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Factors influencing plant regeneration systems in mature embryo culture of Agropyron

影响冰草成熟胚组织培养再生体系频率的因素



全 文 :书影响冰草成熟胚组织培养再生体系频率的因素
徐春波1,米福贵2,王勇2,李兴酉1,赵海霞1
(1.中国农业科学院草原研究所,内蒙古 呼和浩特010010;2.内蒙古农业大学生态环境学院,内蒙古 呼和浩特010018)
摘要:对影响冰草成熟胚组培再生体系频率的2个因素———基因型和脱落酸(ABA)进行了研究,以期为当前冰草
的基因转化提供最佳的再生体系。研究表明,在相同的培养条件下,4个基因型(品种)冰草成熟胚愈伤组织诱导能
力和分化能力有明显的差异,4个基因型中以蒙古冰草成熟胚在愈伤组织诱导、分化等方面表现最佳,愈伤组织诱
导率和分化率分别达到95%和72%,是遗传转化的良好受体材料;继代培养基中附加0.3mg/L脱落酸(ABA)可
以明显改善冰草成熟胚愈伤组织状态,增加胚性愈伤组织率,从而提高分化率。
关键词:冰草;基因型;成熟胚;脱落酸
中图分类号:S543+.903;Q945.39  文献标识码:A  文章编号:10045759(2009)01008006
  冰草属(犃犵狉狅狆狔狉狅狀)为禾本科早熟禾亚科大麦族小麦亚族植物。全世界近百种,我国共有15种,大都分布
于欧亚大陆温寒带区域的草原及沙地上[1]。冰草属牧草是典型的旱生植物,具有适应性强,抗旱耐寒、耐风沙,根
系发达,分枝能力强,返青早,枯黄晚,青绿期长,营养含量丰富,适口性好的特点,是一种饲用价值较高的放牧型
禾草,也是我国北方干旱、半干旱地区改良天然草场和建立人工草地的适宜草种。采用现代生物技术———转基因
工程,将外源基因导入冰草,丰富冰草的基因型,培养优质、高产、多抗新品种是现代冰草育种的发展方向。进行
转基因育种的前提是建立高效而稳定的组织培养再生体系[2]。本试验通过对不同冰草品种成熟胚组织培养技术
的研究,从中筛选出适宜基因转化的优良基因型,并对影响愈伤组织诱导及再生频率的因素进行研究,以期为当
前冰草的基因转化提供最佳的再生体系。
1 材料与方法
1.1 材料
用于试验的材料包括:航道冰草(犃.犮狉犻狊狋犪狋狌犿cv.Fairway)、诺丹冰草(犃.犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿cv.Nordan)、蒙农1
号蒙古冰草(犃.犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿cv.MengnongNo.1)、扁穗冰草(犃.犮狉犻狊狋犪狋狌犿)与沙生冰草(犃.犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿)种间
杂种“蒙农杂种冰草”(犃.犮狉犻狊狋犪狋狌犿×犃.犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿cv.Mengnong)。试验材料来源于内蒙古农业大学牧草种质
资源圃,生长周期为2~5年。
1.2 培养基
基本培养基为 MS(MurashigeandSkoog)培养基[3]。成熟胚愈伤组织诱导培养基:MS+0.2mol/L甘露醇
+2.0mg/L2,4D(2,4二氯苯氧基乙酸,2,4dichlorophenoxyaceticacid);继代培养基:MS+0.2mol/L甘露醇
+2.0mg/L2,4D,同时附加过滤灭菌的 ABA(脱落酸,abscisicacid),其浓度设为:0(对照),0.1,0.3和0.5
mg/L;分化培养基:MS+3.0mg/LKT(糠基氨基嘌呤,kinetin)+1.0mg/LNAA(萘乙酸,naphthaleneacetic
acid);生根培养基:1/2MS(MS中大量元素减半)+0.5mg/LNAA。培养基均含蔗糖(3%)和琼脂(0.7%),pH
值5.8~6.0,常规高压灭菌。
1.3 种子的选择与处理
选取有生活力的饱满种子。将种子在室温下用水浸泡2~4h后,剥去内外稃,再放在湿滤纸上吸胀4h。在
超净工作台上用75%酒精消毒30s,无菌水冲洗数次(至少3次)后用0.2%升汞消毒5min,再用无菌水冲洗数
次(至少3次)。置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中,用解剖针从盾片处挑出胚(尽量少带胚乳)。在剥取胚时适当
80-85
2009年2月
   草 业 学 报   
   ACTAPRATACULTURAESINICA   
第18卷 第1期
Vol.18,No.1
 收稿日期:20080522;改回日期:20080715
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所)资助。
作者简介:徐春波(1979),女,内蒙古扎兰屯人,硕士。Email:xcb972002@163.com
将胚夹破,接种在愈伤组织诱导培养基上,每皿接种50粒成熟胚。
1.4 培养条件
将成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基上,26℃暗培养14d,然后转入继代培养基中培养20d,继代2或3次。
挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化,26℃下16h光照培养,光照强度为3000~4000lx,每
隔30d继代1次。待分化出小苗后转入生根培养基中生根。
1.5 评价指标
出愈率=产生的愈伤组织数/接入的成熟胚数×100%
分化率=分化出芽点的愈伤组织/愈伤组织总数×100%
2 结果与分析
2.1 基因型对成熟胚愈伤组织诱导的影响
将4个品种的冰草成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基上,暗培养14d后统计愈伤组织的出愈率及愈伤状态
(表1)。不同品种的冰草成熟胚在相同的诱导培养基上均能产生愈伤组织,开始出现愈伤组织时间和愈伤组织
形成天数相差不大(表1),但是出愈率和愈伤状态存在着较大差异,蒙古冰草愈伤组织诱导率明显高于其他3个
品种约20%;诺丹冰草的出愈率最低,只有67.5%。另外,从4个冰草品种形成的愈伤组织状态来看,蒙古冰草
愈伤组织状态最佳,其结构紧实、致密,而其他品种愈伤组织大多为白色透明状,松软,有些呈水渍状(图1)。
表1 冰草基因型对成熟胚愈伤组织诱导的影响
犜犪犫犾犲1 犈犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵犲狀狅狋狔狆犲犃犵狉狅狆狔狉狅狀狅狀犻狀犱狌犮犻狀犵犮犪犾狌狊犳狉狅犿犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅
品种
Varieties
接种数
Inoculate
No.
开始出愈时间
Timeofappearing
calus(d)
愈伤组织形成天数
Timeofforming
calus(d)
愈伤组织数
CalusNo.
(块Piece)
出愈率
Percentageofcalus
induction(%)
愈伤组织状态
Morphologyof
calus
航道冰草Fairway 400 4 10 307 76.8 白色,松软,水渍状
White,soft,water
诺丹冰草Nordan 400 4 10 270 67.5 白色,松软,水渍状
White,soft,water
蒙农1号蒙古冰草
MengnongNo.1
400 3 8 380 95.0 白色,较紧实
White,compact
蒙农杂种冰草
Mengnong
400 3 9 296 74.0 白色,松软,水渍状
White,soft,water
图1 4种冰草品种的成熟胚愈伤组织状态
犉犻犵.1 犆犪犾狌狊犮狅狀犱犻狋犻狅狀狅犳犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅狅犳4犃犵狉狅狆狔狉狅狀狏犪狉犻犲狋犻犲狊
A:航道冰草的愈伤组织 ThecalusofFairway;B:诺丹冰草的愈伤组织 ThecalusofNordan;C:蒙农杂种冰草的愈伤组织
ThecalusofMengnong;D:蒙古冰草的愈伤组织 ThecalusofMengnongNo.1
18第18卷第1期 草业学报2009年
2.2 不同基因型冰草成熟胚愈伤组织分化和生根能力
挑选经继代培养后(继代培养基中不含ABA)生长状态好的4种冰草成熟胚愈伤组织转接到分化培养基上,
30d后统计各品种愈伤组织的分化率。结果表明(表2),在相同培养基上,4种冰草成熟胚愈伤组织分化率有明
显差异。蒙古冰草的愈伤组织分化最快,在转入分化培养基中15d后愈伤组织出现芽点(图2),其分化率也是4
个品种中最高的,达到72%;蒙农杂种冰草和航道冰草的愈伤组织分化速度相差不大,在分化培养基上20d愈伤
组织出现芽点,分化率分别为58%和52%;诺丹冰草的愈伤组织分化最慢,近30d愈伤组织才出现芽点,而且分
化率也最低,只有42%。这与不同基因型对成熟胚愈伤组织诱导的差异相一致。将各品种分化出的芽点转入相
同的分化培养基中,基本上都能形成苗,成苗率可达到98%以上,此情况在各品种间没有差异。
待分化出的小苗长到2~3cm高的时候,接种于相同生根培养基上,观察各品种小苗的生根情况。结果表
明,在生根培养基中4个品种的小苗均能生根,所诱导出的根粗壮、发达。
表2 不同基因型冰草成熟胚愈伤组织的分化
犜犪犫犾犲2 犇犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀狆犲狉犮犲狀狋犪犵犲狅犳犮犪犾狌狊犳狉狅犿犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅犳狅狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵犲狀狅狋狔狆犲犃犵狉狅狆狔狉狅狀
品种
Varieties
愈伤组织总数
CalusNo.(块Piece)
分化出芽点的愈伤组织数
SeedlingsorshootNo.(块Piece)
分化率
Differentiationpercentage(%)
航道冰草Fairway 100 52 52
诺丹冰草Nordan 100 42 42
蒙农1号蒙古冰草 MengnongNo.1 100 72 72
蒙农杂种冰草 Mengnong 100 58 58
2.3 ABA对冰草成熟胚愈伤组织状态及愈伤组织
图2 蒙古冰草愈伤组织的分化和再生
犉犻犵.2 犆犪犾狌狊狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀狅犳
犃.犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿犮狏.犕犲狀犵狀狅狀犵犖狅.1
A:蒙古冰草愈伤组织的分化 Thecalusdifferentiationof
MengnongNo.1;B:蒙古冰草再生植株 Theplant
regenerationofMengnongNo.1
分化能力的影响
当成熟胚经过14d的暗培养愈伤组织诱导后,
形成的愈伤组织状态大多为白色透明状,质地较柔
软,有的呈水渍状,这些愈伤组织在分化培养基中很
难分化成苗。将诱导出来的愈伤组织转入添加有不
同浓度ABA的继代培养基上,继代2次,每次20
d,结果见表3。
ABA能够改进成熟胚愈伤组织生长状态并在
一定程度上提高其分化能力(表3)。ABA的这种
作用在各品种间差别不大,添加ABA0.3mg/L可
明显改善各品种成熟胚愈伤组织状态,使其愈伤组
织的结构变得致密,颜色更加鲜亮,表面更加干爽
(图3),促进愈伤组织向胚性愈伤组织转变;不同浓
度的ABA对成熟胚愈伤组织状态的改善影响不同。添加ABA0.1mg/L影响不大;而附加ABA0.5mg/L后,
成熟胚愈伤组织状态反而有不同程度的下降,甚至有些呈粘液状;附加ABA0.3mg/L后对愈伤组织状态有较
大改善,明显增加了愈伤组织的紧实度,继而形成再生小植株。
3 讨论
基因型是影响植物组织培养再生的主要因素之一。不同植物基因型在愈伤组织诱导、分化能力及生根等方
面表现出较大的差异。在本试验中,通过对4种冰草成熟胚组织培养的研究,也证实了不同基因型在相同的培养
条件下,愈伤组织发生、分化能力等方面确实存在着较大差异,其中蒙古冰草不论在愈伤组织形成的速度、出愈
率,还是在分化速度、分化率上都明显高于其他品种,可以作为冰草遗传转化理想受体基因型。
28 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.1
表3 犃犅犃对冰草成熟胚愈伤组织状态及分化的影响
犜犪犫犾犲3 犈犳犳犲犮狋狅犳犃犅犃狅狀犮犪犾狌狊犮狅狀犱犻狋犻狅狀狊犪狀犱犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀犳狉狅犿犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅犃犵狉狅狆狔狉狅狀
品 种
Varieties
ABA浓度
Concentrationof
ABA(mg/L)
愈伤组织总数
CalusNo.
(块Piece)
愈伤组织状态
Morphology
ofcalus
分化出芽点的愈伤组织数
Seedlingsorshoot
No.(块Piece)
分化率
Differentiation
percentage(%)
航道冰草
Fairway
0 50 白色,松软,体积小 White,soft,smalsize 26 52
0.1 50 微黄,较紧实 Microyelow,compact 28 56
0.3 50 淡黄,结构较致密Faintyelow,compact 32 64
0.5 50 淡黄,有些微褐,有些呈 粘 液 状 Faint
yelow,microbrown,mucilage
25 50
诺丹冰草
Nordan
0 50 白色,松软,体积小 White,soft,smalsize 24 42
0.1 50 微黄,较紧实 Microyelow,compact 22 44
0.3 50 淡黄,结构较致密Faintyelow,compact 27 54
0.5 50 淡黄,有些微褐,有些呈 粘 液 状 Faint
yelow,microbrown,mucilage
21 42
蒙农1号蒙古冰草
MengnongNo.1
0 50 白色,较紧实,体积大 White,compact,bigsize 36 72
0.1 50 淡黄,结构紧实Faintyelow,compact 38 76
0.3 50 淡黄,结构松脆,颗粒状 Faintyelow,
looseandcrisp,granular
42 84
0.5 50 淡黄,有些微褐,有些呈 粘 液 状 Faint
yelow,microbrown,mucilage
37 74
蒙农杂种冰草
Mengnong
0 50 白色,松软,体积小 White,soft,smalsize 29 58
0.1 50 微黄,较紧实 Microyelow,compact 31 62
0.3 50 淡黄,结构较致密Faintyelow,compact 35 70
0.5 50 淡黄,有些微褐,有些呈 粘 液 状 Faint
yelow,microbrown,mucilage
30 60
外植体和培养基类型也是影响植物组织培养的
图3 附加犃犅犃前后的蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织状态
犉犻犵.3 犈犳犳犲犮狋狅犳犃犅犃狅狀犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅犮犪犾狌狊犮狅狀犱犻狋犻狅狀狊狅犳
犃.犮狉犻狊狋犪狋狌犿×犃.犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿犮狏.犕犲狀犵狀狅狀犵
A:未加ABA前的蒙农杂种冰草的愈伤组织 Thecalusconditionsof
MengnongbeforeaddABA;B:添加了0.3mg/LABA的蒙农杂种冰
草的愈伤组织 ThecalusconditionsofMengnongaddedABA
重要因素,在植物细胞工程育种技术中,可供选择的
外植体有很多,如根尖、子叶、茎尖、茎段、叶片、花
药、花粉、子房、幼穗、幼胚和成熟胚等[4~14];培养基
的种类有 MS、B5(Gamborg’sB5)等基本培养基,分
别附加不同浓度的生长素和细胞分裂素,如2,4D,
NAA,KT,6BA(6苄 基 腺 嘌 呤;6benzylamin
opuine)等。基因型对植物组织培养的影响与外植
体和培养基有一定的关联。不同基因型利用同一种
外植体进行组织培养时可能表现出某一种基因型有
良好的特性,但利用其他的外植体时又可能是另外
的一种基因型表现良好,以高俊山等[15]选用10个
小麦(犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿)基因型品种进行组织培
养,从愈伤组织诱导率、绿苗分化率等方面比较了以幼穗、花药、幼胚为外植体的培养效果,结果表明,以幼胚为外
植体时,各基因型间差异很小,但以花药为外植体时,各基因型间的差异却非常明显;基因型和培养基之间存在互
作关系,有的基因型在某种培养基上生长情况好一些,而在另一种培养基上则生长情况差一些,而另一种基因型
38第18卷第1期 草业学报2009年
生长情形则相反[16]。
本试验只是以成熟胚为外植体,在相同的培养基条件下,讨论了不同冰草基因型对愈伤组织诱导、愈伤组织
分化能力等方面的影响,至于利用其他外植体和在各种不同的培养基条件下,冰草基因型对组织培养再生的影
响,有待于更进一步的研究和探索。
大量研究证实,脱落酸(ABA)在多种作物组织培养上对胚性愈伤的发生有良好的作用[17,18];Inoue和 Mae
da[19]的试验也说明了在继代培养基中添加ABA能提高植株的再生率;低浓度的ABA对保持愈伤组织的致密、
稳定、结节状结构及提高胚性愈伤组织发生率具有重要作用[20,21];任江萍等[22]的研究表明,附加ABA后能使小
麦幼胚愈伤组织表面几层质地疏松的细胞变得质地致密,有利于基因枪的转化。
本试验表明,冰草成熟胚诱导出来的愈伤组织大多为非胚性愈伤组织,这些愈伤组织在分化培养基中难以分
化成苗,在添加了0.3mg/LABA的继代培养基上继代2或3次后冰草的愈伤组织质量得到了明显改善,愈伤
组织致密紧实,胚性愈伤组织增多,分化能力也有所提高,这与以上研究报道的结果相一致。因此,在继代培养基
中附加适当浓度的ABA可以明显改善冰草的愈伤状态,提高分化能力,这将为冰草组织培养和基因工程的进一
步研究奠定基础。
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犉犪犮狋狅狉狊犻狀犳犾狌犲狀犮犻狀犵狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿狊犻狀犿犪狋狌狉犲犲犿犫狉狔狅犮狌犾狋狌狉犲狅犳犃犵狉狅狆狔狉狅狀
XUChunbo1,MIFugui2,WANGYong2,LIXingyou1,ZHAOHaixia1
(1.GrasslandResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Huhhot010010,China;
2.ColegeofEcologyandEnvironment,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,
Huhhot010018,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Theinfluenceofbothgenotypeandabscisicacid(ABA)onplantregenerationfrequencyofmature
embryosof犃犵狉狅狆狔狉狅狀wasstudiedforestablishinganeffectivesystemforgenetransformation.Plantregener
ationfrommatureembryosthroughdirectcalusinductionwasinvestigatedindifferentspecies.Therewere
differencesinthecapacityofcalusinductionanddifferentiationofmatureembryosbetweendifferentgeno
types.Therewassuitablematerialforcalusinductionfrommatureembryosof犃.犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 whosecalus
initiationfrequencywas95%andcalusdifferentiationfrequencywas72%.Thehighfrequencyofembryogenic
calusformationanddifferentiationwereenhancedinMSsolidmediumwith0.3mg/LABAandthebestgeno
typeforgenetictransformationwas犃.犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犃犵狉狅狆狔狉狅狀;genotypes;matureembryoculture;abscisicacid(ABA
檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵

新书推介:任继周主编《草业大辞典》
由任继周院士主编的《草业大辞典》是全国近百位
《草业大辞典》书封
草业专家学者参编、历时2年的草业专著。该书1333
页,340万字,图文并茂。是从大约8万余词条中依据
草业的四个生产层,三个界面的理论,精选了21091词
条,加以简明科学诠释。其中包括草业文化与草业基
础学科、天然草地、栽培草地、草地保护、草地资源与环
境、草类遗传育种、草坪绿地、草畜产品加工。此书是
对数十年来我国草业科学理论和实践的科学总结,不
仅填补了国内空白,而且在我国草业发展史上具有里
程碑的意义。
出版:中国农业出版社(2008年6月) 定价:280元(含邮资)
汇款户名:兰州大学  开户行:兰州市工行天水路分理处 帐号:2703002409026413243。注:草业学报
邮局汇款地址:兰州市嘉峪关西路768号 《草业学报》编辑部,邮政编码:730020。注:草业大辞典。
注:购书单位或个人汇款后,请将收件人详细地址、姓名、邮编及开发票单位和联系电话,Email或电话告知
联系人。
联系人:《草业大辞典》秘书处林慧龙,未丽 咨询电话:09318910281 犈犿犪犻犾:linhuilong2007@126.com
58第18卷第1期 草业学报2009年