全 文 ：书响应面法优化秃疮花中生物碱提取
工艺及抑菌活性研究
赵强１，余四九１，王廷璞２，袁毅君２
（１．甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州７３００７０；２．天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水７４１００１）
摘要：以秃疮花为研究对象，在单因素水平测定的基础上，通过响应面法优化其提取工艺，并使用响应面法提取浓
缩液进行抑菌活性测定，以大肠埃希氏杆菌为研究对象，进行透射电镜观察。结果显示，秃疮花生物碱最佳提取工
艺条件为：液料比１５ｍＬ／ｇ、超声时间３５ｍｉｎ、回流时间２．５ｈ、乙醇浓度６５％，在此工艺下秃疮花生物碱含量为
９．３３％；其响应面法提取浓缩液对大肠埃希氏杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的最小抑菌浓度分别为０．２０，０．１５和
０．３５ｍｇ／ｍＬ，最低杀菌浓度分别为０．１５，０．１０和０．３０ｍｇ／ｍＬ；在透射电镜下观察到对大肠埃希氏杆菌抑制效果
显著。表明响应面法对秃疮花生物碱提取工艺的优化比较合理。
关键词：响应面法；秃疮花；生物碱；抑菌
中图分类号：Ｑ９４６．８８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０２０６０９
秃疮花（犇犻犮狉犪狀狅狊狋犻犵犿犪犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿）又名红茂草、秃子花、勒马回，为罂粟科秃疮花属草本植物。生于海拔
１３００ｍ以上的高原、山坡、丘陵、路旁等处。在甘肃省陇南、天水、平凉等地的渭水流域、秦岭南北均有广泛的分
布。该植株味苦、涩，性凉，可入药，有抗炎、抑菌、消肿止痛、清热解毒等功效［１］。研究表明，由于秃疮花含有多种
异喹啉类生物碱，所以其表现出具有多种生物学活性［２］。将该生物碱临床用于结核病和窦道溃疡症，其总有效率
可达９０％以上，还具有提高心肌细胞功能、提高机体免疫力、保护受损肝细胞、抗溶血等药理学活性，且安全无毒
副作用［３６］。
近年来，学者对秃疮花的研究日渐深入。陈荃等［７］采取石蜡切片法和光学显微镜技术，对秃疮花营养器官进
行显微结构观察，进一步了解了其微观结构特点，为该植物的人工驯化和科学栽培提供了基础依据；赵强等［８］、王
廷璞等［９］先后利用指纹识别和波层色谱检测技术，发现秃疮花中含有５种主要生物碱成分，其中异紫堇碱含量较
高；董晓宁等［１０］、赵强等［８］将秃疮花经石英色谱柱层析的提取物，作用于大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌，发
现其具有一定的抑菌效果，其对超氧自由基和羟基自由基也有一定的清除作用；刘大护等［１１］利用普通硅胶柱色
谱对秃疮花的生物碱类化学成分进行提取、分离和纯化，并利用超导核磁共振等现代光谱和波谱技术鉴定化合物
的结构，从秃疮花中发现１１个异喹啉类生物碱，其中２个萘菲啶类、１个吗啡烷类、４个阿扑菲类和４个普罗托品
类生物碱化合物；巩江等［１２］对珍稀中药秃疮花进行了药学研究，发现秃疮花的生物碱在抗菌、抗肿瘤、肝保护等
方面有很强的药学活性，其具有很好的经济价值和市场开发前景；赵强等［１３］采用酸性染料比色法，以异紫堇碱标
准品为对照，对秃疮花中总生物碱含量进行了测定，从而建立了秃疮花中总生物碱含量的检测方法，为该药材的
质量控制和评价提供了科学依据；李岩等［１４］利用国际通用ＤＮＡ条形码技术，对新疆伊犁地区秃疮花基因条形码
及系统发生关系进行了初步研究，测序获得的ｒｂｃＬ和 ｍａｔＫ基因序列长度分别为５３９和７００ｂｐ，用最大简约法
构建了基于ｒｂｃＬ和ｍａｔＫ序列的系统树，发现伊犁秃疮花聚在罂粟亚科中，与荷青花属（犎狔犾狅犿犲犮狅狀）、金罂粟属
（犛狋狔犾狅狆犺狅狉狌犿）、海罂粟属（犌犾犪狌犮犻狌犿）亲缘关系较近；朱荣［１５］对秃疮花在Ｚｎ、Ｃｄ、Ｃｕ和Ｐｂ胁迫下的耐性和富集
特征做了研究，发现其对Ｃｄ和Ｚｎ具有较强的耐性和富集能力，对Ｃｕ和Ｐｂ具有较弱的耐性和富集能力。
２０６－２１４
２０１２年８月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１１１１２４；改回日期：２０１２０１１８
基金项目：２０１０年人社部出国留学人员基金项目“红茂草生物碱临床抗炎机制与毒理研究”和甘肃省中医药管理局基金项目（ＧＺＫ２０１０２０）资
助。
作者简介：赵强（１９８２），男，甘肃天水人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｑ２０００＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｔｐ００２＠１６３．ｃｏｍ
本试验于２０１１年５月开始，采用秃疮花中的主要生物碱异紫堇碱做为评价指标，通过６组单因素试验筛选
出主要影响因素，再进行响应面法试验设计，从而优选建立了秃疮花生物碱最佳提取工艺条件，并将其提取浓缩
液作用于３种常见供试菌，研究其体外抑菌活性能力大小，为该植物资源的深层次开发和利用提供一定的试验依
据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 主要仪器 ＲＥ５２９９型旋转蒸发仪（亚荣生化仪器厂）、ＵＶ７５１ＧＤ型紫外－可见光分光光度计（瑞利仪
器分析有限公司产品）、ＫＱ５００Ｄ型数控超声波清洗器（瑞利仪器分析有限公司产品）、ＪＥＭ１２３０型透射电子显
微镜（瑞利仪器分析有限公司产品）、ＡＢ１０４Ｓ电子分析天平、索氏提取器等。
１．１．２ 药物及试剂 秃疮花于２０１１年４月采自天水师范学院植物园，由王廷璞研究员鉴定。经自然风干、粉
碎，过８０目筛（０．１７８ｍｍ）。异紫堇碱标准品（美国Ｓｉｇｍａ化学公司）、磷酸（天津市凯通化学试剂有限公司）、
９５％乙醇（开封化学试剂总厂）、戊二醛（金山化工厂）等。
１．１．３ 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ＝７．４。牛肉
膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，琼脂２０ｇ，ｐＨ＝７．４。
１．１．４ 试验菌种 大肠埃希氏杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻，ＡＴＣＣ１２４５３）、白色念珠菌（犆犪狀犱犻犱犪犪犾犫犻犮犪狀狊，ＡＴＣＣ
１０２３１）、绿脓杆菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪，ＡＴＣＣ２７８５３）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 秃疮花生物碱定性预试验 称取秃疮花干草粉末１０．０ｇ，装入索氏提取器中，水浴加热回流３ｈ，转入旋
转蒸发仪中，减压蒸至无醇味，趁热加入少许活性炭，封口、静置、过夜。分别进行碘化铋钾、硅钨酸、苦味酸试验，
均呈明显的阳性反应，表明样品中含有生物碱成分。
１．２．２ 标准工作曲线的绘制 准确配制０．５ｍｇ／ｍＬ异紫堇碱标准品溶液１００ｍＬ，依次量取１，２，３，４，５，６，７，
８，９，１０，１１ｍＬ，分别置于１００ｍＬ容量瓶中，加无离子水稀释至１００ｍＬ，摇匀，使之为５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，
４０，４５，５０，５５μｇ／ｍＬ的梯度溶液，以三重蒸馏水为空白，选取ＯＤ２１０值进行测定。以浓度Ｃ（μｇ／ｍＬ）为横坐标，
吸光值Ａ为纵坐标，绘制标准曲线。
１．２．３ 秃疮花生物碱的提取工艺 称取秃疮花干草粉末７份，每份１０．０ｇ。固定液料比１４ｍＬ／ｇ、浸泡时间
１８ｈ、回流时间２．５ｈ、超声时间２５ｍｉｎ、浸提液ｐＨ＝５，考察乙醇浓度为６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，
９０％时对提取效果的影响。然后将优选的最佳乙醇浓度做为固定数值，依次选取考察液料比为１２∶１，１３∶１，
１４∶１，１５∶１，１６∶１ｍＬ／ｇ，乙醇浸泡时间为０，６，１２，１８，２４，３０ｈ，索氏提取器中回流时间为１．５，２．０，２．５，３．０，
３．５ｈ，超声波振荡时间为１５，２０，２５，３０，３５ｍｉｎ，乙醇浸提液ｐＨ值为２，３，４，５，６，７，８时对提取效果的影响。将
每次优选后的最佳条件固定，再逐次筛选其余最佳条件。根据单因素水平试验结果，进行极差分析，最终优选出
４个主要影响因素，按照响应面试验设计方案进行生物碱提取。再将提取液转入旋转蒸发仪，３５℃下减压蒸至无
醇味，转入１００ｍＬ锥形瓶，封口静置。
１．２．４ 秃疮花生物碱含量的测定 将２５个５０ｍＬ容量瓶中的提取液稀释后测定其吸光值，对照标准曲线，得
出提取液中生物碱的浓度，最后计算出秃疮花中生物碱提取得率。
秃疮花样品中生物碱提取得率（％）＝
提取液总体积（ｍＬ）×生物碱浓度（ｍｇ／ｍＬ）×１００
１０００×样品质量（ｇ）
１．２．５ 响应面法对秃疮花中生物碱提取条件的优化 在单因素试验的基础上，使用ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ中心设计，通
过响应面法进行秃疮花中生物碱提取条件的优化。
１．２．６ 体外抑菌 １）菌液制备：将所选供试菌事先接种于无菌平板上，３７℃培养１ｄ后，选取典型菌落，转移接
种在液体培养基中，经３７℃培养１ｄ后，再用无菌生理盐水稀释，使其为菌量１０６～１０７ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液，备用。
２）培养基的配制：按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ放入烧杯中，加入蒸馏水
１０００ｍＬ，调ｐＨ＝７．４，即得牛肉膏蛋白胨液体培养基１０００ｍＬ，同法另加琼脂２０ｇ，即为牛肉膏蛋白胨琼脂培
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养基１０００ｍＬ。将配制好的培养基及若干包装好的试管、烧杯、涂布棒、移液管及若干培养皿于高压灭菌锅中，
１２０℃下湿热灭菌３０ｍｉｎ，置于３７℃培养箱中备用。
３）最小抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定：将秃疮花提取浓缩液用无菌蒸馏水倍比稀释，制备所需系列浓度的
稀释液。然后将稀释液分别定量转移至无菌培养皿中，与定量倒入的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基充分混匀，室温冷
却、凝固，制成含药液的平板［１６１９］。再按培养皿所需的剂量，分别移取定量被试菌液，涂于平板上，置于恒温箱中
３７℃培养１～２ｄ，检查菌落生长情况，以平板菌落计数法计算菌落数，另取各含药液１∶５浓度无菌阴性和无药阳
性作为对照。以肉眼计数，完全没有菌落生长时的最低生物碱浓度，为该药物的最小抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）［１６１９］。取上述 ＭＩＣ及以上各浓度未见细菌生长的各试管培养物，分别移取０．１ｍＬ接种
至不含生物碱的培养基上，涂匀平板，置于恒温箱３７℃培养１ｄ，查看有无菌落生长，计数少于５个菌落者，为该
药物的最低杀菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＢＣ）。以上试验均重复３次。
４）透射电子显微镜观察：选取典型供试菌（大肠埃希氏杆菌）作为研究对象，将其接种在已制得的牛肉膏蛋白
胨琼脂培养基上，恒温箱３７℃培养１ｄ后，用ｐＨ＝６．０的５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液洗脱细菌，使其含量保持在１０８
ＣＦＵ／ｍＬ左右。移取５００μＬ菌悬液，加到浓度为０．２％的秃疮花提取浓缩液中（溶于１％ 醋酸），使秃疮花提取
浓缩液最终浓度稀释为０．１％。将其置于１．５ｍＬ离心管中，３７℃摇床（１２０ｒ／ｍｉｎ）培养１ｄ，离心后取出细菌沉
渣。将离心后的细菌团，加３％戊二醛，在４℃时固定５ｈ，用５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液漂洗３次，每次１０ｍｉｎ，再用
１％的ＯｓＯ４４℃后固定１ｈ，最后用５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液漂洗３次。使用４０％，６０％，８０％，１００％乙醇，４℃下脱
水１０ｍｉｎ，再用纯丙酮脱水２次，每次１０ｍｉｎ。加入环氧树脂Ｅｐｏｎ８１２（１∶１）与纯丙酮，室温静置３ｈ，用环氧树
脂Ｅｐｏｎ８１２包埋后，分别在３０，４０，６０℃下，聚合４，１２，２４ｈ，制成超薄切片，使用枸椽酸铅和醋酸双氧铀双染色，
在ＪＥＭ１２３０型透射电镜下观察其抑菌效果。
２ 结果与分析
图１ 异紫堇碱标准曲线
犉犻犵．１ 犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲狅犳犻狊狅犮狅狉狔犱犻狀犲
２．１ 秃疮花生物碱含量的测定
根据异紫堇碱标准品系列浓度梯度在ＯＤ２１０的吸
光值，得回归方程：狔＝０．０１１０狓＋０．０６５２，犚２＝
０．９９８９（狀＝１１），其标准曲线见图１所示，在５～５５
μｇ／ｍＬ内呈良好的线性关系。
２．２ 秃疮花生物碱单因素提取试验
２．２．１ 乙醇浓度对提取效果的影响 随着乙醇浓度
的变化，在６５％时生物碱含量最大；随着乙醇浓度的
增大，生物碱含量依次呈明显下降趋势，此时乙醇浓度
对提取效果的影响变得不显著（图２）。主要是因为乙
醇浓度较大时，会将样品中的油脂和糖类等物质提取
出来，不利于生物碱的提取；乙醇浓度较小时，生物碱
在其中的溶解度也较小。故选取适宜生物碱提取的乙
醇浓度为６５％。
２．２．２ 液料比对提取效果的影响 随着液料比的增加，生物碱的含量也随之增大；当液料比为１５∶１时生物碱
含量达到最大值（图３），其后开始呈下降趋势，主要是因为在一定范围内溶剂用量的增加，有助于生物碱的浸出。
故选取适宜生物碱提取的液料比为１５∶１。
２．２．３ 浸泡时间对提取效果的影响 ６５％乙醇浸泡时间在６～１０ｈ时，生物碱含量达到最大峰值（图４）；当浸泡
时间超过１２ｈ后，随着浸泡时间的延长，生物碱含量迅速降低。浸泡时间过长，会使其他化合物溶出，不利于生
物碱的提取，长时间浸泡也使得提取周期变长，不利于提取工艺模式的建立。故选取适宜生物碱提取的浸泡时间
为８ｈ。
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图２ 乙醇浓度对提取效果的影响
犉犻犵．２ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犲狋犺犪狀狅犾犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
图３ 液料比对提取效果的影响
犉犻犵．３ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犾犻狇狌犻犱狋狅狊狅犾犻犱狉犪狋犻狅狅狀
狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
２．２．４ 回流时间对提取效果的影响 当在索氏提取器中回流时间为２．５ｈ时，生物碱含量呈明显单一峰值（图
５），此时再进行提取，会发现索氏提取器中的溶液颜色逐渐变浅，说明被提取物已经大部分被提取。故选取适宜
生物碱提取的回流时间为２．５ｈ。
２．２．５ 超声时间对提取效果的影响 超声波振荡时间在１５～３０ｍｉｎ时，生物碱含量随时间的增加而增大，并达
到最大峰值（图６）；当时间超过３０ｍｉｎ后，生物碱含量随时间增加而减小。使用超声波可以破碎细胞，加快细胞
内物质的溶解，但是超声作用时间过长，又可以使部分生物碱分解。故选取适宜生物碱提取的超声时间为
３０ｍｉｎ。
２．２．６ 浸提液ｐＨ值对提取效果的影响 乙醇浸提液ｐＨ值在３～６时，生物碱含量随ｐＨ值的增加而增大，并
达到最大峰值（图７）；当ｐＨ值超过６以后，生物碱含量随ｐＨ值增加而减小。这是因为秃疮花生物碱本身碱性
较弱，在弱酸性介质中反应变为盐类，能使之较好的溶解。故选取适宜生物碱提取的浸提液ｐＨ＝６。
２．３ 响应面法优化秃疮花中生物碱的提取条件
２．３．１ 响应面试验因素水平的选择 采用极差分析对６组单因素水平进行筛选，最终选用液料比、超声时间、回
流时间和乙醇浓度为主要考察因素，进行响应面试验，使用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０软件，以秃疮花主要生物碱（异紫
堇碱）含量为指标，设计４因素３水平（共２９个试验点，５个中心点）的响应面试验，每组试验重复３次，取其平均
值，其因素水平如表１所示［２０，２１］。
图４ 浸泡时间对提取效果的影响
犉犻犵．４ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犿犪犮犲狉犪狋犻狀犵狋犻犿犲狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
图５ 回流作用时间对提取效果的影响
犉犻犵．５ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狉犲犳犾狌狓狋犻犿犲狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
９０２第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图６ 超声时间对提取效果的影响
犉犻犵．６ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狌犾狋狉犪狊狅狀犻犮狋犻犿犲狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
图７ 浸提液狆犎值对提取效果的影响
犉犻犵．７ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狆犎狅犳犲狓狋狉犪犮狋狊狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋
２．３．２ 响应面试验方案设计及结果分析 以Ａ（液料
比）、Ｂ（超声时间）、Ｃ（回流时间）、Ｄ（乙醇浓度）为自变
量，秃疮花生物碱含量为响应值（Ｙ），进行响应面分析
试验，共有２９个试验，其中２４个为析因试验，５个为
中心试验，用以估计误差。２９组响应面试验结果，见
表２所示。对４个自变量模型，单独存在及交互作用
下的方差分析结果，见表３所示。
通过对试验结果进行响应面软件分析，经二次回
归拟合后，得到４个因素与秃疮花生物碱含量之间的
模拟方程为：
表１ 响应面试验因素水平
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳犾犲狏犲犾狅犳犳犪犮狋狅狉
水平
Ｌｅｖｅｌ
Ａ液料比
Ｌｉｑｕｉｄｔｏ
ｓｏｌｉｄｒａｔｉｏ
（ｍＬ／ｇ）
Ｂ超声时间
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ｔｉｍｅ
（ｍｉｎ）
Ｃ回流时间
Ｒｅｆｌｕｘ
ｔｉｍｅ
（ｈ）
Ｄ乙醇浓度
Ｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（％）
－１ １４ ２０ ２．０ ６０
０ １５ ３０ ２．５ ６５
１ １６ ４０ ３．０ ７０
犢＝１１．３３８０＋０．２０６６犃＋０．７６３３犅＋０．０１３１犆＋０．６７４２犇＋０．１７７６犃犅－０．００９５犃犆－０．０１７０犃犇＋
０．７２０７犅犆＋０．２４３９犅犇＋０．０５７１犆犇－１．００７６犃２－１．２３６０犅２－０．５１１８犆２－１．３４３４犇２。
该回归模型犉检验为极显著（犘＜０．０１），其失拟项在α＝０．０５水平上为极显著（犘＜０．０１），纯误差项不显
著，其决定系数狉２＝０．８７４３，说明该拟合方程与实际情况相符，且误差较小，能充分反映出各因素与响应值之间
的关系，其影响不是呈简单的线性关系。通过该方程发现，各种因素之间存在着一定的交互作用，其中Ｂ、Ｄ、ＢＣ、
Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２ 均呈极显著影响（犘＜０．０１），Ａ呈显著影响（犘＜０．０５），Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＤ、ＣＤ均呈不显著。
从单因素水平观察，可以得出其影响顺序为：Ｂ（超声时间）＞Ｄ（乙醇浓度）＞Ａ（液料比）＞Ｃ（回流时间）。在
有交互作用存在下，对秃疮花生物碱含量的影响顺序为：ＢＣ＞ＢＤ＞ＡＢ＞ＣＤ＞ＡＤ＞ＡＣ。
２．３．３ 响应面分析 从各因素之间两两相互作用的响应面图形观察，发现其中曲线走势越陡，其影响越显著（图
８）；曲线走势越平滑，其影响越小。超声时间、乙醇浓度和液料比的图形曲线走势较陡，说明其影响最为显著。由
ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０软件进行系统分析，得出影响秃疮花中生物碱含量的最佳提取工艺条件为：液料比１５．１４
ｍＬ／ｇ、超声时间３４．４９ｍｉｎ、回流时间２．６７ｈ、乙醇浓度６６．４９％、生物碱含量为１１．６２％，结合实际操作过程中
的局限性，最终确定修正后的工艺条件为：液料比１５ｍＬ／ｇ、超声时间３５ｍｉｎ、回流时间２．５ｈ、乙醇浓度６５％，在
此工艺下秃疮花生物碱含量为９．３３％。按照优化条件进行平行３组提取试验，取平均值为９．０６％，与理论值相
差０．２２％，说明采用响应面法优化的提取条件可靠。
２．４ 抑菌试验
按照响应面法优选的最佳组合提取秃疮花生物碱，并减压浓缩至无醇味，用无菌蒸馏水将浓缩液稀释为
０．０５，０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０，０．３５，０．４０ｍｇ／ｍＬ８组浓度梯度，另作阳性和阴性对照进行测定，结果表明
（表４），秃疮花提取浓缩液对大肠埃希氏杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌３种供试菌的最小抑菌浓度分别为０．２０，
０．１５和０．３５ｍｇ／ｍＬ，最低杀菌浓度分别为０．１５，０．１０和０．３０ｍｇ／ｍＬ。
０１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
表２ 响应面试验结果
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋狉犲狊狌犾狋狅犳狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲
编号
Ｎｏ．
Ａ液料比
Ｌｉｑｕｉｄｔｏ
ｓｏｌｉｄｒａｔｉｏ
（ｍＬ／ｇ）
Ｂ超声时间
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ｔｉｍｅ
（ｍｉｎ）
Ｃ回流时间
Ｒｅｆｌｕｘ
ｔｉｍｅ
（ｈ）
Ｄ乙醇浓度
Ｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（％）
Ｙ生物碱含量
Ａｌｋａｌｏｉｄｏｆ
ｃｏｎｔｅｎｔ
（％）
编号
Ｎｏ．
Ａ液料比
Ｌｉｑｕｉｄｔｏ
ｓｏｌｉｄｒａｔｉｏ
（ｍＬ／ｇ）
Ｂ超声时间
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ｔｉｍｅ
（ｍｉｎ）
Ｃ回流时间
Ｒｅｆｌｕｘ
ｔｉｍｅ
（ｈ）
Ｄ乙醇浓度
Ｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（％）
Ｙ生物碱含量
Ａｌｋａｌｏｉｄｏｆ
ｃｏｎｔｅｎｔ
（％）
１ １４ ３０ ３．０ ６５ ９．７８５８ １６ １５ ３０ ２．５ ６５ １１．３５４０
２ １４ ３０ ２．５ ６０ ８．０９８２ １７ １６ ３０ ２．０ ６５ ９．８６２３
３ １４ ４０ ２．５ ６５ ９．３４０９ １８ １６ ３０ ２．５ ７０ １０．００８０
４ １５ ３０ ２．０ ６０ ８．２８３５ １９ １５ ３０ ２．５ ６５ １１．２２７０
５ １６ ３０ ２．５ ６０ ８．７８５８ ２０ １６ ２０ ２．５ ６５ ８．３３５０
６ １５ ２０ ２．５ ６０ ７．８４２７ ２１ １５ ４０ ３．０ ６５ １１．０２７０
７ １５ ３０ ３．０ ７０ １０．６３８０ ２２ １５ ３０ ２．５ ６５ １１．３３１０
８ １５ ２０ ２．５ ７０ ８．１８２５ ２３ １６ ４０ ２．５ ６５ １０．２９３０
９ １５ ３０ ２．５ ６５ １１．３５３０ ２４ １４ ３０ ２．０ ６５ ９．８５４６
１０ １５ ３０ ２．０ ７０ １０．１３１０ ２５ １５ ２０ ３．０ ６５ ８．０９２８
１１ １６ ３０ ３．０ ６５ ９．７５５７ ２６ １５ ４０ ２．０ ６５ ９．８１２６
１２ １５ ４０ ２．５ ７０ １０．１５４０ ２７ １５ ３０ ３．０ ６０ ８．５６２３
１３ １５ ２０ ２．０ ６５ ９．７６０９ ２８ １５ ４０ ２．５ ６０ ８．８３８９
１４ １４ ３０ ２．５ ７０ ９．３８８２ ２９ １５ ３０ ２．５ ６５ １１．４２５０
１５ １４ ２０ ２．５ ６５ ８．０９３０
注：表中数据为３次重复试验的平均值。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄａｔａｉｎｔａｂｌｅｉｓｔｈｅｍｅａｎｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｅａｔｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
表３ 响应面试验方差分析
犜犪犫犾犲３ 犜犺犲狏犪狉犻犪狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲
方差来源Ｅｒｒｏｒｓｏｕｒｃｅ 平方和ＳＳ 自由度ＤＦ 均方 ＭＳ 犉值犉ｖａｌｕｅ 犘值犘ｖａｌｕｅ 显著性Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ａ ０．５１２１６１４０１ １ ０．５１２１６１４０１ ５．６２９６１９０８６ ０．０３２５
Ｂ ６．９９１３７００２１ １ ６．９９１３７００２１ ７６．８４８３３３４４０ ＜０．０００１
Ｃ ０．００２０４６２４１ １ ０．００２０４６２４１ ０．０２２４９２０４３ ０．８８２９
Ｄ ５．４５４４１２８４１ １ ５．４５４４１２８４１ ５９．９５４２７７２７０ ＜０．０００１
ＡＢ ０．１２６０６０５０３ １ ０．１２６０６０５０３ １．３８５６４２５１４ ０．２５８８
ＡＣ ０．０００３５７２１０ １ ０．０００３５７２１０ ０．００３９２６４１１ ０．９５０９
ＡＤ ０．００１１４９２１０ １ ０．００１１４９２１０ ０．０１２６３１９８４ ０．９１２１
ＢＣ ２．０７７２０１５６３ １ ２．０７７２０１５６３ ２２．８３２３６０１６０ ０．０００３
ＢＤ ０．２３７８０２５２３ １ ０．２３７８０２５２３ ２．６１３８９７９１８ ０．１２８２
ＣＤ ０．０１３０１８８１０ １ ０．０１３０１８８１０ ０．１４３１０１２５９ ０．７１０９
Ａ２ ６．５８４８０２１７８ １ ６．５８４８０２１７８ ７２．３７９３８６５８０ ＜０．０００１
Ｂ２ ９．９０８５７７７４６ １ ９．９０８５７７７４６ １０８．９１３９４４５００ ＜０．０００１
Ｃ２ １．６９９０６５３４１ １ １．６９９０６５３４１ １８．６７５９３０３９０ ０．０００７
Ｄ２ １１．７０７６２２１１０ １ １１．７０７６２２１１０ １２８．６８８８３２８００ ＜０．０００１
模型 Ｍｏｄｅｌ ３６．０７１６８２４３０ １４ ２．５７６５４８７４５ ２８．３２１１２６８３０ ＜０．０００１
残差Ｒｅｓｉｄｕａｌｅｒｒｏｒ １．２７３６６６９２２ １４ ０．０９０９７６２０９
失拟项Ｌａｃｋｏｆｆｉｔ １．２５３２４６９２２ １０ ０．１２５３２４６９２ ２４．５４９４０１０１０ ０．００３７
纯误差Ｐｕｒｅｅｒｒｏｒ ０．０２０４２００００ ４ ０．００５１０５０００
总和Ｔｏｔａｌ ３７．３４５３４９３５０ ２８
注： 表示显著， 表示极显著。
Ｎｏｔｅ：ａｎｄｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ０．０５ａｎｄ０．０１ｌｅｖｅｌｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
１１２第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图８ 各因素之间的等高线图和响应面图
犉犻犵．８ 犜犺犲犮狅狀狋狅狌狉犿犪狆犪狀犱狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲犵狉犪狆犺犫犲狋狑犲犲狀狋犺犲狏犪狉犻狅狌狊犳犪犮狋狅狉狊
２１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
表４ 秃疮花提取浓缩液最小抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
犜犪犫犾犲４ 犜犺犲犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犲犱犾犻狇狌犻犱狅犳狋犺犲犿犻狀犻犿犪犾犻狀犺犻犫犻狋狅狉狔犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀犪狀犱犿犻狀犻犿犪犾犫犪犮狋犲狉犻犮犻犱犪犾
犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀犲狓狋狉犪犮狋犳狉狅犿犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿 个Ｎｏ．
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
药品浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｓ（ｍｇ／ｍＬ）
０．０５ ０．１０ ０．１５ ０．２０ ０．２５ ０．３０ ０．３５ ０．４０
阳性对照
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒａｓｔ
阴性对照
Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒａｓｔ
ＭＩＣ ＭＢＣ
大肠埃希氏杆菌Ｅ狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻
ＡＴＣＣ１２４５３
＋＋＋ ＋＋ ＋ － － － － － ＋＋＋ － ０．２０ ０．１５
白色念珠菌犆犪狀犱犻犱犪犪犾犫犻犮犪狀狊
ＡＴＣＣ１０２３１
＋＋ ＋ － － － － － － ＋＋＋ － ０．１５ ０．１０
绿脓杆菌犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪
ＡＴＣＣ２７８５３
＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － － ＋＋＋ － ０．３５ ０．３０
注：表中数据为３次重复试验的平均值。“＋”表示有菌生长；“＋＋”表示细菌生长较茂盛；“＋＋＋”表示细菌生长茂盛；“－”表示无菌生长。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄａｔａｉｎｔａｂｌｅｉｓｔｈｅｍｅａｎｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｅａｔｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．“＋”Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｕｎｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒｏｗｔｈ；“＋＋”Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｕｎｄ
ｍｏｒｅｌｕｘｕｒｉａｎｔｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒｏｗｔｈ；“＋＋＋”Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｕｎｄｌｕｘｕｒｉａｎｔｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒｏｗｔｈ；“－”Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｅｒｉｌｅｇｒｏｗｔｈ．
加入秃疮花提取浓缩液前后，对照组（图９Ａ）的大肠埃希氏杆菌胞质均匀、细胞膜和细胞壁均完整，其切面呈
明显杆状。加入秃疮花提取浓缩液后的大肠埃希氏杆菌（图９Ｂ），细菌外形已变为球形或不规则型，细胞壁变薄
且不完整，有些菌体细胞壁部分脱落或消失，细胞壁外观呈毛刺状或轮廓模糊，结构不清晰且伴随不同程度的凹
陷变形，细胞外有溶出物溢出。
图９ 秃疮花提取浓缩液加入前后大肠埃希氏杆菌透射电镜图（×５００００）
犉犻犵．９ 犜犺犲狋狉犪狀狊犿犻狊狊犻狅狀犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆狔犻犿犪犵犲狊狅犳犈．犮狅犾犻狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋狋狉犲犪狋犲犱狑犻狋犺
犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犲犱犾犻狇狌犻犱狅犳犲狓狋狉犪犮狋犳狉狅犿犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿 （×５００００）
Ａ：大肠埃希氏杆菌犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻；Ｂ：秃疮花提取浓缩液处理后的大肠埃希氏杆菌
Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｌｉｑｕｉｄｏｆｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍ犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿ｏｆ犈．犮狅犾犻．
３ 讨论
使用响应面法试验设计，克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和
响应值的最优值的缺陷，并能减少试验次数，分析几种因素间的交互作用，以达到较全面地反映各因素水平的效
果［２０２３］。本试验首先考察了液料比、浸泡时间、回流时间、超声时间、浸提液ｐＨ、乙醇浓度６组单因素水平对秃
疮花生物碱的影响，最终筛出４组主要因素进行响应面试验设计，确定其最佳提取工艺条件为：液料比１５ｍＬ／ｇ、
超声时间３５ｍｉｎ、回流时间２．５ｈ、乙醇浓度６５％，在此条件下秃疮花中生物碱含量为９．３３％。
将秃疮花按照响应面法试验设计的最佳工艺进行提取，用其浓缩液对大肠埃希氏杆菌、白色念珠菌、绿脓杆
菌进行抑菌试验，发现对这３种供试菌的最小抑菌浓度分别为０．２０，０．１５和０．３５ｍｇ／ｍＬ，最低杀菌浓度分别为
０．１５，０．１０和０．３０ｍｇ／ｍＬ。以大肠埃希氏杆菌为研究对象，进行５００００倍透射电镜观察，其抑菌效果显著。
秃疮花在甘肃省陇东南地区资源丰富，有解毒、清热之功效。通过对秃疮花中生物碱的响应面提取工艺及抑
菌活性研究，为其资源的进一步深层次开发提供了基础。
３１２第２１卷第４期 草业学报２０１２年
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犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狀犵狆狉狅犮犲狊狊犳狅狉犪犾犽犪犾狅犻犱狊犳狉狅犿犇犻犮狉犪狀狅狊狋犻犵犿犪犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿
犫狔狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱狊狋狌犱狔狅狀犻狋狊犪狀狋犻犫犪犮狋犲狉犻犪犾犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狏犻狋狉狅
ＺＨＡＯＱｉａｎｇ１，ＹＵＳｉｊｉｕ１，ＷＡＮＧＴｉｎｇｐｕ２，ＹＵＡＮＹｉｊｕｎ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅｏｆ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｉａｎｓｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ７４１００１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅ犇犻犮狉犪狀狅狊狋犻犵犿犪犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿 ｗａｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ，ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｌｅｖｅｌｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｌｉｑｕｉｄｏｆｅｘｔｒａｃｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉｍａｇｅｓｏｆ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｏｆｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｌｉｑｕｉｄｏｆｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍ
犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿ｗａｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｌｉｑｕｉｄ
ｔｏｓｏｌｉｄｒａｔｉｏｗａｓ１５ｍＬ／ｇ，ｔｉｍｅｏｆｕｌｔｒａｓｏｕｎｄｗａｓ３５ｍｉｎ，ｒｅｆｌｕｘｉｎｇｔｉｍｅｗａｓ２．５ｈ，ａｌｃｏｈｏｌｗａｓ６５％，ａｎｄ
ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｌｋａｌｏｉｄｆｒｏｍ犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿ｗａｓ９．３３％ｉｎｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅｏｐｔｉ
ｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ犈．犮狅犾犻，犆犪狀犱犻犱犪犪犾犫犻犮犪狀狊ａｎｄ
犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪ｏｆｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｎｉｍａｌｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｅｒｅ０．２０，
０．１５，０．３５ｍｇ／ｍＬａｎｄ０．１５，０．１０，０．３０ｍｇ／ｍＬ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏ
ｐｙｔｏｅｖｅｒｅｓｔｔｏ犈．犮狅犾犻ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｅｆｆｅｃｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｍａｒｋａｂｌｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓｔｏ犇．犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿ｓｐｅｎｄａｌｋａｌｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｒｅｒｅａｓｏｎａｂｌｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；犇犻犮狉犪狀狅狊狋犻犵犿犪犾犲狆狋狅狆狅犱狌犿；ａｌｋａｌｏｉｄｓ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ
４１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４