全 文 ：书高尔夫果岭草坪草上禾本科根结线虫的鉴定
卓侃，胡茂秀，王宏洪，唐照磊，邵晓勇，廖金铃
（华南农业大学资源环境学院植物线虫研究室，广东 广州５１０６４２）
摘要：２００９年，广东省阳江和珠海的２个高尔夫球场果岭草坪出现大面积的斑块状枯死，调查发现这些果岭草的根
部具有根结，同时从土壤当中分离到大量的根结线虫２龄幼虫。运用线虫比较形态学，结合同工酶及分子生物学
技术对采自这２个高尔夫球场的根结线虫进行鉴定，确定该根结线虫为禾本科根结线虫（犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲犵狉犪犿犻狀犻狊）。
禾本科根结线虫病是美国高尔夫球场的一个重要草坪草病害，在我国则是首次发现。
关键词：禾本科根结线虫；狗牙根；鉴定；高尔夫果岭；广东
中图分类号：Ｑ９５９．１７；Ｓ４３２．４＋５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０２５３０４
　 近年来我国国民收入和人民群众生活水平日益提高，高尔夫运动逐步走进大众生活，随着高尔夫球即将正式
成为夏季奥运会的比赛项目，高尔夫运动将在我国得到快速推广与发展［１，２］。目前草坪草病害已成为草坪业健
康发展的限制因素之一，高尔夫球场草坪草病害不仅影响到高尔夫球场的美观，而且会降低草坪草的质量，甚至
导致草坪草局部或全部死亡，严重阻碍高尔夫运动的发展［３５］。在我国，高尔夫球场草坪草病害报道主要是真菌
病害，包括褐斑病、币斑病和灰斑病等［５８］，但在高尔夫行业发达国家，如美国、英国等，植物线虫病也是十分重要
的高尔夫草坪草病害，病原线虫主要包括根结线虫（犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲）、粒线虫（犃狌犵狌犻狀犪）、亚粒线虫（犛狌犫犪狀犵狌犻狀犪）、
毛刺线虫（犜狉犻犮犺狅犱狅狉狌狊）和拟毛刺线虫（犘犪狉犪狋犻犮犺狅犱狅狉狌狊）等［９１１］。２００９年，广东阳江和珠海２个高尔夫球场的果
岭草坪草出现大面积的斑块状枯死，严重影响到高尔夫球场的使用。经笔者采样调查，发现果岭草坪草的根部有
瘤状肿大，严重的病根发黑腐烂，同时从土壤中分离到大量的根结线虫２龄幼虫，在有的样品中，线虫多达２０００
条／１００ｇ土。在我国，还未见高尔夫球场草坪草寄生线虫种类的报道，因此，笔者结合形态学、同工酶及分子生
物学手段对从这２个高尔夫球场采集到的根结线虫样品进行鉴定，旨在明确该线虫的种类及为控制该线虫提供
理论基础。
１　材料与方法
１．１　供试虫源
２００９年５月和８月，按５点采样法分别在广东省的阳江和珠海２个高尔夫果岭采集狗牙根（犆狔狀狅犱狅狀ｓｐ．）
草根及根际土。挑取病根上的根结线虫卵囊，用单卵囊接种室内的狗牙根进行根结线虫纯化培养。培养成功后，
于２０１０年４月用贝曼漏斗分离法［１２］分离土壤中的根结线虫雄虫和２龄幼虫，用直接解剖分离法［１２］从根上获得
雌虫。
１．２　线虫形态观察
按常规方法［１２］制作会阴花纹，制作好会阴花纹后，在Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜下观察会阴花纹及雌虫、雄虫和２龄幼
虫的形态特征并拍照保存于电脑中，同时进行形态测量，所有虫态均测量２０条虫。
１．３　同工酶分析
参考Ｅｓｂｅｎｓｈａｄｅ和Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｏｕ［１３］的方法稍作改动。采用北京君意仪器厂生产的ＪＹ６００型电泳仪，ＪＹ
ＳＣＺ２＋型垂直板电泳槽，凝胶板大小为８０ｍｍ×１００ｍｍ，凝胶厚度１ｍｍ。分离胶和浓缩胶同源，电极缓冲液是
ｐＨ８．３的Ｔｒｉｓ甘氨酸缓冲液。酶浸提液为２０％蔗糖（Ｗ／Ｖ）和２％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００，每个种群挑取４～５个低龄雌
第２０卷　第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２５３－２５６
２０１１年２月
 收稿日期：２０１００５０４；改回日期：２０１００７２０
基金项目：国家自然科学基金项目（３０８７１６２８）和农业部公益性行业项目（ｎｙｈｙｚｘ０７０５０４）资助。
作者简介：卓侃（１９７９），男，福建福鼎人，助理研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｏｋａｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
胡茂秀（１９７４），女，山东济南人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｍｘｉｕｈｕ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｌｉａｏ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
虫制成１个样品，重复制作３个样品。用５０μＬ微量取样器加样，每孔３０μＬ，其中含５μＬ溴酚兰溶液，以已知爪
哇根结线虫作对照。电泳及酯酶（ＥＳＴ）和苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）的染色参照Ｅｓｂｅｎｓｈａｄｅ和Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｏｕ［１４］的
方法。显色完全后漂洗３次，在１０％醋酸加上１０％甘油中固定３ｈ以上，然后扫描并贮存在电脑中。参照Ｅｓ
ｂｅｎｓｈａｄｅ和Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｏｕ［１３］的标准，判读ＥＳＴ和 ＭＤＨ谱型，初步确定根结线虫的种类。
１．４　ＤＮＡ鉴定
ＤＮＡ提取按照Ｌｉａｏ等［１５］的方法，提取的ＤＮＡ直
图１　禾本科根结线虫光学显微镜形态图
犉犻犵．１　犔犻犵犺狋犿犻犮狉狅犵狉犪狆犺狊狅犳犕．犵狉犪犿犻狀犻狊
　　　Ａ：雌虫整体 Ｅｎｔｉｒｅｆｅｍａｌｅ；Ｂ，Ｃ：雌虫会阴花纹 Ｆｅｍａｌｅｐｅｒｉｎｅａｌ
ｐａｔｔｅｒｎｓ；Ｄ：雄虫整体Ｅｎｔｉｒｅｍａｌｅ；Ｅ：雄虫体前部 Ｍａｌｅａｎｔｅｒｉｏｒｒｅ
ｇｉｏｎ；Ｆ：雄虫尾部 Ｍａｌｅｔａｉｌ；Ｇ：２龄幼虫体前部Ｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅｊｕｖｅｎｉｌｅ
ａｎｔｅｒｉｏｒｒｅｇｉｏｎ；Ｈ：２龄幼虫尾部Ｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅｊｕｖｅｎｉｌｅｔａｉｌ；Ｉ：２龄幼
虫整体Ｅｎｔｉｒｅｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅｊｕｖｅｎｉｌｅ；比例尺Ｓｃａｌｅ：Ａ＝２００μｍ；Ｂ，Ｃ，
Ｉ＝２０μｍ；Ｄ＝５０μｍ；Ｅ，Ｆ＝１０μｍ；Ｇ，Ｈ＝５μｍ
图２　禾本科根结线虫同工酶表型
犉犻犵．２　犐狊狅狕狔犿犲狆犺犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳犕．犵狉犪犿犻狀犻狊
　　　Ａ：酯酶 Ｅｓｔｅｒａｓｅ（ＥＳＴ）；Ｂ：苹果酸脱氢酶 Ｍａｌａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＭＤＨ）；Ｍｊ：爪哇根结线虫 犕．犼犪狏犪狀犻犮犪；ＺＨ：禾本科根结线虫珠海
群体 犕．犵狉犪犿犻狀犻狊ｆｒｏｍＺｈｕｈａｉ；ＹＪ：禾本科根结线虫阳江群体 犕．
犵狉犪犿犻狀犻狊ｆｒｏｍＹａｎｇｊｉａｎｇ
接用于ＰＣＲ（聚合酶链式反应，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）或保存于－２０℃待用。利用引物 Ｃ２Ｆ３ （５′
ＧＧＴＣＡＡＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧ３′）和 １１０８
（５′ＴＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴ３′）［１６］对根结线
虫ｍｔＤＮＡ的犆犗犐犐／犾犚犖犃间序列进行扩增。ＰＣＲ反
应体系、扩增条件和电泳参照Ｐｏｗｅｒｓ和 Ｈａｒｒｉｓ［１６］。
将电泳分离的ＰＣＲ产物切胶回收，连接到ｐＭＤ１８Ｔ
载体，最后转化克隆送交上海英骏生物技术有限公司
测序。
通过ＮＣＢＩ（美国国立生物技术信息中心，Ｎａｔｉｏｎ
ａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）进行同源序
列检索，检索程序采用 ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｌａｓｔ，使用软件
ＤＮＡＳｔａｒ进行序列相似性分析。
２　结果与分析
２．１　线虫形态鉴定
显微观察结果表明，采自广东２个高尔夫球场的
根结线虫形态相似，初步鉴定为同一个种。雌虫（图
１Ａ）虫体膨大，长梨形，两侧对称或不对称，颈部短；口
针长１２～１４μｍ，针椎部略向后弯，基部球卵圆形并略
向后倾斜；排泄孔位于距头部前端约一个口针长的位
置；会阴花纹（图１Ｂ，Ｃ）卵圆形，具粗糙条纹和有棱的
背弓，尾末端区域无条纹，侧区可见。雄虫（图１Ｄ，Ｅ，
Ｆ）体长１２０３～１３２２μｍ；侧区具４条侧线；头部与体
部略缢缩；唇区光滑；口针具圆的基部球，略向后倾斜；
背食道腺开口到口针基部球距离（ＤＧＯ）相对短，约为
２．５～３．０μｍ；尾短、圆；交接刺略弯，长２５～３０μｍ。２
龄幼虫（图１Ｇ，Ｈ，Ｉ）虫体相对细长，３８０～４８６μｍ；侧
区具４条侧线；口针１２～１３μｍ；背食道腺开口靠近口
针基部球，ＤＧＯ约为２～３μｍ；半月体位于排泄孔前；
直肠膨胀；尾细长，６８～７９μｍ，透明尾相对长，渐变
细，末端细圆。主要形态特征及测量值与 Ｋａｒｓｓｅｎ［１７］
描述的禾本科根结线虫相比，除２龄幼虫体长偏小
（３８０～４８６和４０３～５０６μｍ），其余基本相符，故初步
判断这２个根结线虫群体为禾本科根结线虫（犕犲犾狅犻犱
狅犵狔狀犲犵狉犪犿犻狀犻狊）。
４５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
２．２　同工酶测定结果
图３　禾本科根结线虫犿狋犇犖犃的
犆犗犐犐／犾犚犖犃间序列电泳图谱
犉犻犵．３　犘狉狅犱狌犮狋狊狅犳犘犆犚犪犿犵犾犻犳犻犲犱犿狋犇犖犃犫犲狋狑犲犲狀
犆犗犐犐犪狀犱犾犚犖犃狅犳犕．犵狉犪犿犻狀犻狊
　　　Ｍ：ＤＬ２０００标准分子量ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ＺＨ：禾本科根结线
虫珠海群体 犕．犵狉犪犿犻狀犻狊ｆｒｏｍＺｈｕｈａｉ；ＹＪ：禾本科根结线虫阳江群体
犕．犵狉犪犿犻狀犻狊ｆｒｏｍＹａｎｇｊｉａｎｇ
２个根结线虫群体的酯酶同工酶（ＥＳＴ）和苹果酸
脱氢酶（ＭＤＨ）表型一致。ＥＳＴ均为ＶＳ１型（图２Ａ），
ＭＤＨ均为Ｎ１ａ型（图２Ｂ），与Ｐｅｒｒｙ等［１８］报道的禾本
科根结线虫的ＥｓｔＭＤＨ表型图谱相同。
２．３　分子鉴定结果
利用引物Ｃ２Ｆ３和１１０８对这２个根结线虫群体
ｍｔＤＮＡ的犆犗犐犐／犾犚犖犃间序列进行扩增，结果均获得
一条约５５０ｂｐ的亮带（图３）；分别将２条带进行回收
克隆测序，结果表明２条序列均为５４０ｂｐ，相似性为
１００％，２ 条 序 列 的 ＧｅｎｅＢａｎｋ 登 录 号 分 别 为
ＨＭ１６１６８０（阳江群体）和 ＨＭ１６１６７９（珠海群体）。在
ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ比对，结果表明这２条序列与序
列号为ＡＹ７５７８８６的禾本科根结线虫ｍｔＤＮＡ同源性最高，序列相似性达到９９．３％。该结果进一步确证该根结
线虫为禾本科根结线虫。
３　讨论
本研究利用比较形态学、同工酶及分子生物学相结合的方法，在广东省的２个高尔夫球场果岭草坪草上发现
禾本科根结线虫，而且该线虫对果岭草坪造成严重的危害，这是首次在我国高尔夫球场发现禾本科根结线虫。禾
本科根结线虫最早于１９５９年在美国佛罗里达州的奥古斯丁草（犛狋犲狀狅狋犪狆犺狉狌犿狊犲犮狌狀犱犪狋狌犿）上发现［１９］，随后研究
表明该线虫可寄生剪股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊）、结缕草（犣狅狔狊犻犪）、狗牙根等多种草坪草的根部，对这些草坪草造成严重的
危害，通常会导致植株缺乏水分和养分，变弱，直至枯死［２０２２］。
据报道，禾本科根结线虫在１６～３２℃均可进行侵染及生长发育，２７℃左右是该线虫生长发育最适合的温
度［２３］。广东省气候温暖湿润，大部分地区平均气温在２０～２３℃，７月平均气温都在２８～２９℃，且广东高尔夫球场
通常选用暖季型草坪草中坪用价值最高，应用最广泛的一个草种———狗牙根作为果岭草坪草［２４２６］，因此广东的高
尔夫球场草坪十分适宜该线虫的生长、发育与繁殖。一旦根结线虫在高尔夫球场草坪定殖下来，要根除它需花费
大量的财力与人力，因此根结线虫，尤其是禾本科根结线虫的预防是美国高尔夫球场草坪草管理和护理的一个重
要问题［９，１０］。然而，在我国，由于以前未在草坪草上发现该线虫病害，而且该病害地上症状又与缺素症类似，因此
容易被人们忽视。鉴于此，建议应进一步开展该线虫的调查，尤其在热带和亚热带地区的高尔夫球场，同时在种
草前，建议用熏蒸性杀线虫剂处理果岭土壤，用于球场草坪种植的草皮在种植前要检测分析是否携带病原线虫。
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［２６］　王志勇，刘建秀，郭海林．狗牙根种质资源营养生长特性差异的研究［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（２）：２５３２．
犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲犵狉犪犿犻狀犻狊狅狀犵狅犾犳犵狉犲犲狀狊
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（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＮａｔｕｒａｌＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｓｏｕｔｈ
ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎ２００９，ｙｅｌｏｗｐａｔｃｈｅｓｅｍｅｒｇｅｄｏｎｇｏｌｆｇｒｅｅｎｓｏｆｔｗｏｇｏｌｆｃｏｕｒｓｅｓｉｎＹａｎｇｊｉａｎｇａｎｄＺｈｕｈａｉｏｆ
ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ｒｏｏｔｋｎｏｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｕｒｆｇｒａｓｓｒｏｏｔｓｏｆｔｈｅｇｏｌｆｇｒｅｅｎｓ，ａｎｄｎｕｍｅｒｏｕｓｊｕｖｅｎｉｌｅ
ｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅ（Ｊ２）ｗｏｒｍｓｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅｇｅｎｕｓ犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌｓａｒｏｕｎｄｔｕｒｆｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ．
Ｔｈｅｒｏｏｔｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｓｏｚｙｍｅａｎｄｍｔＤＮＡＰＣＲｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｒｅ
ｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｒｏｏｔｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｗａｓ犕．犵狉犪犿犻狀犻狊．犕．犵狉犪犿犻狀犻狊ａｒｅｋｎｏｗｎｔｏｂｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎ
ｏｆｇｏｌｆｃｏｕｒｓｅｇｒｅｅｎｓｔｕｒｆｉｎＵＳＡ，ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｉｓｆｏｕｎｄｆｉｒｓｔｌｙｏｎｇｏｌｆｃｏｕｒｓｅｉｎＣｈｉｎａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲犵狉犪犿犻狀犻狊；犆狔狀狅犱狅狀；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｇｏｌｆｇｒｅｅｎ；Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
６５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１