的 ＥＳＴ群，从中选取１条 ＥＳＴ作为种子序列
ＢＬＡＳＴ检索该植物的ＥＳＴ数据库，将检出与种子序
列同源性较高或有部分重叠的ＥＳＴ序列拼接组装为
重叠群（ｃｏｎｔｉｇ），再以此重叠群序列重复以上ＢＬＡＳＴ
检索过程，反复进行ＥＳＴ重叠群序列的拼接和比对，
直至检出所有的重叠ＥＳＴ或重叠群不能继续延伸，最终获得未测序列植物基因的ｃＤＮＡ全序列。随着ＥＳＴ数
据库的进一步完善，电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法。与传统的基因克隆方法相比，电子克隆成本
低，速度快，针对性强，广泛应用于重要功能基因筛选。
植物体内 ＷＲＫＹ转录因子参与多种生理生化反应，Ｄｏｎｇ等［２９］发现４９个拟南芥犠犚犓犢 基因受丁香假单孢
菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊狔狉犻狀犵犪犲）和茉莉酸甲酯（ＳＡ）诱导；Ｍａｒｅ等［３０］从大麦中发现一个新的 ＷＲＫＹ转录因子基因
犎狏犠犚犓犢３８，该基因与植物的冷胁迫和干旱胁迫应答相关；仇玉萍等［３１］从低温（４℃）诱导的水稻叶片ｃＤＮＡ文
库中克隆获得１３个犠犚犓犢 基因，其中有１０个犠犚犓犢 基因的表达受到ＮａＣｌ、ＰＥＧ、低温（４℃）和高温（４２℃）等
非生物逆境因子的影响；Ｙｏｄａ等［３２］从烟草中克隆到１个 ＷＲＫＹ转录因子基因，该基因受烟草花叶病毒（Ｔｏｂａｃ
ｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）诱导；Ｘｉｅ等［３３］获得４８个犠犚犓犢 基因全长ｃＤＮＡ序列，其中有４个受ＡＢＡ诱导表达；
Ｌａｇａｃｅ和 Ｍａｔｔｏｎ［３４］，Ｒｏｂａｔｚｅｋ和Ｓｏｍｓｓｉｃｈ［３５］，Ｍｉａｏ等［３６］，Ｌｕｏ等［３７］的研究表明犠犚犓犢 基因与植物的生长发
育相关，Ｐａｒｋ等［３８］发现拟南芥 ＷＲＫＹ７转录因子具有一个钙调蛋白结合域（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，
ＣａＭＢＤ），且能与钙调蛋白（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）结合，表明 ＷＲＫＹ转录因子在ＣａＭ介导的Ｃａ２＋信号转导过程中
具有一定的作用。本研究利用电子克隆与实验克隆相结合的方法，获得１个紫花苜蓿犠犚犓犢 基因家族成员的
ｃＤＮＡ序列，通过蛋白比对发现该基因编码蛋白与大豆犠犚犓犢５６基因编码蛋白高度同源。Ｚｈｏｕ等［３９］的研究表
明，大豆犠犚犓犢５６基因在盐胁迫，干旱胁迫和寒冷胁迫处理后表达量没有明显变化，该基因可能不受非生物胁
迫的诱导，其具体功能还有待进一步研究。
目前已有一些方法评价蛋白在生物体内的物理和化学状态，但是研究蛋白在细胞内的生物活性，需要在活性
细胞内检测到这些蛋白，所以研究蛋白在细胞内的定位情况具有重要意义。研究蛋白亚细胞定位的方法主要有：
融合报告基因定位法、免疫组织化学定位法、蛋白质组学定位技术以及共分离标记酶辅助定位法，其中融合报告
基因定位法主要使用的报告基因有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）和β葡糖酸苷酶（ＧＵＳ）。通过构建目的基因与绿色荧
光蛋白的融合表达载体对编码蛋白进行亚细胞定位研究，容易操作，实验周期相对较短，灵敏度高，可以适应于活
体实时定位和动态研究，此方法目前被广泛应用［４０］。本研究构建该基因的瞬时表达载体，通过基因枪轰击洋葱
表皮细胞的方法发现该基因编码蛋白定位于细胞核中，这与转录因子的特征相符，为进一步研究 ＷＲＫＹ转录因
子的作用模式奠定了基础。
４　结论
本研究采用电子克隆和实验克隆结合的方法获得１个紫花苜蓿 ＷＲＫＹ转录因子家族成员的ｃＤＮＡ序列，
该序列长１２６７ｂｐ，包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框，编码３１７个氨基酸；生物信息学分析结果表明，该基因编
４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
码蛋白等电点为８．５３，相对分子量为３５．４ｋＤａ，大部分区域表现为亲水性，包含大量螺旋和折叠结构，不包含信
号肽，定位于细胞核中；通过构建该基因的瞬时表达载体，运用基因枪轰击洋葱表皮细胞的方法对该基因编码蛋
白的亚细胞定位情况进行分析，该基因编码蛋白定位于细胞核中，与生物信息学分析相符，表明生物信息学分析
软件预测的结果具有一定的可靠性。
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ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）ｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ａｒｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｓｅｅｄｓｉｚｅｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ
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犌犿犠犚犓犢５４，ｃｏｎｆｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒ
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［４０］　邢浩然，刘丽娟，刘国振．植物蛋白质的亚细胞定位研究进展［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（增刊）：１６．
６６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊狌犫犮犲犾狌犾犪狉犾狅犮犪犾犻狕犪狋犻狅狀狅犳犪犠犚犓犢狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉犵犲狀犲狅犳犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ＣＨＥＮＴｉｎｇｔｉｎｇ１，２，ＹＡＮＧＱｉｎｇｃｈｕａｎ２，ＤＩＮＧＷａｎｇ２，ＫＡＮＧＪｕｎｍｅｉ２，
ＺＨＡＮＧＴｉｅｊｕｎ２，ＺＨＡＮＧＸｉｎｑｕａｎ１
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＡｃＤＮＡｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｏｆ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｃｌｏｎｉｎｇａｎｄＲＴ－ＰＣＲ
（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ），ａｎｄｗａｓｎａｍｅｄ犕狊犠犚犓犢５６．ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ１２６７
ｂｐａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄａｍａｘｉｍｕｍｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ９５１ｂｐｃｏｄｉｎｇｆｏｒ３１７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｏｎｓｔｒｕｃｔｗｉｔｈｔｈｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅ 犕狊犠犚犓犢５６ｇｅｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ
ＭｓＷＲＫＹ５６ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｗａｓｔｈｕｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｅｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｓｕｂｃｅｌｕ
ｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｍｓａｂａｓｉｓｔｏｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅ；ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉ
ｚａｔｉｏｎ
７６１第２１卷第４期 草业学报２０１２年