全 文 ：书抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体
构建及对烟草遗传转化的研究
贾小霞１，张金文１，王汉宁１，马怀义１，梁慧光２
（１．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：利用基因重组技术，将木霉几丁质酶基因（Ｃｈｉ）和β１，３葡聚糖酶基因（Ｇｌｕ）进行融合并将其引入含ｂａｒ基因
的载体ｐＡＨＣ２５中，成功构建了由 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ启动子分别驱动ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ和ｂａｒ的中间载体，然后将其上的
ＵｂｉＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｎｏｓ和Ｕｂｉｂａｒｎｏｓ表达盒引入ｐＢＩ１２１中，获得兼具除草剂抗性基因ｂａｒ和真菌抗性基因Ｃｈｉ
与Ｇｌｕ的三价植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ，并对烟草进行遗传转化，经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，共获得转基因烟草３２株。
外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗
性。
关键词：融合基因；几丁质酶；β１，３葡聚糖酶；ｂａｒ基因；植物表达载体
中图分类号：Ｓ５７２．０３２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０１００８６０８
　 几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，Ｃｈｉ）和葡聚糖酶（β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｇｌｕ）不但可以降解病原菌细胞壁，抵消病原菌的侵
染力，抑制真菌的生长增殖，而且能释放病原菌细胞壁的寡糖片段，作为宿主防御体系活化的诱导物。Ｍａｕｃｈ
等［１］在体外试验时发现用Ｃｈｉ单独处理时仅能抑制木霉菌（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｖｉｒｉｄｅ）的生长，用Ｇｌｕ处理仅能抑制镰
刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻犳ｓｐｐｉｓｉ）的生长，而２种酶共同作用时，能有效抑制８种真菌生长。几丁质酶和β１，３葡
聚糖酶的酶解活性及抑菌范围虽各不相同，但具有极强的协同作用［２～６］。此外，几丁质酶活性的增强往往伴随
β１，３葡聚糖酶及其他抗病蛋白（ｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＲ）的形成，共同发挥植物的防卫作用。因此，构建能
同时表达Ｃｈｉ、Ｇｌｕ两种水解酶基因的双价植物表达载体对植物进行转化，将会增强植物的抗病性，扩大其抑菌范
围［７］。
以往基因转化中一般采用抗生素作为筛选标记系统。由于转化细胞对抗生素的解毒作用导致的交叉保护，
高频率的未转化植株和嵌合体也通过了抗生素筛选。而ｂａｒ基因是常用的选择标记基因之一，将它与其他目的
基因构建到同一载体上，选择培养基中加入一定量的除草剂就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生
素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少。Ｘｕ等［８］将转化后的水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）愈伤组织，放在加有６ｍｇ／
Ｌ膦化麦黄酮（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，ＰＰＴ）的选择培养基上选择培养６周，验证了６０多株再生植株中无一假阳性出
现。ｂａｒ基因除作为选择标记外，还能给作物带来抗除草剂的特性。使用与抗除草剂基因相配的除草剂，能有效
除去杂草，大大减少劳动力，且能解决直播（或抛秧）田的草荒问题。于志华等［９］采用基因枪法获得了抗性转ｂａｒ
基因旱稻植株，有望解决旱直播稻的田间杂草问题。１９９６年在美国进行抗除草剂Ｌｉｂｅｒｔｙ转基因水稻田间鉴定
试验，转基因水稻充分表达抗除草剂的特性，能经济有效地控制包括红稻（犗．狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊）在内的一切田间杂
草［１０］。
目前，利用几丁质酶基因和ｂａｒ基因转化玉米（犣犲犪犿犪狔狊），取得了一定进展［１１～１５］。但将几丁质酶基因、
β１，３葡聚糖酶基因和除草剂抗性基因ｂａｒ同时转入玉米的研究尚未见报道。本研究将木霉几丁质酶基因和
β１，３葡聚糖酶基因以融合基因的方式和ｂａｒ基因一起引入高效植物表达载体ｐＢＩ１２１中，构建了三价载体ｐＢＩｂ
ＣＧ，并利用农杆菌介导法转化烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋狅犫犪犮狌犿），获得了转基因植株，研究了融合基因对真菌的抗病性，
８６－９３
２００９年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１８卷　第１期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
 收稿日期：２００８０６１８；改回日期：２００８０９０５
基金项目：国家高新技术研究发展计划（８６３计划）项目（编号：２００４ＡＡ２０７１４０）资助。
作者简介：贾小霞（１９７８），女，甘肃定西人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｍａｋｅ－０１１１＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｎ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
以为进一步用该载体转化玉米，获得抗菌谱广且具有除草剂抗性的玉米材料提供理论和实践依据。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　菌株与质粒　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ＤＨ５α）、根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＥＨＡ１０５、质
粒ｐＥＴ／Ｃｈｉ（含Ｃｈｉ），ｐＥＴ／Ｇｌｕ（含Ｇｌｕ）、ｐＢＩ１２１载体均由甘肃农业大学遗传育种实验室保存；质粒ｐＡＨＣ２５由
南京农业大学陈佩度教授惠赠；ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶及高保
真ＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司。
１．１．２　植物材料及其培养基　烟草红花大金子由本实验室保存。植物培养基：共培养培养基为 ＭＳ培养基
（ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄｓｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍ，ＭＳ），筛选培养基 ＭＳ１ 为 ＭＳ＋６Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（６ＢＡ）０．５ｍｇ／Ｌ＋头孢曲
松钠（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅｓｏｄｉｕｍ，Ｃｅｆ）５００ｍｇ／Ｌ＋ＰＰＴ１０ｍｇ／Ｌ，生根培养基 ＭＳ２ 为１／２ＭＳ＋Ｃｅｆ２５０ｍｇ／Ｌ＋ＰＰＴ１０
ｍｇ／Ｌ。
１．２　引物
以ＧｅｎｅＢａｎｋ中Ｃｈｉ、Ｇｌｕ基因和胭脂碱合成酶（ｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）终止子序列为依据，采用Ｏｌｉｇｏ６．０
分析软件设计各片段亚克隆的聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）引物，考虑到后续载体构建和片
段融合需要，在引物设计时加入酶切位点和ｌｉｎｋｅｒ，Ｃｈｉ、Ｇｌｕ基因和ＮＯＳ终止子的引物分别命名为Ｐ１、Ｐ２，Ｐ３、
Ｐ４和Ｐ５、Ｐ６。其构成如下：
Ｐ１：５′ＧＣＧＣＣＣＧＧＧ犛犿犪ⅠＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣ３′
Ｐ２：５′ＧＣＧＡＡＧＣＴＴ犖犮狅ⅠＧＧＡＴＣＣ犅犪犿犎ⅠＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＴＴＡＴＣ３′
Ｐ３：５′ＧＣＧ犵犵犪狋犮犮犅犪犿犎Ⅰ犵犵犪狋犮狋狋犮犵犮犮犵犵犵犮狋犮犵ＣＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴ３′
Ｐ４：５′ＧＣＧＡＣＴＡＧＴ犛狆犲ⅠＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＣ３′
Ｐ５：５′ＧＣＧＣＣＣＧＧＧ犛犿犪ⅠＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴ３′
Ｐ６：５′ＧＣＧＧＡＧＣＴＣ犛犪犮ⅠＡＣＴＡＧＴ犛狆犲ⅠＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡ３′
下划线部分为酶切位点碱基组成，上标为相应的内切酶，小写部分为ｌｉｎｋｅｒ序列。
１．３　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ融合基因及ＮＯＳ序列的获得
１．３．１　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ融合基因的获得　分别以ｐＥＴ／Ｃｈｉ，ｐＥＴ／Ｇｌｕ为模板，以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，按以
下参数扩增Ｃｈｉ基因和ｌｉｎｋｅｒ＋Ｇｌｕ。Ｃｈｉ：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，６５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，
循环３０次后７２℃继续延伸１０ｍｉｎ；ｌｉｎｋｅｒ＋Ｇｌｕ：５７℃退火４５ｓ，其余参数同Ｃｈｉ。扩增产物电泳鉴定，回收目的
片段与Ｔ载体连接、转化、鉴定及测序，将正确的重组子命名为ｐＧＥＭＧｌｕ和ｐＧＥＭＣｈｉ。
将质粒ｐＧＥＭＧｌｕ用犖犮狅Ⅰ／犅犪犿犎Ⅰ切开，与经同样酶从ｐＧＥＭＣｈｉ上切下的Ｃｈｉ片段连接、转化、筛选，
对获得的重组子进行ＰＣＲ及酶切鉴定后测序，将正确的重组子命名为ｐＧＥＭＣＬＧ。
１．３．２　ＮＯＳ序列的获得　以ｐＢＩ１２１为模板，以Ｐ５和Ｐ６为引物扩增ＮＯＳ终止子，反应参数为：９５℃预变性５
ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，６５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环３０次后，７２℃继续延伸１０ｍｉｎ。扩增产物经电泳鉴
定，回收目的片段并与Ｔ载体连接、转化，经ＰＣＲ、酶切鉴定后所得重组质粒命名为ｐＧＥＭＮＯＳ。
１．４　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建
植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建过程如图１，并按照该过程进行。
１．４．１　中间载体ｐＢＩ１２１ｂａｒ的构建　用犈犮狅犚Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ消化中间载体ｐＡＨＣ２５，回收 Ｕｂｉ启动子驱动的ｂａｒ
基因表达盒并与经同样酶切并回收的植物表达载体ｐＢＩ１２１大片段相连、转化，经ＰＣＲ及酶切验证后，所得正确
重组子命名为ｐＢＩ１２１ｂａｒ。
１．４．２　中间载体ｐＡＨＣ２５ＣＧ的构建　用犛犿犪Ⅰ／犛犪犮Ⅰ对ｐＧＥＭＮＯＳ进行酶切，并回收ＮＯＳ小片段与经同
样酶切回收的ｐＡＨＣ２５载体大片段相连，转化得重组质粒ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ。用犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切ｐＡＨＣ２５
ＮＯＳ，回收大片段与经同样酶切ｐＧＥＭＣＬＧ后回收的ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ小片段相连，转化得重组质粒ｐＡＨＣ２５Ｃ
Ｇ。
７８第１８卷第１期 草业学报２００９年
图１　植物表达载体狆犅犐犫犆犌构建流程
犉犻犵．１　犘狉狅犮犲犱狌狉犲狅犳狋犺犲犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
１．４．３　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建　用犎犻狀犱Ⅲ单酶切ｐＢＩ１２１ｂａｒ，经碱性磷酸化酶去磷酸化后，将线性质
粒载体在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下与经同样酶切ｐＡＨＣ２５ＣＧ后回收的小片段相连，转化得三价植物表达载体
ｐＢＩｂＣＧ。
１．５　烟草的遗传转化及其分子检测
１．５．１　根癌农杆菌转化　载体ｐＢＩｂＣＧ向根癌农杆菌ＥＨＡ１０５的直接转化参照文献［１６］。
１．５．２　烟草外植体的转化及植株再生　采用叶盘法进行转化［１７］。将烟草无菌苗健壮叶片切割成０．５ｃｍ２ 的小
块，浸入参照文献［１８］制备的农杆菌菌液中，浸染５～１０ｍｉｎ。取出叶盘后，用无菌滤纸吸干菌液，将叶盘背光面
朝下平放在 ＭＳ培养基上，置于２５℃左右暗培养。３ｄ后转移至 ＭＳ１ 培养基，于２５℃左右１４ｈ光照培养。约２
周后，切下带芽的叶缘插入ＭＳ１ 中进行筛选培养。４周后，切下幼芽插入 ＭＳ２ 培养基中于２５℃左右１４ｈ光照条
件下诱导生根，获得转基因植株。
８８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
１．５．３　转基因烟草的ＰＣＲ检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析　参照杨锦芬等［１９］的方法，用十六烷基三乙基溴化铵
（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｌ／ｌｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取转基因烟草植株及未转基因对照烟草的叶片总ＤＮＡ，以
Ｐ１和Ｐ４为引物进行ＰＣＲ检测。将ＰＣＲ阳性植株的ＤＮＡ用犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ双酶切后，以Ｃｈｉ１．３ｋｂ片段为探
针，按照由Ｒｏｃｈｅ公司生产的ＤＩＧＬａｂｅｉｌｉｎｇ试剂盒说明进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。
１．６　转基因植株的抑菌试验
采用琼脂糖孔穴扩散法［２０］，分别取非转化植株和ＰＣＲ检测为阳性的植株（１和６号）幼叶于无菌研钵中捣
碎，按照１ｇ／ｍＬ加入无菌磷酸钠缓冲液（ｐＨ 值６．４），研成匀浆。将匀浆转入无菌离心管中，４℃抽提过夜，
１００００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心２０ｍｉｎ，取上清液供测试用。
将木霉菌和镰刀菌分别接种于马铃薯培养基平板上，２８℃培养至菌丝萌发。用无菌枪头分别在菌丝处和空
白马铃薯培养基平板圆心位置打孔，取出空白琼脂块，将有菌丝的琼脂块填入其中，２８℃培养至菌丝直径约为３
ｃｍ。再在接种孔左右两边打孔，取出琼脂块，分别加入阴性对照和待测样品２００μＬ，２８℃温箱内培养，２４～３６ｈ
后观察抑菌结果。
２　结果与分析
２．１　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ基因融合及测序
分别以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，以ｐＥＴ／Ｃｈｉ和ｐＥＴ／Ｇｌｕ为模板扩增，ＰＣＲ产物经电泳检测，结果显示，分
别扩增出约１．３和１．１ｋｂ的特异带，与预期的Ｃｈｉ和Ｇｌｕ基因大小相符。以Ｐ１和Ｐ４为引物，以重组克隆载体
ｐＧＥＭＣＬＧ为模板，扩增出约２．４ｋｂ的特异带，与预期的ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ基因大小相符（图２）；用犛狆犲Ⅰ／犛犿犪Ⅰ
双酶切ｐＧＥＭＣＬＧ，得到约２．４ｋｂ的小带，与预期的ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ基因大小相符。质粒ｐＧＥＭＣＬＧ经测序表
明，得到的序列完全正确。
２．２　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ构建
２．２．１　中间载体ｐＢＩ１２１ｂａｒ的构建　重组质粒ｐＢＩ１２１ｂａｒ经犈犮狅犚Ⅰ／犅犪犿犎Ⅰ和犅犪犿犎Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ双酶切鉴
定，得到目的片段大小与预期一致（图３），表明已成功构建了ｐＢＩ１２１ｂａｒ。
２．２．２　中间载体ｐＡＨＣ２５ＣＧ的构建　用犛犿犪Ⅰ／犛犮犪Ⅰ双酶切重组质粒ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ，并以ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ
为模板，以Ｐ５、Ｐ６为引物扩增鉴定，得到目的片段大小与预期大小一致（图４）。用犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切重组质
粒ｐＡＨＣ２５ＣＧ，并以ｐＡＨＣ２５ＣＧ为模板，以Ｐ１、Ｐ４为引物扩增鉴定，得到目的片段大小与预期的大小一致
（图５）。
图２　克隆载体狆犌犈犕犆犔犌酶切分析和犘犆犚检测
犉犻犵．２　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犌犈犕犆犔犌
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；１：ｐＧＥＭＣＬＧ质粒经犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切结果；
２：以Ｐ１、Ｐ４为引物，以 ｐＧＥＭＣＬＧ 质粒为模板扩增的片段 Ｍ：ＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒⅢ；１：ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＧＥＭＣＬＧｂｙ犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ；２：Ｆｒａｇ
ｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆｐＧＥＭＣＬＧｂｙｐｒｉｍｅｒｓＰ１、Ｐ４
图３　中间载体狆犅犐１２１犫犪狉酶切检测
犉犻犵．３　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犅犐１２１犫犪狉
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅤ；１：ｐＢＩ１２１ｂａｒ质粒经犈犮狅犚Ⅰ／犅犪犿犎Ⅰ双酶
切结果；２：ｐＢＩ１２１ｂａｒ质粒经犅犪犿犎Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ双酶切结果 Ｍ：
ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅤ；１：ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１ｂａｒｂｙ犈犮狅犚Ⅰ／犅犪犿犎
Ⅰ；２：ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１ｂａｒｂｙ犅犪犿犎Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ
９８第１８卷第１期 草业学报２００９年
２．２．３　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建　用 犎犻狀犱Ⅲ单酶切，用犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切重组质粒ｐＢＩｂＣＧ，并以
ｐＢＩｂＣＧ为模板，以Ｐ１、Ｐ４为引物扩增鉴定，得到目的片段大小均与预期大小一致（图６），三价植物表达载体
ｐＢＩｂＣＧ构建成功。
２．３　转基因烟草的获得、形态学观察及分子检测
工程菌浸染后的烟草叶盘经共培养、选择培养及生根培养后，得到无菌抗性苗１４０株。ＰＣＲ检测４５株，结
果阳性对照（质粒ｐＢＩｂＣＧ）和３２株扩增出２．４ｋｂ的融合基因全长片段，而阴性对照（未转化烟草）和部分转化
植株无扩增条带（图７为１～６号转化植株检测结果）。表明１，４，５和６号植株已有融合基因的整合，为转基因植
株，而２和３号植株无转基因的整合，为非转基因植株。
对１～６号及对照进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，结果与ＰＣＲ检测一致（图８），说明ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ融合基因已整
合到转基因烟草基因组中。
对植株的外部形态进行观察，发现转基因植株与对照相比，株型变矮，叶片短粗、略厚，叶缘、主脉等性状没有
明显差异（图９Ａ）；转基因植株的根系比对照分布密集，而且明显增粗（图９Ｂ）。
图４　中间载体狆犃犎犆２５犖犗犛酶切
分析和犘犆犚检测
犉犻犵．４　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚
犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犃犎犆２５犖犗犛
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅤ；１：ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ质
粒经犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切结果；２：以Ｐ５、
Ｐ６为引物，以ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ质粒为模板扩
增的片段 Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒⅤ；１：Ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｒｅｓｕｌｔｏｆｐＡＨＣ２５ＮＯＳｂｙ犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ；
２：Ｆｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆ
ｐＡＨＣ２５ＮＯＳｂｙｐｒｉｍｅｒｓＰ５、Ｐ６
图５　中间载体狆犃犎犆２５犆犌酶切
分析和犘犆犚检测
犉犻犵．５　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚
犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犃犎犆２５犆犌
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；１：ｐＡＨＣ２５ＣＧ质
粒经犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切结果；２：以Ｐ１、
Ｐ４为引物，以ｐＡＨＣ２５ＣＧ质粒为模板扩
增的片段 Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；１：Ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｒｅｓｕｌｔｏｆｐＡＨＣ２５ＣＧｂｙ犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ；
２：Ｆｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆ
ｐＡＨＣ２５ＣＧｂｙｐｒｉｍｅｒｓＰ１、Ｐ４
图６　植物表达载体狆犅犐犫犆犌酶切
分析和犘犆犚检测
犉犻犵．６　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚
犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犅犐犫犆犌
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；１：ｐＢＩｂＣＧ质粒经犎犻狀犱Ⅲ酶
切结果；２：ｐＢＩｂＣＧ质粒经犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切结
果；３：以Ｐ１、Ｐ４为引物，以ｐＢＩｂＣＧ质粒为模板扩
增的片段 Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；１：Ｄｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆ
ｐＢＩｂＣＧｂｙ犎犻狀犱Ⅲ；２：ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩｂＣＧ
ｂｙ犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ；３：Ｆｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍ
ｐｌａｔｅｏｆｐＢＩｂＣＧｂｙｐｒｉｍｅｒｓＰ１、Ｐ４
图７　烟草转化体的犘犆犚检测
犉犻犵．７　犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋狅犫犪犮犮狅狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋
　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；ＣＫ１：阳性对照（ｐＢＩｂＣＧ）；ＣＫ２：非转化体烟草；
１～６：转化植株以Ｐ１，Ｐ４为引物扩增结果 Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ；ＣＫ１：
Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＢＩｂＣＧ）；ＣＫ２：Ｔｏｂａｃｃｏｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ；１－６：
ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰ１、Ｐ４ｏｆｔｏｂａｃｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
图８　转基因烟草的基因组犛狅狌狋犺犲狉狀印迹
犉犻犵．８　犛狅狌狋犺犲狉狀犫犾狅狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅狆犾犪狀狋狊
　ＣＫ１：犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ双酶切质粒ｐＢＩｂＣＧ；ＣＫ２：犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ酶切未转
基因植株；１～６：犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ酶切转基因植株 ＣＫ１：ｐＢＩｂＣＧｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙ犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ；ＣＫ２：Ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犛狆犲Ⅰ／犛狊狋
Ⅱ；１－６：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ
０９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
图９　转基因植株与未转化（犆犓）植株外部形态的比较
犉犻犵．９　犘犺犲狀狅狋狔狆犻犮犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀犫犲狋狑犲犲狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋犪狀犱狀狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱
Ｔ：转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；ＣＫ：未转化植株Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ
２．４　转基因植株抑菌活性检测
图１０　转双价抗病基因烟草植株离体抑菌活性检测
犉犻犵．１０　犃狀狋犻犱犻狊犲犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狏犻狋狉狅狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅
Ｓ：转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；ＣＫ：未转化植株Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ
琼脂糖孔穴扩散试验结果证明，转基因烟草１
号和６号植株叶片提取液对木霉菌和镰刀菌都表现
出一定的抑制作用（图１０）。表明２种真菌基因的
融合并没有导致融合蛋白由于折叠等原因造成空间
结构改变而破坏其功能。相反，融合基因得到了有
效的表达，并产生较高的抑菌活性。
３　讨论
利用多基因同时改良植物性状是目前基因工程
的研究热点之一［２１］。Ｈｅｄｉ［２２］通过基因枪法将１２
个质粒转入大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）；冯道荣等［２３］将
β１，３葡聚糖酶基因和碱性几丁质酶基因同时转入
水稻，证明转双抗真菌基因的水稻植株同时提高了对稻瘟病和枯纹病菌的抗性。但将多个基因构建在不同的表
达载体上依次或同时转入同一受体，不仅耗时费力，而且得到多基因的效率也会随着载体数的增加而大幅度地下
降［２４，２５］。如将目的基因构建在同一个表达载体上，只需通过一次转化就可方便而成功地获得多价基因同时表达
的转基因植物［２６］，如多价抗真菌病表达载体ＡＰ２４＋Ｇｌｕ［２７］、Ｃｈｉ＋Ｇｌｕ［２８］，并且通过一次转化获得了转多价基因
的抗病水稻和抗黄萎病棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犪狉犫狅狉犲狌犿）。为了避免多次转化时工作量大、试验周期长，共转化时转化
率不稳定和每个基因用各自的表达结构割开时载体容量过大等问题，本研究利用一个柔性短肽（ｌｉｎｋｅｒ：ｇｇａｔｃｃｇ
ｇａｔｃｔｔｃｇｃｃｇｇｇｃｔｃｇ）成功的将２个抗病基因连接在一起，获得融合基因，并将其和除草剂抗性基因ｂａｒ构建于同一
表达载体上，通过一次转化即可获得含双价抗病基因和抗除草剂基因的转基因植株，极大地提高了转化效率，这
与武东亮等［２９］在融合杀虫基因方面的研究一致。
多数遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物。但有时由于单基因表达强度不够或作用机制单
一，尚不能获得理想的转基因植物。如果把２个或２个以上的能起协同作用的基因同时转入植物，将会获得比单
基因转化更为理想的结果。Ｍａｕｃｈ等［１］在体外试验时发现用Ｃｈｉ单独处理时仅能抑制木霉菌的生长，用Ｇｌｕ处
理仅能抑制镰刀菌的生长。本试验结果显示，转基因烟草１号和６号植株叶片提取液对木霉菌和镰刀菌都表现
出一定的抑制作用（图１０），表明融合蛋白并没有由于折叠等原因造成空间结构改变，而得到了有效的表达。通
过形态学观察发现，转基因植株在形态上与对照有一定的差异，本研究分析认为可能与基因的整合性有关，或是
所转基因可能也影响植株的发育。
植物基因工程中，外源基因表达量不足是得不到理想的转基因植物的主要原因之一。启动子在决定基因表
达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和增强其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。植物表
达载体ｐＢＩｂＣＧ中的ｂａｒ和ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ都是采用了来源于玉米泛素“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ”基因且在转基因玉米、水稻、
１９第１８卷第１期 草业学报２００９年
小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）中都有较高活性的Ｕｂｉ启动子，抗性筛选及离体试验已证明目的基因可以在烟草中有
效的表达，所以借本研究所构建的植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ有望获得兼具除草剂抗性和真菌病抗性的转基因玉米
材料。以玉米成熟胚愈伤组织为外植体，利用农杆菌介导法转化玉米的工作正在进行，以期获得抗多种真菌和除
草剂的转基因玉米。
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狊犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵狋狑狅犪狀狋犻犳狌狀犵犪犾犪狀犱狅狀犲
犪狀狋犻犺犲狉犫犻犮犻犱犲犵犲狀犲狊犪狀犱狋犺犲犻狉犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅
ＪＩＡＸｉａｏｘｉａ１，ＺＨＡＮＧＪｉｎｗｅｎ１，ＷＡＮＧＨａｎｎｉｎｇ１，ＭＡＨｕａｉｙｉ１，ＬＩＡＮＧＨｕｉｇｕａｎｇ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡＣｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ（Ｃｈｉ）ａｎｄａβ１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅ（Ｇｌｕ）ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｐＥＴ／ＣｈｉａｎｄｐＥＴ／
Ｇｌｕｐｌａｓｍｉｄｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｂｙｅｉｇｈｔｎｅｕｔｒａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｔｏｆｏｒｍａｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅ（ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ）
ｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＡＨＣ２５ｂｙｒｅｐｌａｃｉｎｇｔｈｅＧＵＳｇｅｎｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓＵｂｉＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｎｏｓ
ａｎｄＵｂｉｂａｒｎｏｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＡＨＣ２５ＣＧｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ｔｏｏｂｔａｉｎｐｌａｎｔｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩｂＣＧ．Ｌｅａｆｄｉｓｃｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｓｔｒａｉｎＥＨＡ１０５
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｉｓｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｗａｓｓｈｏｗｎｔｏｈａｖｅｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏ
ｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｇｅｎｏｍｅｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｓｔｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
ｔｈｅｙｈａｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｖｉｒｉｄｅａｎｄ犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻犳ｓｐｐｉｓｉ．ＴｈｅｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｗａｓ
ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｔｏｇｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅ；ｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ；β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅ；ｂａｒｇｅｎｅ；ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ
３９第１８卷第１期 草业学报２００９年