全 文 ：书利用犚犃犘犇技术构建四倍体苜蓿遗传连锁图谱
刘曙娜１，于林清２，周延林１，吉仁花３，陈世茹４，孙娟娟２，么婷婷５
（１．内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特０１００２１；２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特０１００１０；
３．内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特０１００１９；４．内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特０１００１９；
５．东北师范大学植被生态教育部重点实验室，吉林 长春１３００２４）
摘要：利用随机扩增ＤＮＡ多态性分子遗传标记（ＲＡＰＤ）对Ｆ２ 群体进行分析。Ｆ２ 群体由Ｆ１ 群体（高产紫花苜蓿×
高抗黄花苜蓿得到Ｆ１代）自交获得。应用 ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＥＸＰ（３．０）与ＪｉｏｎＭａｐ４．０并结合 ＭａｐＤｒａｗＶ２．１软件构
建四倍体苜蓿的遗传连锁图谱。从１９２个随机引物中筛选出７２个引物，对９４个Ｆ２ 个体及Ｆ１ 双亲ＤＮＡ样本进
行了ＲＡＰＤ扩增，共获得５１个ＲＡＰＤ标记，构建了四倍体苜蓿分子遗传连锁框架图，其中包含８个连锁群，标记覆
盖的基因组总长度约为１２６１．５ｃＭ，标记间平均距离为２４．７３ｃＭ。本图谱为构建饱和的四倍体苜蓿分子遗传图
谱提供了框架结构，为进一步开展苜蓿分子遗传方面的研究奠定了基础。
关键词：苜蓿；ＲＡＰＤ；连锁图谱
中图分类号：Ｓ５５１＋．７０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０１７００６
　 苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅）属豆科多年生草本植物，是世界上分布、栽培面积广，适应性广泛，品质优良的牧草。具有
产草量高、品质优良、适口性好的特点，有很高的农业价值和商业价值。由于栽培苜蓿的同源四倍体特性使得其
连锁图谱的构建相对困难。目前，公认的已发表四倍体苜蓿连锁图共有３个，Ｂｒｏｕｗｅｒ和Ｏｓｂｏｒｎ［１］利用２个回
交群体各１０１株个体，以单剂量位点（ＳＤＡｓ）方法将８８个ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，限制
性内切酶片段长度多态性）标记构成７个连锁群，总遗传距离为４４３ｃＭ，饱和度相对较低。Ｊｕｌｉｅｒ等［２］利用１６８
个Ｆ１ 杂交重组群体构建了遗传距离为２６４９ｃＭ的父本连锁图谱和遗传距离为３０４５ｃＭ的母本连锁图谱，同时
利用ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单重复序列）标记构建了遗传距离为７０９ｃＭ 的整合图谱。Ｍｕｓｉｃａｌ等［３］利
用ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性）和ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性）标记构建了四倍体苜蓿遗传图谱。Ｅｕｊａｙｌ等［４］于２００５年利用来自紫花苜蓿（犕．
狊犪狋犻狏犪）×黄花苜蓿（犕．犳犪犾犮犪狋犪）的Ｆ１ 回交群体，以ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，表达序列标签）－ＳＳＲ、ＳＳＲ
（ＳＳＲ的分子标记代替首例图谱中的８８个ＲＦＬＰ）构建了比较饱满的遗传图谱，总遗传距离为６２４ｃＭ。构建苜
蓿分子遗传图谱可以进行目的基因的连锁分析、定位重要农艺性状相关基因位点（ＱＴＬ）及分子标记辅助育种
（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＭＡＳ）［５］。由于苜蓿遗传图谱共享机制不完善和我国苜蓿种质资源群体的
独特性，构建拥有自主产权的苜蓿遗传图谱成为首要任务。但是，目前国内尚未构建出一套完整的四倍体苜蓿遗
传连锁图谱。魏臻武［６］利用ＳＳＲ、ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）和ＲＡＰＤ技术构建了苜蓿的指纹图谱。
本研究以筛选出的高抗（抗寒———秋眠级为１）黄花苜蓿与高产（每年产量———鲜重６．４５ｋｇ／ｍ２）［７］紫花苜蓿
杂交产生Ｆ１ 代个体，并且由Ｆ１ 代个体自交构建Ｆ２ 群体。对Ｆ１ 的亲本紫花、黄花苜蓿和Ｆ２ 个体ＤＮＡ样本分别
进行ＲＡＰＤ［８］分子标记的遗传作图研究。旨在优化苜蓿分子遗传学实验体系，构建苜蓿遗传连锁框架图，为进一
步构建饱和的苜蓿遗传连锁图谱及开展苜蓿分子育种研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　植物材料
２００７年选择早期收集的黄花苜蓿与紫花苜蓿的特殊类型遗传材料，包括国内、美国农业部和俄罗斯共计２５
１７０－１７５
２０１２年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
 收稿日期：２０１１０４０２；改回日期：２０１１０５２７
基金项目：中央公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院草原研究所），农业科技转化项目（２０１１）（ＧＢ２３２６００１７）资助。
作者简介：刘曙娜（１９８６），女，山东菏泽人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｕｔｉａｎ０７２７＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｎｑｉｎ＿ｙｕ＠１２６．ｃｏｍ
份材料（均为２代以上选育的四倍体材料）。对所选的１８份紫花苜蓿、７份黄花苜蓿进行正、反交产生了大量的
Ｆ１ 代。２００８年春在中国农业科学院草原研究所呼和浩特市南郊实验场对杂交成功的Ｆ１ 育苗并人工套袋自交，
于２００９年建立了Ｆ２ 群体。２０１０年对杂交成功的９４个单株杂交子代进行形态与农艺指标的检测。
１．２　ＤＮＡ提取与纯化
１．２．１　基因组ＤＮＡ提取　对苜蓿亲本（本研究中均为高产紫花苜蓿、高抗黄花苜蓿）、Ｆ１ 和Ｆ２ 代个体叶片分别
进行取样，并存储于－８０℃的超低温冰箱中待用。本实验采用植物基因组提取试剂盒（由上海生物工程有限公司
提供）进行ＤＮＡ提取。
１．２．２　基因组ＤＮＡ检测　紫外分光光度法测定ＤＮＡ的浓度、纯度，计算样品浓度：ＤＮＡ浓度（μｇ／μＬ）＝
ＯＤ２６０×犖×５０／１０００［９］，式中，ＯＤ２６０为核酸吸光度，犖 为样品稀释倍数。
电泳检测ＤＮＡ：将提取的ＤＮＡ在０．８％的琼脂糖凝胶（含ＧｏｏｄＶｉｅｗ核酸染料）上电泳，检测其完整性和片
断大小。
１．３　ＲＡＰＤ实验体系
反应在９６孔ＰＣＲ板上进行，总体积为２０μＬ，其中包括模板ＤＮＡ１μＬ（大约２０ｎｇ）；５０μｍｏｌ／Ｌ的引物１
μＬ；２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ；ｄｄＨ２Ｏ８μＬ。扩增条件为９４℃下预变性３ｍｉｎ；进入循环，９４℃下变性３０ｓ；３６℃
下复性３０ｓ；７２℃下延伸６０ｓ，共４０个循环；最后在７２℃下延伸１０ｍｉｎ，结束后于４℃下保存。
扩增结束后，取下样品，在制备好的１．５％琼脂糖胶（含ＧｏｏｄＶｉｅｗ核酸染料）上点样。在１×ＴＢＥ电泳缓冲
液中电泳，功率为１００Ｗ。电泳时间为４５ｍｉｎ。电泳结束后取出胶在ＵＶＩ凝胶成像系统（英国ＵＶＩ公司Ｆｉｒｅ
Ｒｅａｄｅｒ系列）下观察、拍照记录。
实验用于ＲＡＰＤ的随机引物共１９２个，购自上海Ｓａｎｇｏｎ公司。
１．４　苜蓿ＲＡＰＤ引物筛选
用Ｆ１ 亲本及随机抽取的Ｆ２ 个体的ＤＮＡ样品筛选在亲本中呈多态性而在子代中呈分离的扩增谱带的引
物。
１．５　ＲＡＰＤ扩增作图及数据采集
利用筛选的引物对包括Ｆ１ 的亲本、Ｆ１ 及Ｆ２ 个体共９７个样本的ＤＮＡ进行扩增反应。记录在亲本中存在多
态性而在Ｆ２ 代个体中发生分离的谱带，某一谱带出现的个体在该位点的基因型记作“１”；该谱带不出现的个体在
该位点的基因型记作“０”；有些带型不易确定连同缺失的个体，一同按缺失数据处理记作“－”。按通用格式将所
有数据输入计算机保存成文本文件备用。
１．６　ＲＡＰＤ标记的分离检测、连锁分析与图谱构建
将原始数据文件转换成符合 ＭＡＰＭＡＫＥＲ３．０（ＦｏｒＰＣ）作图软件中要求的作图数据文件，然后采用
ＭＡＰＭＡＫＥＲ３．０软件并结合ＪｉｏｎＭａｐ４．０软件在计算机上构建连锁图谱［１０］。通过两点连锁分析，计算所有成
对座位的重组率和最大ＬＯＤ值，推测可能的连锁群。根据需要，不同的连锁群可以定义不同的ＬＯＤ值，以达到
最佳的分群效果。然后对每个连锁群中的标记作多点分析，并采用 Ｋｏｓａｍｂｉ函数，将重组率转换成图距单
位———厘摩（ｃｅｎｔｉｍｏｒｇａｎ，ｃＭ）。分析模型选用自交（Ｆ２）类型。经过连锁分析，最后得到连锁框架图。
２　结果与分析
２．１　ＲＡＰＤ引物筛选
用亲本ＤＮＡ和Ｆ２ 代个体ＤＮＡ对１９２个随机引物进行筛选，共获得在亲本中呈多态性，在Ｆ２ 代个体中有
分离的随机引物７２个，有１２０个引物（占６２．５０％）没有检测出多态性标记。引物入选率为３７．５０％。
２．２　亲本的多态性检测
从随机引物筛选的结果中发现有３７．５０％的引物揭示了亲本间的遗传多态性，表明两亲本在基因组水平上
存在一定的差异。
２．３　ＲＡＰＤ标记分析
用筛选的７２个引物对Ｆ１ 双亲、Ｆ１ 及９４个Ｆ２群体样本ＤＮＡ进行扩增（图１），共记录了７４个ＲＡＰＤ标记的
１７１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
分离。Ｆ２ 中多态分离标记来自母本黄花苜蓿的有２９个（占３９．１９％），来自父本紫花苜蓿的有４５个（占
６０．８１％），表明Ｆ２ 群体基本上分别来自双亲的５０％，略偏父本。
参与连锁分析的ＲＡＰＤ分子标记共计７４个。其中，５１个标记位点分别定位在８个连锁群上（表１），覆盖长
度为１２６１．５ｃＭ，平均标记数为６．３８个，２个标记间平均图距为２４．７３ｃＭ，另有２３个标记未与这８个连锁群连
锁。标记位点较多的连锁群为ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３和ＬＧ８，分别包含１８，８，５和５个标记，标记数最少的连锁群只有
３个标记。连锁群ＬＧ１遗传距离最长，为４６１．２ｃＭ，遗传距离最短的为５１．３ｃＭ，平均图距最大的连锁群为
ＬＧ３，间距为３８．１６ｃＭ，平均图距最小的连锁群为ＬＧ４，间距为１４．２３ｃＭ。来源于紫花苜蓿的４５个多态ＲＡＰＤ
标记中有３２个标记被分配到８个连锁群上，占４３．２４％。有１３个标记未被连锁到任何一个连锁群上；来源于黄
花苜蓿的２９个多态ＲＡＰＤ标记中有１９个标记被分配到８个连锁群上，占２５．６８％。有１０个标记未被连锁到任
何一个连锁群上。
图１　犛１０１３对亲本及个别犉２ 个体犇犖犃电泳图
犉犻犵．１　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狊犫狔狆狉犻犿犲狉犛１０１３犻狀狆犪狉犲狀狋狊犪狀犱犉２
　♀：高抗黄花苜蓿；♂：高产紫花苜蓿；Ｆ１：Ｆ１代个体；１～２４为Ｆ２群体中个别个体。♀：Ｈｉｇｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ犕犲犱犻犮犪犵狅犳犪犾犮犪狋犲；♂：Ｈｉｇｈｙｉｅｌｄｏｆ犕．
狊犪狋犻狏犪；Ｆ１：Ｆ１ｈｙｂｒｉｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｏｆｔｈｅｃｒｏｓｓ犕．狊犪狋犻狏犪×犕．犳犪犾犮犪狋犪；１－２４：ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｏｆＦ２ｇｒｏｕｐｓ．
２．４　连锁分析与图谱构建
通过对每个连锁群中的标记作多点分析，并将重
组率转换成图距单位（ｃＭ）。经过连锁分析，共得到８
条连锁群（图２），其中，每条连锁群左侧给出了２个标
记位点间的图距（ｃＭ），右侧给出了呈多态性的标记名
称。
由于作图软件的局限性和总标记数目太少，本研
究所获得的连锁标记不多。随着实验条件的逐步完
善，可以预期，随着标记数目的增加，连锁标记会越来
越多，遗传图谱越来越密集。
本研究中，定位到图谱上的分离标记共５１个，来
自于４９个 ＲＡＰＤ引物（表２）。其中，引物Ｌ１６、Ｓ４３
均有２个分离标记。
表１　分子标记在各连锁群的分布情况
犜犪犫犾犲１　犕狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉犻狀狋犺犲犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀
狅犳犪犾犻狀犽犪犵犲犵狉狅狌狆狊
连锁群
Ｌｉｎｋａｇｅｇｒｏｕｐｓ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ（ｃＭ）
标记数
Ｍａｒｋｅｒｓ
平均图距
Ａｖｅｒａｇｅｄｉｓｔａｎｃｅ（ｃＭ）
ＬＧ１ ４６１．２ １８ ２５．６２
ＬＧ２ ２１６．８ ８ ２７．１０
ＬＧ３ １９０．８ ５ ３８．１６
ＬＧ４ ５６．９ ４ １４．２３
ＬＧ５ ５１．３ ３ １７．１０
ＬＧ６ １４６．８ ５ ２９．３６
ＬＧ７ ６４．４ ３ ２１．４７
ＬＧ８ ７３．３ ５ １４．６６
合计Ｓｕｍ １２６１．５ ５１ １８７．７０
３　讨论
本研究以Ｆ２ 群体作为作图群体，利用ＲＡＰＤ技术构建了四倍体苜蓿的遗传图谱。以期为苜蓿遗传育种工
作提供参考与基础材料。
建立一个完善的遗传作图群体直接关系到图谱构建的质量高低。由于苜蓿自身的细胞学特性、遗传研究水
平和现有构图技术限制，在短时间内不可能像农作物那样建立高世代作图群体。目前真正比较理想的作图群体
比较少，对亲本的一些基本信息还了解不多，在作图中将会带来很多问题［２］。用于苜蓿遗传图谱构建的作图群
２７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
图２　苜蓿连锁框架图
犉犻犵．２　犚犃犘犇犿犪狆狅犳狋犲狋狉犪狆犾狅犻犱犪犾犳犪犾犳犪
　连锁群左侧为位点间的距离（ｃＭ），右侧为引物名称。Ｍａｐｄｉｓｔａｎｃｅｓｉｎｃｅｎｔｉｍｏｒｇａｎｓ（ｃＭ）ａｒｅｇｉｖｅｎｔｏｔｈｅｌｅｆｔｏｆｅａｃｈｌｉｎｋａｇｅｇｒｏｕｐ，ｍａｒｋｅｒｎａｍｅｓ
ａｒｅｇｉｖｅｎｔｏｔｈｅｒｉｇｈｔ．
表２　４９个犚犃犘犇引物序列
犜犪犫犾犲２　犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳４９犚犃犘犇狆狉犻犿犲狉狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｌ１ ＧＴＡＧＣＴＧＡＣＧ Ｌ３２ ＣＣＧＣＣＧＧＴＡＡ Ｎ７ ＴＧＣＧＴＧＣＴＴＧ Ｓ１２６３ ＡＣＧＡＡＡＣＧＧＧ Ｓ１３０８ ＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧ
Ｌ１１ ＣＡＣＣＧＣＴＴＧＴ Ｌ８ ＧＧＣＡＴＧＡＣＣＴ Ｓ１０ ＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣ Ｓ１２７１ ＣＴＴＣＴＣＧＧＴＣ Ｓ１３１７ ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣ
Ｌ１２ ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ Ｎ１２ ＴＧＴＡＧＣＴＧＧＧ Ｓ１００４ ＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣ Ｓ１２７３ ＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣ Ｓ２ ＴＧＡＴＣＣＣＴＧＧ
Ｌ１４ ＧＧＣＴＧＣＧＡＣＡ Ｎ１４ ＧＴＣＴＣＣＧＣＡＡ Ｓ１０１０ ＧＧＧＡＴＧＡＣＣＡ Ｓ１３ ＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴ Ｓ２４ ＡＡＴＣＧＧＧＣＴＧ
Ｌ１６（１－２）ＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ Ｎ１７ ＡＧＣＧＴＣＡＣＴＣ Ｓ１０１１ ＴＣＣＧＣＴＧＡＧＡ Ｓ１３０５ ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧ Ｓ３ ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ
Ｌ２４ ＡＧＣＣＧＴＧＧＡＡ Ｎ１８ ＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣ Ｓ１０１３ ＴＧＡＧＴＣＣＧＣＡ Ｓ１３０６ ＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣ Ｓ３０ ＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧ
Ｌ２９ ＧＴＣＧＣＣＣＴＣＡ Ｎ１９ ＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣ Ｓ１０１８ ＧＧＧＣＴＡＧＴＣＡ Ｓ１３０９ ＡＣＴＧＧＧＴＣＧＧ Ｓ４２ ＧＧＡＣＣＣＡＡＣＣ
Ｌ３０ ＴＣＧＧＣＧＧＴＴＣ Ｎ２５ ＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧ Ｓ１０１９ ＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣ Ｓ１３１１ ＣＴＧＣＣＡＣＧＡＧ Ｓ４３（１－２） ＧＴＣＧＣＣＧＴＣＡ
Ｌ３１ ＣＴＡＣＧＣＴＣＡＣ Ｎ３２ ＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣ Ｓ１０４８ ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣ Ｓ１３１４ ＧＧＴＴＣＴＧＣＴＣ Ｓ５６ ＡＧＧＧＣＧＴＡＡＧ
Ｓ６２ ＧＴＧＡＧＧＣＧＴＣ Ｎ４ ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ Ｓ１０５１ ＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣ Ｓ１３１５ ＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡ
体，主要有下列几种类型：Ｆ２ 群体、回交群体、Ｆ１ 群体等。在国外，目前公布的３个四倍体苜蓿图谱中的作图群体
分别是回交群体（ＢＣ１为基础）［１］和Ｆ１ 杂交重组群体［２，４］。在国内，张丽芳［１１］以２个差异较大的蒺藜苜蓿亲本
Ｗ５１６０和Ｊｅｍａｌｏｎｇ进行杂交，获得杂交组合 Ｗ５１６０×Ｊｅｍａｌｏｎｇ，进而构建了蒺藜苜蓿的Ｆ２ 群体。目前国内还
未见关于四倍体栽培苜蓿群体构建的报道，今后有必要加强相关的研究［１２］。而在构建遗传图谱中采用的分子标
记主要包括ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｇｅｄｓｉｔｅｓ，序列标志位点）、ＳＳＲ 等。各种方法均各具优缺
点。ＲＡＰＤ技术是建立在ＰＣＲ基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记技术［１３］。
３７１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
相比之下，ＲＡＰＤ技术方法简便、高效、成本低，得到了广泛的应用。目前已被分子遗传学家应用到各个学科、领
域，如品种鉴定［１４１６］、遗传多样性分析［１７２０］、遗传连锁分析和基因定位、分子标记辅助育种［２１］等。目前已发表的
多个苜蓿图谱由于材料与所选分子标记的不同还不能重合。随着各种遗传标记方法的逐步完善和发展，目前已
经进入综合应用各种遗传标记进行基因组研究的新阶段。作图群体的大小直接影响到作图的精度和应用范围。
从已发表的图谱来看，大多数所采用的群体样本数在１００以内，少数研究者采用３００个以上。本研究中采用了
９４个样本可检测到的重组最小图距为３．２ｃＭ，表明在样本数量上可以满足构建连锁框架图的需要。本研究在
构建遗传图谱时选择了 ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＥＸＰ（３．０）与ＪｉｏｎＭａｐ４．０软件来进行分群，ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＥＸＰ（３．０）在
作物、蔬菜中已被广泛应用，但在牧草中还尚未广泛应用。分群过程中可以根据分群效果选用适宜的ＬＯＤ值，
以期获得最佳分群效果。
由于在过去缺乏对苜蓿经典遗传学和细胞遗传学等方面的研究，目前大多数已构建的遗传连锁图谱仅仅是
一个框架图，大都没有和染色体相对应，构建的图谱离应用还有一段距离；因此在今后的一段时间内，在开展分子
标记研究的同时必须加强一些基础研究。
参考文献：
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ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｌｕｃｅｒｎｅ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪Ｌ．）［Ｊ］．ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，５７：８０１８１０．
［４］　ＥｕｊａｙｌＩ，ＳｌｅｄｇｅＭＫ，ＷａｎｇＬ，犲狋犪犾．犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪ＥＳＴＳＳＲｓｒｅｖｅａｌｃｒｏｓｓｓｐｅｃｉｅｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｆｏｒ犕犲犱犻犮犪犵狅ｓｐｐ．［Ｊ］．
ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０８：４１４４２２．
［５］　王晓娟，孙月华，杨晓莉，等．苜蓿遗传图谱构建及其应用［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（３）：１１９１２７．
［６］　魏臻武．利用ＳＳＲ、ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ技术构建苜蓿基因组ＤＮＡ指纹图谱［Ｊ］．草业学报，２００４，１３（３）：６２６７．
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４７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
犜犺犲犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犵犲狀犲狋犻犮犾犻狀犽犪犵犲犳狉犪犿犲犿犪狆犻狀狋犲狋狉犪狆犾狅犻犱犕犲犱犻犮犪犵狅狌狊犻狀犵犚犃犘犇犿犪狉犽犲狉狊
ＬＩＵＳｈｕｎａ１，ＹＵＬｉｎｑｉｎｇ２，ＺＨＯＵＹａｎｌｉｎ１，ＪＩＲｅｎｈｕａ３，ＣＨＥＮＳｈｉｒｕ４，
ＳＵＮＪｕａｎｊｕａｎ２，ＹＡＯＴｉｎｇｔｉｎｇ５
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｓｓｌａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ；３．ＦｏｒｅｓｔｒｙＣｏｌｅｇｅ，
ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１９，Ｃｈｉｎａ；４．ＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｌｅｇｅ，Ｉｎｎｅｒ
ＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１９，Ｃｈｉｎａ；５．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｇｅｔａｔｉｏｎ
ＥｃｏｌｏｇｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＵｓｉｎｇｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓａｎａｌｙｚｅｔｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａ
ｔｉｏｎｏｆ９４ｐｌａｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．ＴｈｅＦ２ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｓｅｌｆｐｏｌｉｎａｔｅｄＦ１ｈｙｂｒｉｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｏｆ
ｔｈｅｃｒｏｓｓ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪×犕犲犱犻犮犪犵狅犳犪犾犮犪狋犪．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｕｓｉｎｇｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉ
ｈｏｏｄｅｑｕａｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｃｏｍｐｕｔｅｒｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｃｏｍｐｒｉｓｅｓ７４ｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄｃｏｎｔａｉｎｓ８ｌｉｎｋａｇｅ
ｇｒｏｕｐｓｃｏｖｅｒｉｎｇ１２６１．５ｃＭ，ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｄｉｓｔａｎｃｅｏｆ２４．７３ｃＭｂｅｔｗｅｅｎｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｉｓｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐ
ｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｎｔｒｙｐｏｉｎｔｆｏｒｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｓａｔｕｒａｔｅｄｔｅｔｒａｐｌｏｉｄａｌｆａｌｆａｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｍａｐａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｌｆａｌｆａｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅；ＲＡＰＤ；ｌｉｎｋａｇｅｍａｐ
５７１第２１卷第１期 草业学报２０１２年