全 文 ：书多浆旱生植物霸王液泡膜犎＋犘犘犪狊犲
基因片段的克隆及序列分析
席杰军，伍国强，包爱科，王锁民
（兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：根据其他植物 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因的保守序列设计一对简并性引物，以霸王叶片总ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ
的方法扩增出 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段并克隆到ＰＵＣｍＴ载体。阳性克隆经ＰＣＲ鉴定后进行测序，序列分析结果表
明，克隆到３个同源的序列片段（８９８ｂｐ），编码２９９个氨基酸；所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ中注册的高等植物 Ｈ＋ＰＰａｓｅ
基因核苷酸序列的同源性均在６９％以上、氨基酸序列的同源性达７８％以上。
关键词：霸王；Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因；克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０１１９０６
盐分和干旱是导致农作物减产的主要非生物因素，土壤中过高浓度的Ｎａ＋会造成植物的生理干旱，扰乱细
胞的离子平衡，导致膜功能失调和代谢活动的减弱，从而抑制生长并最终导致细胞死亡［１］。植物细胞抵御Ｎａ＋
毒害的主要策略有Ｎａ＋的外排和Ｎａ＋的区域化［２］。这２个过程分别由分布在质膜和液泡膜上的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向
转运蛋白实现。已有研究表明，液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白在液泡膜 Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ（ＥＣ３．６．１．３５）和液泡膜
Ｈ＋ＰＰａｓｅ（ＥＣ３．６．１．１）建立的跨液泡膜质子梯度的驱动下，将细胞质中过多的Ｎａ＋区域化到液泡内，从而减轻
了Ｎａ＋对细胞质内的各类代谢酶的危害，同时降低了细胞渗透势，进而提高植物的耐盐性和抗旱性［３，４］。
Ｓａｒａｆｉａｎ等［５］从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中克隆出高等植物的第１个液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因犃犞犘１
（Ｍ８１８９２）。Ｇａｘｉｏｌａ等［６］首次将带有３５Ｓ启动子的犃犞犘１基因转入拟南芥中，与野生型相比，发现ＡＶＰ１蛋白
含量显著增加的转基因植株幼苗在２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ中处理１０ｄ仍能正常生长发育，而野生植株型则出现黄化
枯萎。Ｇｕｏ等［７］将盐地碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）的液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因犛狊犞犘转入拟南芥，也发现超表达犛狊犞犘的
转基因拟南芥细胞中积累包括 Ｎａ＋在内的更多阳离子，其抗旱性和耐盐性也显著提高。Ｂａｏ等［８］将拟南芥
犃犞犘１转入紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪），与野生型相比，发现转基因紫花苜蓿的叶和根中积累了更多的 Ｎａ＋、
Ｋ＋和Ｃａ２＋，叶片具有更低的渗透势，其耐盐性和抗旱性也显著增强。这些研究结果表明，超表达液泡膜 Ｈ＋
ＰＰａｓｅ基因，可将更多的 Ｈ＋从细胞质中泵入液泡中，建立更强的跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶质
进出液泡提供更多的驱动力。这一过程既能降低细胞渗透势并维持细胞离子平衡，又能减轻一些无机离子（比如
Ｎａ＋和Ｃｌ－）对细胞质的毒害，从而使植物在水分亏缺或盐分胁迫下，表现出更强的抗旱性和耐盐性。
迄今为止，已从许多高等植物中克隆到了液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因［９］，然而这些基因几乎都来自抗旱性不强的
模式植物或农作物上。霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿）作为一种典型的荒漠多浆旱生植物［１０］，对中亚的极端
环境如高强度光照、极度干旱、强烈温差和贫瘠的荒漠土壤具有很强的适应性［１１］，因而可能蕴藏着丰富的抗逆基
因资源。然而，有关霸王液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ的研究尚未见报道。鉴于此，本研究以霸王为实验材料，用ＲＴ－ＰＣＲ
（反转录ＲＣＲ，ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ）方法克隆液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段，以期为霸王液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ
全长基因的克隆和及其表达调控的研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
植物材料为４周龄的霸王幼苗，种子来自内蒙古阿拉善左旗巴彦浩特。大肠杆菌菌株犈．犮狅犾犻ＤＨ５α由兰州
第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１１９－１２４
２０１１年２月
收稿日期：２００９１０３０；改回日期：２００９１１２５
基金项目：国家９７３项目（２００７ＣＢ１０８９００），８６３计划项目（２００６ＡＡ１０Ｚ１２６）和国家自然科学基金（３０６７１４８８）资助。
作者简介：席杰军（１９８２），男，河南信阳人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｘｉ＿ｊ０６＠ｌｚｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｍｗａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大学草地农业科技学院农业部草地农业生态系统学重点开放实验室保存。
１．２ 主要试剂
ＭＭＬＶ第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒、ＰＣＲ扩增试剂盒，ＵＮＩＱ１０柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒、ＰＣＲ产物克隆试
剂盒等均购自上海生工，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购自北京天根，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
１．３ 实验方法
１．３．１ 材料培养 将籽粒饱满的霸王种子用７５％的乙醇浸泡１０ｍｉｎ后，蒸馏水冲洗２～３次，浸泡２４ｈ，然后在
２８℃下催芽。待发芽后将其转入４℃的冰箱中使发芽整齐，然后移入蛭石中，浇灌１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液［２
ｍｍｏｌ／ＬＫＮＯ３，０．５ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｈ２ＰＯ４，０．２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．１ｍｍｏｌ／ＬＣａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ，０．５
ｍｍｏｌ／ＬＦｅｃｉｔｒａｔｅ，９２μｍｏｌ／ＬＨ３ＢＯ３，１８μｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ，１．６μｍｏｌ／ＬＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．６μｍｏｌ／Ｌ
ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．７μｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ］。培养室昼夜温度为（２８±２）／（２３±２）℃，光照１６ｈ／ｄ，光
强约为６００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），空气相对湿度为６０％～８０％。将４周龄霸王先在５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ中处理１ｄ，７５
ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ中处理１ｄ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ中处理２ｄ，再在１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ中加ＰＥＧ（聚乙二醇，
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）使渗透势为－１．０ＭＰａ，处理１ｄ以诱导霸王液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ酶基因的表达。
１．３．２ 总ＲＮＡ的提取 将采集的幼叶经无菌水冲洗后，置于消毒滤纸上吸干水分，于液氮中快速冷冻并保存
于－７０℃低温冰箱或直接用于ＲＮＡ的提取，提取方法参考Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ和Ｓａｃｃｈｉ［１２］的方法。
１．３．３ 引物的设计与合成 通过对桃（犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪，ＡＦ３６７４４６）、梨（犘狔狉狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊，ＡＢ０９７１１５）、葡萄
（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪，ＡＦ２５７７７７）、橡胶树（犎犲狏犲犪犫狉犪狊犻犾犻犲狀狊犻狊，ＡＹ５１４０１９）、盐爪爪（犓犪犾犻犱犻狌犿犳狅犾犻犪狋狌犿，ＥＦ１１４３１５）、
盐穗木（犎犪犾狅狊狋犪犮犺狔狊犮犪狊狆犻犮犪，ＥＦ４７１３５８）、红叶藜（犆．狉狌犫狉狌犿，ＡＦ５３３３３７）和灰绿藜（犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犵犾犪狌犮狌犿，
ＤＱ４４３７３１）等几种植物的Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因核苷酸序列同源性的比较，找出高度保守的区段；根据同源性高和简并
性低的原则，利用ＤＮＡＭＡＮ和Ｐｒｉｍｅｒ５．０引物设计软件设计一对简并性引物 ＶＰＦ和 ＶＰＲ，用于扩增霸王
Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因的片段，推测目的片段的长度为８９８ｂｐ。引物由上海生工合成。
ＶＰＦ：５′ＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＧＧＡＡＧＧ３′
ＶＰＲ：５′ＣＡＧＣＡＡＴ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＣＣＡＧＣＡＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣ３′
１．３．４ ＲＴ－ＰＣＲ扩增 ｃＤＮＡ第一链的合成按照试剂盒操作说明进行。
ＰＣＲ扩增反应体系：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２．５μＬ，２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ５μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ
ＶＰＦ１μＬ，１０μｍｏｌ／ＬＶＰＲ１μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ｃＤＮＡ１μＬ，加水至５０μＬ。反应条件：
９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、５６℃退火４５ｓ、７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
ＰＣＲ扩增产物用１．２％琼脂糖凝胶检测，目的片段的回收和纯化按照试剂盒操作说明进行。
１．３．５ 阳性克隆的筛选与鉴定 回收的ＰＣＲ产物连接到ＰＵＣｍＴ载体，转化感受态大肠杆菌，用含有５０
μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）固体培养基进行蓝白斑筛选，转化白斑菌株经质粒ＰＣＲ鉴定确认阳性
克隆后，送至上海生工测序。
１．３．６ 序列的生物信息学分析 序列的比较、翻译等
图１ 霸王总犚犖犃的甲醛变性凝胶电泳
犉犻犵．１ 犉狅狉犿犪犾犱犲犺狔犱犲犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳
狋狅狋犪犾犚犖犃犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
在ＤＮＡＭＡＮ 生物软件上进行，Ｂｌａｓｔ搜索在 ＮＣＢＩ
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）网站上进行。
２ 结果与分析
２．１ 总ＲＮＡ的提取
以霸王叶片为材料提取的总ＲＮＡ经甲醛变性凝
胶电泳检测，结果显示２８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ条带清
晰（图１），紫外测定 ＯＤ２８０／ＯＤ２６０平均值为１．９２，表明
所提取的 ＲＮＡ 完整性好、纯度高，可以用于 ＲＴ－
ＰＣＲ扩增。
０２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
２．２ ＲＴ－ＰＣＲ扩增
以总ＲＮＡ反转录所得到的第１链ｃＤＮＡ为模板，用 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因的简并性引物ＶＰＦ和ＶＰＲ进行ＰＣＲ
扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现约在９００ｂｐ处有一条亮带，且上下无杂带，与目的片段的大小一致（图２），
推测可能是Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段，有待测序进一步鉴定。
２．３ 阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到ＰＵＣｍＴ克隆载体上，转化犈．犮狅犾犻ＤＨ５α。从转化的平板上随机挑取多个阳
性克隆。随后从这些克隆中任选８个提取质粒，进行ＰＣＲ扩增，得到的扩增片段大小约为９００ｂｐ（图３），与ＲＴ
－ＰＣＲ结果一致，表明这些克隆为阳性克隆，可以进行测序。
图２ 犚犜－犘犆犚产物凝胶电泳图
犉犻犵．２ 犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犚犜－犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
Ｍ：ＤＮＡ标记；１、２：Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段ＲＴ－ＰＣＲ产物
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１、２：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＨ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔ
图３ 阳性克隆的犘犆犚鉴定
犉犻犵．３ 犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊
Ｍ：ＤＮＡ标记；１、２、３：阳性克隆 Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；
１、２、３：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ
图４ 霸王犎＋犘犘犪狊犲基因片段犣狓犞犘１２核苷酸序列及推测的氨基酸序列
犉犻犵．４ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犎＋犘犘犪狊犲犳狉犪犵犿犲狀狋犣狓犞犘１２犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
加框表示引物ＶＰＦ、ＶＰＲ序列。阴影为 Ｈ＋ＰＰａｓｅ的ＰＰｉ的结合位点和活性部位 ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｆｒａｍｅｉｎｄｉｃａｔｅｐｒｉｍｅｒｓＶＰＦａｎｄＶＰＲ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｓｈａｄｅｓｈｏｗｔｈｅＰＰｉｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｄｏｍａｉｎｓｏｆＨ＋ＰＰａｓｅ
１２１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
２．４ 测序结果及序列分析
测序结果经分析发现，本研究得到３个长８９８ｂｐ的阳性克隆序列，编码２９９个氨基酸。将这３个片段进行
Ｂｌａｓｔ比较，结果显示它们与其他植物的Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因核苷酸序列具有很高的同源性，其同源性均在６９％以上；
其中，有一片段与玉米（犣犲犪犿犪狔狊）Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因（ＡＪ７１５５２９）核苷酸序列的同源性高达８６％。此外，３个片段都
含有液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ所特有的ＰＰｉ结合位点和活性部位序列（图４）。这些结果表明克隆到的３个片段均为
Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段。本研究将其分别命名为犣狓犞犘１１，犣狓犞犘１２和犣狓犞犘１３，并在ＧｅｎＢａｎｋ注册，登录号分
别为ＥＵ１０３６２５，ＥＵ１０３６２６和ＥＵ１０３６２７。
将推测的霸王Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因片段的氨基酸序列和其他植物 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因的氨基酸序列进行多重比较
（图５），结果发现它的保守氨基酸多达２３４个，而非保守氨基酸仅有６５个，且这３个片段间的同源性高达
９２．６４％；ＺｘＶＰ１１与ＶｖＶＰ的同源性高达８８％，ＺｘＶＰ１２与ＡＶＰ１的同源性高达９４．６％，ＺｘＶＰ１３与ＴｓＶＰ的
同源性高达９４．３％。进化系统分析发现（图６），在霸王的生命进化史中，ＺｘＶＰ１１、ＺｘＶＰ１２和ＺｘＶＰ１３是由共
同的祖先进化而来，而且ＺｘＶＰ１１较ＺｘＶＰ１２和ＺｘＶＰ１３出现的早。这些结果进一步表明本实验克隆的片段
为Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因。
图５ 犣狓犞犘氨基酸序列与其他植物犎＋犘犘犪狊犲氨基酸序列的多重比较
犉犻犵．５ 犃犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犣狓犞犘狑犻狋犺狋犺狅狊犲犳狉狅犿狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
多重比较采用ＤＮＡＭＡＮ程序进行。液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ酶氨基酸序列的来源和基因库登录号分别为：霸王ＺｘＶＰ１１（ＥＵ１０３６２５），霸王ＺｘＶＰ１２
（ＥＵ１０３６２６），霸王ＺｘＶＰ１３（ＥＵ１０３６２７），拟南芥 ＡＶＰ１（ＮＭ＿１０１４３７），小盐芥ＴｓＶＰ（ＡＹ４３６５５３），水稻ＯｓＶＰ（Ｄ４５３８３），葡萄 ＶｖＶＰ（ＡＦ２５７７７７）。
不同背景颜色表示氨基酸残基的不同保守性。黑色表示完全保守。红色、蓝色和白色分别表示７５％以上、５０％以上和不足２５％的保守性。Ｔｈｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｗａｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮｐｒｏｇｒａｍ．ＴｈｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＧｅｎｅＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓｏｆｖａｃｕｏｌａｒＨ＋ＰＰａｓｅａｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：Ｚｘ
ＶＰ１１（犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿，ＥＵ１０３６２５），ＺｘＶＰ１２（犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿，Ｕ１０３６２６），ＺｘＶＰ１３（犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿，ＥＵ１０３６２７），ＡＶＰ１（犃．狋犺犪犾犻犪狀犪，ＮＭ＿
１０１４３７），ＴｓＶＰ（犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪狊犪犾狊狌犵犻狀犲犪，ＡＹ４３６５５３），ＯｓＶＰ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪，Ｄ４５３８３），ＶｖＶＰ（犞．狏犻狀犻犳犲狉犪，ＡＦ２５７７７７）．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｂａｃｋ
ｇｒｏｕｎｄｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｔｈｅｂｌａｃｋｍｅａｎｓｃｏｍｐｌｅｔｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ａｎｄｔｈｅｒｅｄ，ｂｌｕｅａｎｄｗｈｉｔｅ
ｍｅａｎｓｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｓｎｏｌｅｓｓｔｈａｎ７５％，ｎｏｌｅｓｓｔｈａｎ５０％ａｎｄｎｏｍｏｒｅｔｈａｎ２５％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
２２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
３ 讨论
图６ 犣狓犞犘与其他植物犎＋犘犘犪狊犲的系统进化树
犉犻犵．６ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犣狓犞犘犪狀犱
犎＋犘犘犪狊犲犳狉狅犿狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
在整个生物界中，目前发现了４种质子泵，分别是
ＰｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＦｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＶｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ和
ＶＰＰａｓｅ。液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ属于第４类，是由单基因
编码的约８０ｋＤ的高疏水性单亚基质子泵，它在液泡
膜上以二聚体的形式水解，在蛋白质、ＲＮＡ和纤维素
合成过程中由其他ＡＴＰａｓｅ酶所产生的含有一个高能
磷酸键的次级代谢物焦磷酸，同时将细胞质内的 Ｈ＋
转运到液泡内形成跨液泡膜的质子梯度［１３１５］。因此，
液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ在植物细胞的生命活动中具有重要
的生理功能，如调节胞质和液泡的ｐＨ，参与Ｎａ＋、Ｋ＋
等溶质向液泡内运输，参与蛋白质、糖类、核酸等代谢
过程中的副产物ＰＰｉ的清除以维持细胞的正常代谢等。除上述功能外，Ｌｉ等［１６］发现，液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ还可控
制生长素的运输进而影响生长素依赖的植物发育，如超表达犃犞犘１在植物器官形成时导致细胞分裂和增生的加
快以及生长素运输的增加；相反，犪狏狆１１缺失突变体的根和地上部发育受到严重抑制、生长素运输效率降低。液
泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ由于是单基因编码且可为Ｎａ＋液泡区域化以及其他溶质向液泡内的运输提供动力，进而减轻盐
害和降低细胞渗透势，增加植物的耐盐抗旱性，因而成为农作物和优良牧草的耐盐抗旱育种工程中的研究热点。
Ｈ＋ＰＰａｓｅ是一独特而古老的质子泵，在古细菌［１７］、真细菌［１８］、藻类［１９］和高等植物以及原生动物［２０］中都有
发现，但目前尚未在高等动物和真菌中发现其存在。而图４所示的保守氨基酸序列再次证实了从古细菌到真细
菌到真核生物的数十亿年的漫长生物进化中，其活性位点序列ＧＧＧ、ＤＶＧＡＤＬＶＧＫ和ＤＮＶＧＤＮＶＧＤ的确一
直保持不变［２１］。此外，Ｈ＋ＰＰａｓｅ在长期进化中保留并拥有多个同源体，这可能暗示着其在植物生命活动过程中
除了已知的功能外还有其他重要的作用。
高等植物中存在２种类型的Ｈ＋ＰＰａｓｅ：Ⅰ型依赖Ｋ＋激活而适度被Ｃａ２＋激活，主要分布在液泡膜上，Ⅱ型对
Ｋ＋不敏感而对Ｃａ２＋极其敏感，主要分布在高尔基体和溶酶体上［２２，２３］。这２种类型的 Ｈ＋ＰＰａｓｅ酶在氨基酸序
列上亲缘关系较远，它们间的同源性仅有３７％～３９％［２１］。本研究克隆到的ＺｘＶＰ１１、ＺｘＶＰ１２和ＺｘＶＰ１３与模
式植物拟南芥Ⅰ型Ｈ＋ＰＰａｓｅＡＶＰ１的同源性分别为８３．９％，９４．６％和９４．０％，而与Ⅱ型Ｈ＋ＰＰａｓｅＡＶＰ２的同
源性仅为３８．８％，３９．１％和３９．８％，由此表明，霸王的３个 Ｈ＋ＰＰａｓｅ同源序列片段均属于Ⅰ型。
生活在荒漠环境中的多浆旱生植物霸王具有极强的抗旱性，Ｗａｎｇ等［２４］发现霸王从含盐量极低的生境中吸
收并积累大量的Ｎａ＋来增强抗旱性。超表达Ｈ＋ＰＰａｓｅ可显著增强液泡对Ｎａ＋的区域化能力，从而增强植物的
耐盐性和抗旱性。本研究通过一对简并性引物从霸王中同时获得的３个 Ｈ＋ＰＰａｓｅ同源序列，则为进一步揭示
该基因在多浆旱生植物中的功能及其与霸王抗旱性的关系奠定了基础。
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３２１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
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ＸＩＪｉｅｊｕｎ，ＷＵＧｕｏｑｉａｎｇ，ＢＡＯＡｉｋｅ，ＷＡＮＧＳｕｏｍｉｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＤｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＨ＋Ｐａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ．
ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆ犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿ａｎｄｔｈｅＨ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）．ＩｔｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏＰＵＣｍＴｖｅｃｔｏｒ
ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．ＴｈｒｅｅＨ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｇａｉｎｅｄｆｒｏｍ
犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿，ｅａｃｈｏｆｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓ８９８ｂｐａｎｄｅｎｃｏｄｅｓａｐｅｐｔｉｄｅｏｆ２９９ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｍｐａｒｉ
ｓｏｎｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｙｓｈａｒｅｏｖｅｒ６９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｉｎｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｏｖｅｒ７８％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔＨ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＧｅｎＢａｎｋ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；Ｈ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１