全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０２６ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
刘莎莎，程园园，张丹，王晓丹，刘佳莉，郭长虹．两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究．草业学报，２０１５，２４（９）：９６１０３．
ＬＩＵＳｈａＳｈａ，ＣＨＥＮＧ ＹｕａｎＹｕａｎ，ＺＨＡＮＧＤａｎ，ＷＡＮＧＸｉａｏＤａｎ，ＬＩＵＪｉａＬｉ，ＧＵＯＣｈａｎｇＨｏｎｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐｐ．ｆｒｏｍｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆａｌｆａｌｆａ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（９）：９６１０３．
两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究
刘莎莎，程园园，张丹，王晓丹，刘佳莉，郭长虹
（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，分子细胞遗传与遗传育种黑龙江省重点实验室，黑龙江 哈尔滨１５００２５）
摘要：从紫花苜蓿根际土中分离出２株芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐｐ．）菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２，并评价了其对尖孢镰刀菌
（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿）的抑制作用，及其对由尖孢镰刀菌引起的苜蓿根腐病的防治效果。经过形态观察、１６ＳｒＤ
ＮＡ序列分析和生理生化鉴定，确定菌株ＣＹＹ６为地衣芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀犻犳狅狉犿犻狊），ＣＹＹ４２为短短芽孢杆
菌（犅狉犲狏犻犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊）。同时检测发现这２株芽孢杆菌均能不同程度地合成嗜铁素。在平板对峙实验中，２株菌
株均能对尖孢镰刀菌产生拮抗作用，并产生抑菌带，抑菌率分别为４９．３％和５６．３％。且其发酵液可以致使尖孢镰
刀菌菌丝及孢子生长异常，出现菌丝扭曲、断裂、破碎，孢子数量明显减少等现象。在盆栽实验中，２株菌株对由尖
孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相对防效分别为５７．５５％和６４．０３％，在紫花苜蓿根腐病防治方面具有较好的
应用潜力。
关键词：芽孢杆菌；紫花苜蓿；生物防治；尖孢镰刀菌；根腐病　　
犐狊狅犾犪狋犻狅狀，犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀，犪狀犱犫犻狅犮狅狀狋狉狅犾犲犳犳犲犮狋狊狅犳犅犪犮犻犾犾狌狊狊狆狆．犳狉狅犿狋犺犲狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犲
狅犳犪犾犳犪犾犳犪
ＬＩＵＳｈａＳｈａ，ＣＨＥＮＧＹｕａｎＹｕａｎ，ＺＨＡＮＧＤａｎ，ＷＡＮＧＸｉａｏＤａｎ，ＬＩＵＪｉａＬｉ，ＧＵＯＣｈａｎｇＨｏｎｇ
犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犕狅犾犲犮狌犾犪狉犆狔狋狅犵犲狀犲狋犻犮狊犪狀犱犌犲狀犲狋犻犮犅狉犲犲犱犻狀犵狅犳犎犲犻犾狅狀犵犼犻犪狀犵犘狉狅狏犻狀犮犲，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅
犵狔，犎犪狉犫犻狀犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪狉犫犻狀１５００２５，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅａｉｍｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｗｏ犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐｐ．，ＣＹＹ６ａｎｄＣＹＹ４２，ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆａｌｆａｌｆａ，ａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｉｒａｂｉｌｉｔｙｔｏｉｎｈｉｂｉｔＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，ｔｈｅｃａｕｓａｌｐａｔｈｏｇｅｎｏｆａｌｆａｌ
ｆａｒｏｏｔｒｏｔ．Ｂａｓｅｄｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｅｓ，ｓｔｒａｉｎ
ＣＹＹ６ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀犻犳狅狉犿犻狊ａｎｄＣＹＹ４２ａｓＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓｂｒｅｖｉｓ．Ｂｏｔｈｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｂｌｅｔｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ，ａｌｔｈｏｕｇｈａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓ．Ｉｎａｄｕａｌｃｕｌｔｕｒｅａｓｓａｙ，ｂｏｔｈｓｔｒａｉｎｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｏｆＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｚｏｎｅｓ，ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｓｏｆＣＹＹ６ａｎｄＣＹＹ４２ａｇａｉｎｓｔＦ．ｏｘｙｓｐｏ
ｒｕｍｗｅｒｅ４９．３％ａｎｄ５６．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｅａｃｈｓｔｒａｉｎｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｄｅｆｏｒｍｅｄｇｒｏｗｔｈ
ｏｆｔｈｅｍｙｃｅｌｉａａｎｄｓｐｏｒｅｓｏｆＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．Ｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｗｅｒｅｔｗｉｓｔｅｄ，ｂｒｏｋｅｎ，ｏｒｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍ
ｂｅｒｏｆｓｐｏｒｅｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＳｔｒａｉｎｓＣＹＹ６ａｎｄＣＹＹ４２ｓｈｏｗｅｄ５７．５５％ａｎｄ６４．０３％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆａｌｆａｌｆａｒｏｏｔｒｏｔｉｎｐｏｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｂｏｔｈｓｔｒａｉｎｓｈａｖｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇａｌｆａｌ
ｆａｒｏｏｔｒｏｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐｐ．；ａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）；ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ；犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿；ｒｏｏｔｒｏｔ
第２４卷　第９期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．９
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年９月
Ｓｅｐ，２０１５
收稿日期：２０１５０１１６；改回日期：２０１５０３３０
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１４７０５７１；３１１７０４７９），国家科技支撑计划项目（Ｎｏ．２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０４２１），黑龙江省科技攻关项目（Ｎｏ．
ＧＣ１２Ｂ３０４）和黑龙江省自然科学基金项目（Ｎｏ．Ｃ２０１１４２）资助。
作者简介：刘莎莎（１９８８），女，黑龙江鹤岗人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｓｈａ９０９２３＠１６３．ｃｏｍ。程园园（１９８７），女，黑龙江大庆人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：
ｃｙｙ３１５３３５＠１６３．ｃｏｍ。共同第一作者 Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｙｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋ．
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｋａｋｕ３００８＠１２６．ｃｏｍ
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界上栽培最广的优质多年生豆科牧草，具有产草量高、再生性强、利用年限
长、适口性强、营养丰富等优点。至今，紫花苜蓿在我国的种植历史已超过两千年，是我国种植面积最大的牧
草［１３］。然而随着种植年限和种植面积的增加，紫花苜蓿病害也随之出现，如根腐病、褐斑病、霜霉病、白粉病等，
其中紫花苜蓿根腐病（ｒｏｏｔｒｏｔ）是一种世界性病害，会危害紫花苜蓿的各个生长时期，主要症状表现为根部出现
坏死斑，根茎腐烂中空，侧根大量腐烂死亡，茎叶全部枯死，严重影响紫花苜蓿的品质和产量［４６］。据估计，全世界
紫花苜蓿每年因根腐病造成的产量损失在２０％～４０％［５］，而通过对黑龙江省８个地区的紫花苜蓿根腐病进行调
查，发现该病害发生普遍，严重地块发病率高达９２％，这种病害还会随着种植面积和年限的增长而加重［７］。虽然
紫花苜蓿根腐病病原复杂，但据研究表明多与镰刀菌有关［４，８９］。
防治苜蓿根腐病的主要方法有选育苜蓿抗病品种、采取农业措施和使用化学杀菌剂等［５］，但由于苜蓿根腐病
属于土传病害，上述方法的防治效果往往不太理想。因此，筛选对紫花苜蓿根腐病菌（镰刀菌）有较强抗性的生防
菌株并用于紫花苜蓿生产，将会有效解决紫花苜蓿根腐病病害问题，同时对紫花苜蓿产业的可持续发展具有重要
意义。生防菌株一般通过产生抗真菌代谢物或通过诱发系统抗性来防治植物病害［１０］。芽孢杆菌是一类好氧或
厌氧、杆状、产芽孢、革兰氏阳性菌［１１］，能够产生多种抗菌物质，如嗜铁素、溶菌酶（蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶）
和抗真菌脂肽等［１０］，因其营养要求简单、繁殖速度快，能产生抗逆耐热的芽孢，有利于生防菌剂的制备和剂型的
加工生产［１２］，因此芽孢杆菌在生物防治方面被广泛地研究应用。目前，还没有关于应用芽孢杆菌防治紫花苜蓿
根腐病的报道。
本研究从紫花苜蓿根际土中分离鉴定了２株芽孢杆菌菌株，评价其对尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的
防治效果，为开发苜蓿根腐病的生防菌剂奠定基础。
１　材料与方法
１．１　土壤样品采集
供试土样于２０１３年９月中旬取于哈尔滨师范大学试验田中生长的紫花苜蓿根际，将土样带回实验室４℃保
存。
１．２　植物病原真菌
尖孢镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿）分离自田间患根腐病的大豆病根，属大豆专化型，由黑龙江八一农垦大
学农学院植物免疫研究室提供。
１．３　培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，ＰＤＡ）、溶菌肉汤培养基（ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉ，ＬＢ）［１３１５］，铬奥醇培
养基（ｃｈｒｏｍｅａｚｕｒｏｌｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，ＣＡＳ）［１６］，改良的金氏Ｂ培养基（ＭｏｄｉｆｉｅｄＫｉｎｇ’ｓＢ，ＭＫＢ）［１７］。
１．４　土样中芽孢杆菌的分离纯化
称取５ｇ土样，加入盛有玻璃珠和４５ｍＬ无菌水的锥形瓶中，在培养摇床上剧烈振荡３０ｍｉｎ（３７℃）后于
８０℃的水浴锅中保持１５ｍｉｎ。将悬浊液稀释１０－３、１０－４和１０－５，从其中各取１００μＬ于ＰＤＡ平板上涂布，置于
３７℃恒温箱内培养１～３ｄ，待平板上出现较多单菌落时，在无菌条件下挑取菌落形态、颜色等性状不同的单菌落
于ＰＤＡ平板划线纯化至第６代，制成甘油菌－８０℃保存。
１．５　分离菌株的鉴定
１．５．１　分离菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列分析　　采用ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ方法提取细菌ＤＮＡ。根据原核生物１６ＳｒＤＮＡ
保守序列通用引物。
Ｆ８：５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′；Ｆ１５４１：５′ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ３′进行扩增。扩增条
件：９４℃变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ（共３０个循环）；７２℃延伸１０ｍｉｎ。将所得
产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行ＤＮＡ测序，得到１６ＳｒＤＮＡ序列后，通过一套在ＤＮＡ数据库中
进行相似性比较的分析工具（ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，ＢＬＡＳＴ），与数据库中的已知序列进行同源性分
析。
７９第９期 刘莎莎　等：两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究
１．５．２　生理生化鉴定　　参照《常见细菌系统鉴定手册》［１４］和《南伯杰细菌鉴定手册》［１５］对菌株进行形态学观
察及生理生化鉴定。
１．６　芽孢杆菌嗜铁素合成能力的分析
定性测定参照Ｓｃｈｗｙｎ和Ｎｅｉｌａｎｄｓ［１６］的方法，将已分离的菌株接种于ＣＡＳ培养基上，２８℃培养２～３ｄ，观察
菌落周围培养基上有无形成橘黄色的透明晕圈。
定量测定采用水溶性色素产生菌铁载体的定量检测法［１７］，等体积的样品与ＣＡＳ检测液反应后，在６３０ｎｍ
处测得的吸光值为Ａ，对照为去离子水加ＣＡＳ检测液，测得的值记作Ａｒ，样品中嗜铁素的相对含量为Ａ／Ａｒ。
１．７　分离菌株抑菌能力测定
１．７．１　平板对峙实验　　采用平板对峙法［１８］，将植物病原真菌尖孢镰刀菌接种于ＰＤＡ平板中央，在平皿四周
距边缘２ｃｍ处接种分离菌株，以只接种尖孢镰刀菌为对照。２８℃下恒温培养５ｄ，测量尖孢镰刀菌菌落半径，并
计算抑菌率：
抑菌率＝［（对照菌落半径－处理菌落半径）／对照菌落半径］×１００％
１．７．２　发酵液对病原菌丝及孢子生长的抑制作用　　ＰＤＡ板活化尖孢镰刀菌，刮取培养基表面菌丝，接种于
５０ｍＬＰＤＡ液体培养基中。同时，取２００μＬ过夜培养的细菌发酵液也接入ＰＤＡ液体培养基中，对照组不接种
细菌发酵液。２８℃振荡培养２ｄ，光学显微镜下观察不同处理尖孢镰刀菌菌丝及孢子的生长情况［１９］。
１．７．３　分离菌株对盆栽紫花苜蓿的防病作用　　参照张璐等［２０］的方法，并稍作修改。紫花苜蓿种子经表面杀
菌后密播于无菌蛭石中，４５ｄ后，将植株根部用石英砂揉搓制造伤口，分别浸入无菌水和培养２ｄ的尖孢镰刀菌
孢子悬浮液中４０ｍｉｎ，将植株重新种回无菌蛭石（每盆１０株），并实施如下处理：（ａ）无菌水；（ｂ）接种尖孢镰刀菌
孢子悬浮液和无菌水；（ｃ）接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液且施用ＣＹＹ６菌悬液；（ｄ）接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液且
施用ＣＹＹ４２菌悬液。（ｃ）和（ｄ）处理组每２ｄ用分离菌株制成的菌悬液灌根，（ａ）和（ｂ）处理组浇灌等量的无菌
水。每处理４个重复，接种１０ｄ后观察记录病情。参照陈雅君和崔国文［９］的病害严重度分级标准，将紫花苜蓿
根腐病分为５级：０级为健康植株，无枯萎或腐烂症状；１级为主根或根茎局部出现病斑，面积低于１０％，地上部
分生长良好；２级为主根及根茎出现连片病斑，面积在１０％～３０％，地上部分生长较好；３级为３０％～５０％，主根
及根茎出现病斑，地上生长很差；４级为主根及根茎部病斑面积超过５０％，全株枯死。根据病害严重度分级标准
计算不同处理的病情指数和防治效果［１９］。
１．８　数据统计分析
嗜铁素合成含量为平均值±ＳＥ，使用ＳＰＳＳ１６．０
进行统计分析，多重比较采用ＬＳＤ法。
２　结果与分析
２．１　芽孢杆菌的分离与鉴定
从试验田种植的紫花苜蓿根际土中分离出２株芽
孢杆菌菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２，用ＰＤＡ培养基纯化
后观察菌落形态，ＣＹＹ６菌落扁平，圆形或不规则形，
边缘裂片状；ＣＹＹ４２菌落圆形，边缘整齐或啮蚀状。
２菌株在接触酶反应、柠檬酸盐利用、葡萄糖产酸、明
胶液化实验中均呈阳性；ＣＹＹ６在淀粉水解、ＶＰ测
定、厌氧生长实验中均呈阳性，而ＣＹＹ２０均呈阴性；
ＣＹＹ６在ｐＨ５．５和９．０及５％和７％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ的
培养基上均能生长，而ＣＹＹ４２均不能生长（表１）。
将已测得的ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２菌株的１６ＳｒＤＮＡ序
列与相近种属的１６ＳｒＤＮＡ 进行比对（图１），菌株
ＣＹＹ６序列与犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀犻犳狅狉犿犻狊ｓｔｒａｉｎＫＩＢＧＥＩＢ４
表１　菌株生理生化特征鉴定
犜犪犫犾犲１　犘犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊
狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犾犻狊狅犾犪狋犲狊
实验项目Ｔｅｓｔｉｔｅｍｓ
菌株 Ｔｅｓｔｓｔｒａｉｎｓ
ＣＹＹ６ ＣＹＹ４２
接触酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋
ｐＨ５．５生长 ＧｒｏｗｔｈａｔｐＨ５．５ ＋ －
ｐＨ９．０生长 ＧｒｏｗｔｈａｔｐＨ９．０ ＋ －
５％ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈａｔ５％ ＮａＣｌ ＋ －
７％ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈａｔ７％ ＮａＣｌ ＋ －
淀粉水解 Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｓｔａｒｃｈ ＋ －
柠檬酸盐利用Ｃｉｔｒａｔｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋ ＋
ＶＰ测定 ＶＰｔｅｓｔ ＋ －
葡萄糖产酸 Ｇｌｕｃｏｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇａｃｉｄ ＋ ＋
明胶液化 Ｇｅｌａｔｉｎｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ＋ ＋
厌氧生长Ａｎａｅｒｏｂｉｃｇｒｏｗｔｈ ＋ －
　注：＋，阳性；－，阴性。
　Ｎｏｔｅ：＋，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；－，Ｎｅｇａｔｉｖｅ．
８９ 草　业　学　报 第２４卷
图１　１６犛狉犇犖犃基因序列系统发育树
犉犻犵．１　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犱犲狉犻狏犲犱犳狉狅犿１６犛狉犇犖犃犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犆犢犢６犪狀犱犆犢犢４２
　分支点上的数字为自展支持率（％）。括号内序号为菌株在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的登录号。标尺代表序列分歧度。Ｎｕｍｂｅｒｓａｔｅａｃｈｂｒａｎｃｈｐｏｉｎｔｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｂｏｏｔｓｔｒａｐ（％）．ＴｈｏｓｅｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓａｒｅｔｈｅＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ．Ｂａｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ．
（２８１３３５８７８）的同源性达９９％，菌株ＣＹＹ４２序列
图２　分离菌株嗜铁素合成量
犉犻犵．２　犛犻犱犲狉狅狆犺狅狉犲狊狔狀狋犺犲狊犻狊狅犳犻狊狅犾犪狋犲狊
　　　表示显著水平（犘＜０．０５）。ｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌ（犘＜
０．０５）．
与犅狉犲狏犻犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊ｓｔｒａｉｎＭＨ１（１５０４１９３１９）的
同源性达９７％，再结合其菌落形态及生理生化特征
初步鉴定ＣＹＹ６为地衣芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀
犻犳狅狉犿犻狊）、ＣＹＹ４２为短短芽孢杆菌（犅狉犲狏犻犫犪犮犻犾犾狌狊
犫狉犲狏犻狊）。
２．２　分离菌株嗜铁素合成能力分析
菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２在ＣＡＳ检测培养基上
均能够形成橘黄色透明晕圈，说明两菌株都具有嗜
铁素合成能力。对两菌株的嗜铁素合成能力进行定
量测定，一般Ａ／Ａｒ值越小，其合成嗜铁素的能力越
强。如图２所示，ＣＹＹ６嗜铁素合成量为（２．５７７±
０．０９１），而 ＣＹＹ４２嗜铁素合成量为（１．０６７±
０．００６），由此可知ＣＹＹ４２合成嗜铁素能力显著强于ＣＹＹ６（犘＜０．０５）。
２．３　分离菌株抑菌能力测定
在ＰＤＡ平板上，菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２对尖孢镰刀菌的生长都有拮抗作用。如图３可知，菌株ＣＹＹ４２对
尖孢镰刀菌的抑制效果好于ＣＹＹ６，抑菌带更加明显。ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２的抑菌率分别为４９．３％和５６．３％。
菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长均有明显的抑制作用。在光学显微镜下观
察，对照组（ＣＫ）菌丝大量生长，边缘光滑，可见清晰的分支结构，并伴有大量孢子生成。与对照相比，菌株ＣＹＹ
６处理过的尖孢镰刀菌菌丝明显减少，菌丝体扭曲、断裂，且孢子数量也明显减少；ＣＹＹ４２处理过的菌丝断裂、破
碎，细胞壁溶解、原生质泄露，菌丝量和孢子量也明显减少（图４）。
分离菌株生防能力的盆栽试验表明，仅破坏植株根部不接菌（图５ａ），植株根、茎、叶均生长良好，无发病症
状；仅接种尖孢镰刀菌的紫花苜蓿（图５ｂ），最初几天部分植株叶片开始逐渐枯萎，１０ｄ后几乎全部发病，植株根
部发黑、腐烂、死亡，茎和叶几乎全部枯死，病情指数达到８６．８８％；在用菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２接种１０ｄ后，发
病症状有所减轻，植株根部出现黑褐色斑点，但并未腐烂、死亡，根部生长良好，植株少量叶片干枯，但茎和叶整体
长势良好，病情指数分别为３６．８８％和３１．２５％（图５ｃ，ｄ）。由此可见，与仅接种尖孢镰刀菌的对照相比，菌株
ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２都有防病效果，相对防效分别为５７．５５％和６４．０３％。
９９第９期 刘莎莎　等：两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究
图３　分离菌株对尖孢镰刀菌的拮抗作用
犉犻犵．３　犃狀狋犪犵狅狀犻狊犿狅犳犻狊狅犾犪狋犲狊犪犵犪犻狀狊狋犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿
ａ．对照，ｂ．ＣＹＹ６，ｃ．ＣＹＹ４２。ａ．Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｂＣＹＹ６，ｃ．ＣＹＹ４２．
图４　尖孢镰刀菌菌丝及孢子受拮抗菌作用后的异常形态（４０×）
犉犻犵．４　犃犫狀狅狉犿犪犾犳狅狉犿狊狅犳狋犺犲犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿犿狔犮犲犾犻犪犪狀犱狊狆狅狉犲狊犻狀犺犻犫犻狋犲犱犫狔狋犺犲犅犪犮犻犾犾狌狊狊狆狆．犻狀犘犇犃犻狀狏犻狋狉狅（４０×）
　ａ．正常尖孢镰刀菌菌丝及孢子，ｂ．受ＣＹＹ６抑制的菌丝和孢子，ｃ．受ＣＹＹ４２抑制的菌丝和孢子。ａ．Ｎｏｒｍａｌｍｙｃｅｌｉａａｎｄｓｐｏｒｅｓｏｆ犉．狅狓狔狊狆狅
狉狌犿，ｂ．Ａｂｎｏｒｍａｌｍｙｃｅｌｉａａｎｄｓｐｏｒｅｓｏｆ犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＣＹＹ６，ｃ．Ａｂｎｏｒｍａｌｍｙｃｅｌｉａａｎｄｓｐｏｒｅｓｏｆ犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＣＹＹ４２．
３　讨论
图５　分离菌株对苜蓿根腐病的防治作用
犉犻犵．５　犅犻狅犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉狅狅狋狉狅狋犻狀犪犾犳犪犾犳犪狑犻狋犺犫犪犮狋犲狉犻犪犾犻狊狅犾犪狋犲狊
　　　ａ．破坏根部，加无菌水；ｂ．接种尖孢镰刀菌，加无菌水；ｃ．接种尖孢
镰刀菌且施用 ＣＹＹ６；ｄ．接种尖孢镰刀菌且施用 ＣＹＹ４２。ａ．Ａｌ
ｐｌａｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒ；ｂ．Ａｌｐｌａｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ犉．狅狓狔狊狆狅
狉狌犿ａｌｏｎｅ；ｃ．Ａｌｐｌａｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ａｎｄｉｓｏｌａｔｅｓＣＹＹ
６；ｄ．Ａｌｐｌａｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ａｎｄｉｓｏｌａｔｅｓＣＹＹ４２．　
在可持续农业生产中，应用芽孢杆菌防治植物病
害是一个极具潜力的途径［２１］。本研究从紫花苜蓿根
际土中分离出地衣芽孢杆菌ＣＹＹ６和短短芽孢杆菌
ＣＹＹ４２，评价了其对尖孢镰刀菌的拮抗作用及由其引
起的紫花苜蓿根腐病的防治效果，结果表明，两菌株显
著减轻了人工接种尖孢镰刀菌导致的紫花苜蓿根腐病
的病情。
尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，
既可在土壤中存活又能侵染植物。国内外已报道的受
尖孢镰刀菌危害严重的植物包括苜蓿、甜椒（犆犪狆狊犻
犮狌犿犳狉狌狋犲狊犮犲狀狊）、花生（犃狉犪犮犺犻狊犺狔狆狅犵犪犲犪）、西瓜（犆犻狋
狉狌犾犾狌狊犾犪狀犪狋狌狊）、香蕉（犕狌狊犪狆犪狉犪犱犻狊犻犪犮犪）、高粱（犛狅狉
犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）等［５，２２２４］。在平板对峙实验中，菌株
ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２均能有效抑制尖孢镰刀菌生长，并
产生抑菌带，抑菌率分别达到４９．３％和５６．３％。两菌
株表现出的拮抗活性可能是由于其产生的抗真菌代谢
００１ 草　业　学　报 第２４卷
物的作用，如嗜铁素，其通过螯合反应，释放出难溶性的铁，形成嗜铁素－铁螯合物，并将铁转移到体内，以满足微
生物自身的生长需求，从而降低环境中的铁浓度，由此病原菌因缺铁而不能正常的生长繁殖，进而控制植物病害
发生［２５］。本研究中，菌株ＣＹＹ４２的嗜铁素合成能力强于ＣＹＹ６，且菌株ＣＹＹ４２对尖孢镰刀菌的拮抗效果也
比ＣＹＹ６好，这一研究结果与Ｄｕｉｊｆｆ等［２６］和许煜泉等［２７］发现的现象相似，细菌合成嗜铁素的含量与拮抗病原菌
的能力有关，且呈正相关［２８］。菌株ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长有明显的拮抗作
用，Ｐｕａｌ等［２９］和谢栋等［３０］也表明芽孢杆菌能够使真菌菌丝畸形、断裂，细胞壁溶解，孢子不萌发，这可能与拮抗
菌分泌的抗菌肽类或蛋白类物质有关。芽孢杆菌分泌的几丁质酶具有降解几丁质的能力，而几丁质是病原真菌
细胞壁的主要结构组成，细菌菌株通过溶解植物病原真菌细胞壁来发挥拮抗作用［２３］，因此几丁质酶可能是生物
防治植物病原真菌最重要的物质，Ｂａｓｈａ和Ｕｌａｇａｎａｔｈａｎ［３１］也表现，新月弯孢菌（犆狌狉狏狌犾犪狉犻犪犾狌狀犪狋犪）菌丝的断裂
和细胞壁的溶解与芽孢杆菌菌株分泌的几丁质酶相关。
生防芽孢杆菌对植物病害的防治机制主要包括拮抗、竞争、诱导植物抗性等多种方式［２１］。无生防菌株时，病
原真菌依靠植物提供的生存条件进行生长繁殖，有生防菌株存在时，生防菌株与病原真菌竞争，争夺有利生态位，
形成菌膜屏障，阻止病原真菌进一步侵染植物［１９］。Ｌｅｅ等［３２］筛选到的地衣芽孢杆菌对番茄灰霉病具有显著防治
效果，张璐等［２０］从黄瓜根际土分离到的短短芽孢杆菌ＤＳ１对苗期黄瓜枯萎病的生防效果显著。虽然已经报道
了地衣芽孢杆菌和短短芽孢杆菌对一些植物病害有生防活性，但本研究首次报道地衣芽孢杆菌和短短芽孢杆菌
能显著减轻由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病病情。李文英等［２３］发现香蕉根际芽孢杆菌ＰＡＢ１和ＰＡＢ２对
由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防效为１８．８％和４６．９％。本研究也表明，从紫花苜蓿根际筛选出的地衣芽孢
杆菌菌株ＣＹＹ６和短短芽孢杆菌菌株ＣＹＹ４２对由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相对防效分别达到了
５７．５５％和６４．０３％。
本研究筛选出２株紫花苜蓿根际芽孢杆菌ＣＹＹ６和ＣＹＹ４２，它们对由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病
都表现出生防效果，这可能是嗜铁素、蛋白类或抗菌肽类物质等多种抗真菌代谢物共同作用的结果，其抗菌物质
和抑菌机理的确定还有待于深入研究。由于本研究是在盆栽条件下进行的，紫花苜蓿的生长条件及生长期与大
田存在一定差异，其实际的生防效果尚待后续田间试验验证。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｉｎｓ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰａｐｅｒｓ，ＵＡＳＶＭＢｕｃｈａｒｅｓｔ，ＳｅｒｉｅｓＦＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１２，１６：６７７２．
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狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１０，３７（４）：５７５５８０．
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ｗｉｌｔｄｉｓｅａｓｅｏｆｂａｎａｎａｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１２，３９（２）：２３４２４２．
［２４］　ＩｄｒｉｓＨＡ，ＬａｂｕｓｃｈａｇｎｅＮ，ＫｏｒｓｔｅｎＬ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆ犉狌狊犪狉犻狌犿ｒｏｏｔａｎｄｃｒｏｗｎｒｏｔｏｆｓｏｒ
ｇｈｕｍｉｎＥｔｈｉｏｐｉａ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ，２００７，４０（１）：９７１０６．
［２５］　ＹｕＸＭ，ＺｈｅｎｇＦＣ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｏｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｏｎａｎｄｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｃｏｎｔｒｏｌ．
ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，２００７，２３（８）：５０７５１０．
［２６］　ＤｕｉｊｆｆＢＪ，ＭｅｉｊｅｒＪＷ，ＢａｋｋｅｒＰＡＨＭ，犲狋犪犾．Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎｆｏｒｉｒｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｓｕｐ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犉狌狊犪狉犻狌犿ｗｉｌｔｏｆｃａｒｎａｔｉｏｎｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊ｓｐｐ．ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９３，９９（５
６）：２７７２８９．
［２７］　ＸｕＹＱ，ＧａｏＨ，ＴｏｎｇＧＬ，犲狋犪犾．Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔ犘犻狉犻犮狌犾犪狉犻犪狅狉狔狕犪犲ｂｙ犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊
ＪＫＤ２．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＣｈｉｎａ，１９９９，２６（３）：１８０１８３．
［２８］　ＣｈｅｎＳＹ，ＣｈｅｎＺＹ，ＺｈａｎｇＲＳ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａａｇａｉｎｓｔ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻．ＡｃｔａＰｈｙｔｏ
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［２９］　ＰａｕｌＤＳ，ＪｏａｎｎｅＭ Ｗ，ＲｏｂｅｒｔｏＫ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ犛狋狉犲狆狋狅犿狔犮犲狊犮狅犲犾犻犮狅犾狅狉ａｎｄ犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊：ｒｏｌｅｏｆｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓｉｎ
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３０１第９期 刘莎莎　等：两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究