全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（４）：５６５ ５７０
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０４０５６５０６
红椿 ＳＳＲＰＣＲ体系建立和多态性引物筛选
湛 欣，鲁好君，赵 帅，陈晓阳，邓小梅
（华南农业大学 林学与风景园林学院／广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 ５１０６４２）
收稿日期：２０１５０７０６
基金项目：国家林业局公益性行业专项（２０１００４０２０）。
作者简介：湛 欣（１９８８—），男，植物学硕士研究生；Ｅｍａｉｌ：ｚｘ０２５６＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者：邓小梅（１９６６—），女，教授，博士，主要从事林木遗传育种研究；Ｅｍａｉｌ：ｄｘｍｅｉ２００６＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
摘要：［目的］本研究旨在建立红椿 ＳＳＲＰＣＲ最佳反应体系，并筛选适于红椿 ＳＳＲ分析的高多态性引物。［方法］
通过Ｌ１６（４
５）正交试验设计，确立红椿ＳＳＲＰＣＲ最佳反应体系；利用优化后的体系对来自楝科植物的１３５对ＳＳＲ引
物，在６个不同的红椿居群中进行扩增，筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。［结
果］（１）１０μＬ基于荧光ｄＵＴＰ的ＳＳＲＰＣＲ体系中包含：１０×ｂｕｆｅｒ１．０μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ·μＬ－１）０．１μＬ，ＭｇＣｌ２（２５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．８μＬ，ｄＮＴＰ（２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．０２５μＬ，荧光 ｄＵＴＰ（１ｎｍｏｌ·μＬ－１）０．０１μＬ，引物（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
０．８μＬ，ＤＮＡ模板４５ｎｇ剩余用ｄｄＨ２Ｏ补足；（２）筛选出２９对能有效扩增的引物，复选后获得了１２对适于红椿ＳＳＲ
分析的高多态性引物。［结论］建立了ＳＳＲＰＣＲ最佳反应体系并筛选出高多态性引物，为红椿的分子标记等遗传学
研究提供了基础。
关键词：ＳＳＲ；红椿；体系优化；引物筛选
中图分类号：Ｓ７９２．９９ 文献标识码：Ａ
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＰｒｉｍｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＳＳＲＰＣＲＲｅａｃｔｉｏｎ
ＳｙｓｔｅｍｆｏｒＴｏｏｎａｃｉｌｉａｔａ
ＺＨＡＮＸｉｎ，ＬＵＨａｏｊｕｎ，ＺＨＡＯＳｈｕａｉ，ＣＨＥＮＸｉａｏｙａｎｇ，ＤＥＮＧＸｉａｏｍｅｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ／ＧｕａｎｇｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ＦｏｒｅｓｔＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＳＳＲＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄｓｃｒｅｅｎｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＳＳＲａｎａｌ
ｙｓｉｓｏｆＴｏｏｎａｃｉｌｉａｔａ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｏｐｔｉｍａｌＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｏｆＴ．
ｃｉｌｉａｔｅ．ＵｓｉｎｇｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍｏｆＳＳＲＰＣＲ，１３５ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｆｒｏｍＭｅｌｉａｃｅａｅｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅｄｉｎ
ｓｉｘｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌ１０μＬｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ１．５μＬ３０ｎｇ·μＬ－１ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ，０．８
μＬ１０ｕｍｏｌ·Ｌ－１ｐｒｉｍｅｒｓ，０．０２５μＬ１０ｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰｓ，０．８μＬ２５ｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｇ２＋，０．１μＬ５Ｕ·μＬ－１ｔａｑ
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．０１μＬ１ｍｏｌ·Ｌ－１ＦｄＵＴＰ，１μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）ａｎｄ５．７６５μＬｄｄＨ２Ｏ．１２
ｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｍｏｎｇ２９ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍｏｆＳＳＲＰＣＲｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｉｎａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＴ．ｃｉｌｉａｔｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｏｏｎａｃｉｌｉａｔｅ；ＳＳＲＰＣＲ；ｓｙｓｔｅｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｉｍｅｒｓｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
楝科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）香椿属（Ｔｏｏｎａ）植物红椿（Ｔｏｏ
ｎａｃｉｌｉａｔａ）又名红楝子，为落叶或近常绿乔木，是国
家二级重点保护野生植物。红椿木材材色红褐色、
花纹美丽，素有“中国桃花心木”之称，生长迅速、适
应性强、分布广，是珍贵的速生用材树种［１－２］。但
是，红椿天然林自然更新缓慢，人为破坏严重，已濒
林 业 科 学 研 究 第２９卷
临灭绝，在广西、云南、贵州、江西、浙江等省均只剩
少量零星分布的天然林［３－４］。了解红椿遗传多样
性，是了解其濒危原因、制定有效的保护措施和良种
选育的基本前提。
微卫星标记是基于 ＤＮＡ长度多态性的检测技
术，具有共显性、重复性好、多态性高等特点，已在遗
传多样性检测、遗传图谱的构建、基因定位、分子标
记辅助育种等研究领域得到了广泛的应用［５－６］。刘
军［６－７］等利用改良的链亲和磁珠法设计并筛选了８
对毛红椿ＳＳＲ引物，对毛红椿遗传多样性进行了评
价。但其开发的引物数量较少、多态性有限，经验证
后仅有４对 ＳＳＲ引物在红椿群体中具备高的多态
性，无法满足红椿进一步的指纹图谱构建及分子育
种等工作。
本研究旨在建立红椿的 ＳＳＲＰＣＲ反应体系，并
选适于红椿ＳＳＲ分析高多态性引物。
１ 材料和方法
１．１ 试验材料
２０１３年５—１０月在安徽泾县、江西井冈山、湖
北恩施、四川德昌、云南保山、广西西林６个红椿天
然居群（表１）分单株采集红椿大树中上部的成熟叶
片。每个居群里随机选择３个单株叶片用于建立红
椿的ＳＳＲＰＣＲ反应体系及引物筛选。采到的新鲜
叶片迅速用硅胶干燥后带回实验室，于 －８０℃低温
冰箱保存。
１．２ 引物及试剂
从已公布的桃花心木、毛红椿等楝科植物文献
资料中选择１３５对 ＳＳＲ引物（表２），由深圳华大基
因科技服务有限公司合成。试验中 Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ、
ＭｇＣｌ２、１０×ＰＣＲＢｕｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｆｒｅｅ）均购自ＴａＫａＲａ公
司，荧光ｄＵＴＰ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。
１．３ 红椿ＤＮＡ的提取
采用Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＴＭＨＰＰｌａｎｔＤＮＡｋｉｔ试剂盒（Ｏ
ｍｅｇａ）提取红椿叶片基因组 ＤＮＡ，具体操作参考试
剂盒说明书。利用１％的琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ
质量，ＴｈｅｒｍｏＮＡＮＯＤＲＯＰ１０００核酸仪（Ｔｈｅｒｍｏ公
司）测定 ＤＮＡ的 Ａ２６０／２８０、Ａ２６０／２３０值及浓度，将各红椿
样品ＤＮＡ浓度调至３０ｎｇ·μＬ－１作为工作液并置于
－２０℃冰箱中备用。
１．４ 红椿ＳＳＲＰＣＲ反应体系的优化
本试验采用基于荧光 ｄＵＴＰ的 ＳＳＲＰＣＲ体系，
使用低浓度ｄＮＴＰ和降落ＰＣＲ程序［７］，在荧光ｄＵＴＰ
（１ｎｍｏｌ·μＬ－１）０．０１μＬ，ｄＮＴＰ（２００ｍｍｏｌ·μＬ－１）
０．０２５μＬ的基础上建立红椿ＳＳＲＰＣＲ反应体系，针
对Ｔａｑ酶、Ｍｇ２＋、引物和模板 ＤＮＡ等４个因素进行
Ｌ１６（４
５）正交试验，第５列作空白对照（表２）。引物
ＴＣ１７为正交试验所用引物。１０μＬＰＣＲ反应体系
中，各组除添加不同处理外，还加入 １μＬ１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｅｒ，剩余用ｄｄＨ２Ｏ补足至１０μＬ。用ＰＣＲ基因扩
增仪（ＭｙＣｙｌｅｒ，ＢｉｏＲｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）扩增，降落ＰＣＲ反
应程序为 ９４℃预变性 ４ｍｉｎ，然后进行 １９个循环
（９４℃变性０．５ｍｉｎ，６６℃退火０．５ｍｉｎ，退火温度每
循环降低０．５℃，７２℃延伸０．５ｍｉｎ），再进行２６个循
环（９４℃变性０．５ｍｉｎ，５６℃退火０．５ｍｉｎ，７２℃延伸
０．５ｍｉｎ），最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．５ 红椿ＳＳＲ引物的筛选
利用优化后得到的最佳 ＰＣＲ体系，以待测的６
个红椿居群（表１）的叶片基因组 ＤＮＡ作为模板，
将１３５对 ＳＳＲ引物（表２）的扩增产物通过 ２％的
琼脂糖凝胶电泳进行有效引物筛选，再取有效引物
的 ＰＣＲ产物 ２μＬ，加 ７．８μＬ超纯甲酰胺和 ０．２
μＬＧＳ５００ＬＩＺ内标混合均匀后９５℃变性５ｍｉｎ，并
立即在 ４℃降温。变性后的 ＰＣＲ产物在 ＡＢＩ
３１３０ｘｌ遗传分析仪（ＡＢＩ公司）上进行分型，分型
结果采用 ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ４．０软件进行数据分析，以
检测其多态性。
表１ ６个红椿居群的地理位置和编号
居群 编号 纬度／Ｎ 经度／Ｅ 海拔／ｍ 采样数／棵 采样时间
安徽泾县 ＪＸ ３０°３１′ １１８°３６′ ３７０ １５ １０月
江西井冈山 ＪＧ ２６°４４′ １１４°１７′ ３８０ ２４ １０月
湖北恩施 ＥＳ ３０°１７′ １０９°２８′ ９８０ １６ １０月
四川德昌 ＤＣ ２７°２４′ １０２°１０′ １３００ ２７ ７月
云南保山 ＢＳ ２４°５９′ ９９°０１′ １４０１ ２４ ５月
广西西林 ＸＬ ２４°２９′ １０５°５０′ ８００ ２５ ６月
６６５
第４期 湛 欣，等：红椿ＳＳＲＰＣＲ体系建立和多态性引物筛选
表２ 楝科植物１３５对ＳＳＲ引物信息表
引物来源 引物／对 引用文献 编号
Ｋｈａｙａｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ １２ ［８］ ＴＣ１ ＴＣ１２
Ｃａｒａｐａｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ ４ ［９］ ＴＣ１３ ＴＣ１６
Ｔｏｏｎａｃｉｌｉａｔｅ．Ｖａｒ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ １８ ［１０］ ＴＣ１７ ＴＣ３４
Ｓｗｉｅｔｅｎｉａｍａｃｒｏｐｈｙｌａ ５ ［１１］ ＴＣ３５ ＴＣ３９
Ｋｈａｙａｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ １２ ［１２］ ＴＣ４０ ＴＣ５１
Ｃａｂｒａｌｅａｃａｎｊｅｒａｎａ ８ ［１３］ ＴＣ５２ ＴＣ５９
Ｓｗｉｅｔｅｎｉａｋｕｍｉｌｉｓ １０ ［１４］ ＴＣ６０ ＴＣ６９
Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａｉｎｄｉｃａ ７ ［１５］ ＴＣ７０ ＴＣ７６
Ｃｅｄｒｅｌａｏｄｏｒａｔａ． ９ ［１６］ ＴＣ７７ ＴＣ８５
Ｋｈａｙａｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ １１ ［１７］ ＴＣ８６ ＴＣ９６
Ｍｅｌｉａｃｅａｅｆａｍｉｌｙ ４ ［１８］ ＴＣ９７ ＴＣ１００
Ｓｗｉｅｔｅｎｉａｍａｃｒｏｐｈｙｌａ ９ ［１９］ ＴＣ１０１ ＴＣ１０９
ＭｅｌｉａｖｏｌｋｅｎｓｉＧｕｒｋｅ ２５ ［２０］ ＴＣ１１０ ＴＣ１２４
Ｇｕａｒｅａｇｕｉｄｏｎｉａ １１ ［２１］ ＴＣ１２５ ＴＣ１３５
表３ ＳＳＲＰＣＲ正交实验设计（Ｌ１６）
处理
因素
Ｔａｑ酶／
（Ｕ·μＬ－１）
引物／
（μｍｏｌ·μＬ－１）
模板ＤＮＡ／
（ｎｇ·μＬ－１）
Ｍｇ２＋／
（ｍｍｏｌ·μＬ－１）
１ ０．０５ ０．４ １．５ １
２ ０．０５ ０．６ ３ １．５
３ ０．０５ ０．８ ４．５ ２
４ ０．０５ １ ６ ２．５
５ ０．０７５ ０．４ ３ ２
６ ０．０７５ ０．６ １．５ ２．５
７ ０．０７５ ０．８ ６ １
８ ０．０７５ １ ４．５ １．５
９ ０．１ ０．４ ４．５ ２．５
１０ ０．１ ０．６ ６ ２
１１ ０．１ ０．８ １．５ １．５
１２ ０．１ １ ３ １
１３ ０．１２５ ０．４ ６ １．５
１４ ０．１２５ ０．６ ４．５ １
１５ ０．１２５ ０．８ ３ ２．５
１６ ０．１２５ １ １．５ ２
２ 结果与分析
２．１ 红椿基因组ＤＮＡ的提取及质量检测
使用Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＴＭ ＨＰＰｌａｎｔＤＮＡｋｉｔ试剂盒提
取的红椿基因组ＤＮＡ带型清晰、完整性好、浓度高、
无杂带及拖尾现象，电泳结果如图１。使用分光光
度计检测其Ａ２６０／２８０比值均在１．７ １．９之间，Ａ２６０／２３０
值在２．０ ２．２，证明所提取的ＤＮＡ中蛋白质、糖及
酚类物质的污染较低。所提 ＤＮＡ浓度在１５０ｎｇ·
μＬ－１以上，经稀释至３０ｎｇ·μＬ－１后可满足 ＰＣＲ反
应要求。
２．２ 红椿ＳＳＲＰＣＲ体系优化结果
正交试验的 ＳＳＲＰＣＲ产物琼脂糖电泳结果如
图２所示，１６个处理中２＃、３＃、４＃、５＃、６＃、８＃、１５＃、１６
注：各ＤＮＡ样品编号见表１；图左侧数字为条带大小，
例如５０００ｂｐ，３０００ｂｐ等，下同。
图１ 红椿ＤＮＡ琼脂糖电泳检测。
＃均有比较清晰的条带，清晰度依次为４＃、１５＃、３＃、８
＃、２＃、１６＃、１０＃、６＃、５＃、１２＃、９＃；处理１＃、７＃、１４＃结果
均无条带显示。以产物主带清楚度，非特异扩增为
标准对结果进行打分评判，效果最好的计最高分１６
分，最差的计最低分１分，１６个处理依次打分为：１、
１２、１４、１６、７、８、１、１０、５、８、３、５、３、１、１５、９。对这 １６
个组合的评分数据应用 ＳＰＳＳ１９．０软件进行方差分
析，根据 Ｆ值的大小判断各因素对反应效果的影响
程度依次为：Ｍｇ２＋＞引物 ＞Ｔａｑ酶 ＞ＤＮＡ浓度。由
于处理４和处理１５的Ｔａｑ聚合酶或模板ＤＮＡ用量
过高，结合成本等因素考虑，最终确定处理３为最优
反应体系，即１０μＬ基于荧光 ｄＵＴＰ的 ＳＳＲＰＣＲ体
系中包含１０×ｂｕｆｅｒ１．０μＬ，ＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ·
μＬ－１）０．１μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·μＬ
－１）０．８μＬ，
ｄＮＴＰ（２００ｍｍｏｌ·μＬ－１）０．０２５μＬ，荧光 ｄＵＴＰ（１
ｎｍｏｌ·μＬ－１）０．０１μＬ，引物（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．８
μＬ，ＤＮＡ模板４５ｎｇ，剩余用ｄｄＨ２Ｏ补足。
图２ 红椿ＳＳＲＰＣＲ正交试验电泳
表４ ＳＳＲＰＣＲ正交实验方差分析
变异来源 自由度 方差 均方 Ｆ
模型 １２ ３７１．５０ ３０．９６ １１．２６
Ｔａｑ酶 ３ ６７．２５ ２２．４２ ８．１５
引物浓度 ３ ７６．２５ ２５．４２ ９．２４
ＤＮＡ浓度 ３ ４１．２５ １３．７５ ５．００
Ｍｇ２＋浓度 ３ １８６．７５ ６２．２５ ２２．６４
误差 ３ ８．２５ ２．７５
总计 ２７ ７５１．２５
矫正总计 １５ ３７９．７５
注：表示ｐ≤０．０１差异极显著，表示ｐ≤０．０５差异显著。
７６５
林 业 科 学 研 究 第２９卷
２．３ 最佳优化体系在引物筛选中的应用
利用优化的 ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，以不同来源
的６个居群的红椿叶片基因组 ＤＮＡ作为模板，对来
自楝科不同植物的１３５对ＳＳＲ引物进行筛选。扩增
后产物先用 ２％琼脂糖电泳进行有效扩增的初筛
（图３），筛选出能扩增出单一清晰的目标条带的有
效引物。再取初筛后的引物 ＰＣＲ扩增产物，经变性
后在ＡＢＩ３１３０ｘｌ遗传分析仪上进行分型（图４），筛
选具有多态性的引物，以此也证明该体系具有较好
的稳定性和可重复性。
注：所用ｍａｋｅｒ为１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒＭａｋｅｒ，条带大小依次为：１００ｂｐ，２００ｂｐ，
３００ｂｐ，４００ｂｐ，５００ｂｐ，６００ｂｐ，７００ｂｐ，８００ｂｐ，９００ｂｐ，１０００ｂｐ，１５００ｂｐ。
图３ 初筛后部分有效引物的琼脂糖电泳结果。
图４ 部分具有多态性的引物的电泳结果
经２％琼脂糖电泳进行有效扩增的初筛后，共
获得引物２９对，占引物总数的２１．５％。在遗传分析
仪的分型结果中，共选出１２对荧光信号峰值高、稳
定且具有丰富多态性的引物，其产生的多态性标记
效率为８．８８％，占初筛引物的４１．４％。筛选出的１２
对引物具体情况如表５。
８６５
第４期 湛 欣，等：红椿ＳＳＲＰＣＲ体系建立和多态性引物筛选
表５ 红椿基因组１２个ＳＳＲ位点的扩增引物
编号 上游引物 下游引物 重复单元 片段大小／ｂｐ
ＴＣ１７ ＧＴＧＧＣＧＴＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＡＡＣ ＣＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧ （ＧＡ）ｎ １４４～１６０
ＴＣ１８ ＣＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＣＴＡＧ ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＣ （ＣＴＣＴＴ）ｎ １１９～１８４
ＴＣ２０ ＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣ ＧＡＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡ （ＡＧ）ｎ １８６～２３２
ＴＣ２６ ＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＡ ＧＡＴＴＡＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴ （ＧＡ）ｎ ２９５～３３１
ＴＣ２９ ＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＧＧ ＴＧＴＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＣ （ＴＣ）ｎ ２３１～２７３
ＴＣ５１ ＡＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴ ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＡＣＧＧ （ＧＣＴ）ｎ １０１～１１９
ＴＣ７８ ＣＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣ ＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＡＣ （ＧＡ）ｎ １０５～１２７
ＴＣ８１ ＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡ ＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＧＣＡＴＴ （ＧＡ）ｎ（ＡＧ）ｎＧ（ＧＡ）ｎ １６７～１９５
ＴＣ８３ ＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＧＡＴＡＧＣ ＧＡＧＧＴＴＣＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧ （ＧＡ）ｎ（ＣＡ）ｎ １４５～１７７
ＴＣ９７ ＧＡＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＧＡＧＧ ＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＣ （ＣＴ）ｎ ２０８～２８４
ＴＣ９８ ＴＣＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴ ＴＴＡＴＴＴＣＧＴＡＣＣＣＴＴＣＧＣＴＣ （Ｔ）ｎ １７８～１９４
ＴＣ１２２ ＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＧ ＧＡＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡ （ＣＡ）ｎ １５３～１７１
３ 讨论
在 ＰＣＲ反应体系中加入荧光 ｄＵＴＰ后，其与
ｄＮＴＰ中的ｄＴＴＰ竞争结合到ＰＣＲ产物中，再利用测
序仪进行ＳＳＲ自动分型是比较经济且高效准确的方
法［２２］，已成功应用于蜥蜴、三叶杨等多个物种的研
究中［２３－２５］。本研究采用低浓度 ｄＮＴＰ和降落 ＰＣＲ
程序来提高荧光信号和分型的准确性［７］，同时也有
效减少了工作量。在此基础上对 ＰＣＲ扩增反应中
的Ｔａｑ酶、Ｍｇ２＋、引物以及ＤＮＡ模板量，利用正交试
验设计进行了优化，得到一套能够稳定扩增且经济、
可靠的基于荧光 ｄＵＴＰ的 ＳＳＲＰＣＲ体系，为今后红
椿遗传多样性分析及指纹图谱的构建等研究提供了
有力的支持。通过琼脂糖凝胶电泳直观分析，得出
红椿ＳＳＲＰＣＲ反应体系的最佳处理为３号。正交
试验方差分析表明，Ｍｇ２＋对红椿 ＳＳＲＰＣＲ体系具有
最大的影响，Ｍｇ２＋是 Ｔａｑ聚合酶的激活剂，Ｍｇ２＋浓
度能直接影响反应的特异性和产率［２６］，浓度过低，
酶活力不够，会导致扩增产物减少，过高则非特异性
扩增产物增多，因此在体系优化时需特别注意 Ｍｇ２＋
的用量。
ＳＳＲ是一种优秀的分子遗传标记，但 ＳＳＲ标记
应用需根据物种已知ＤＮＡ序列设计特异引物，才能
进行ＰＣＲ扩增。对于大多数物种而言，目前获得的
基因组序列还非常有限或者根本没有［２７］。种间转
移扩增是寻找 ＳＳＲ位点最简单最省时的方法之
一［２８］。一般认为，ＳＳＲ引物在同科或更近物种间具
有适用性［５］，引物可成功在物种间扩增且有相当高
的多态性［２７］。本研究利用已公布的毛红椿、桃花心
木等楝科植物的１３５对ＳＳＲ引物，筛选出１２对能在
红椿中稳定扩增且具有高多态性的引物，但产生多
态性标记的效率比较低，仅为８．８８％，这应与本研
究中选用的引物多来自楝科内香椿属外有关，与红
椿有较远的亲缘关系。Ｙａｍａｍｏｔｏ等研究也表明属
间可以共用ＳＳＲ引物，但相对比较困难［２９］。因此在
利用种间转移扩增寻找微卫星位点时，ＳＳＲ引物应
尽量来自同属植物或密切相关的属间，以提高产生
多态性标记的效率。
４ 结论
本研究通过Ｌ１６（４
５）正交试验设计，确立了红椿
ＳＳＲＰＣＲ最佳反应体系：１０μＬ基于荧光 ｄＵＴＰ的
ＳＳＲＰＣＲ体系中包含１０×ｂｕｆｅｒ１．０μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ
·μＬ－１）０．１μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）０．８μＬ，
ｄＮＴＰ（２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．０２５μＬ，荧光 ｄＵＴＰ（１ｎｍｏｌ
·μＬ－１）０．０１μＬ，引物（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．８μＬ，
ＤＮＡ模板４５ｎｇ，剩余用ｄｄＨ２Ｏ补足；利用优化后的
体系对来自楝科植物的１３５对 ＳＳＲ引物，在６个不
同居群的红椿中进行扩增，筛选出２９对能有效扩增
的引物，复选后获得了１２对适于红椿ＳＳＲ分析的高
多态性引物，为红椿后续分子标记等遗传学研究提
供了基础。
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（责任编辑：张 研）
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