全 文 ：第 15 卷 第 5 期
Vol. 15 No. 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 9 月
Sep. 2007
文章编号:1007-0435(2007)05-0418-05
农杆菌介导犁苞滨藜 NHX基因转化苜蓿
的影响因素
赵红娟 , 张 博* , 李培英 , 陈爱萍
(新疆农业大学草业工程学院 , 新疆草地资源与生态自治区重点实验室 , 新疆乌鲁木齐 830052)
摘要:以新牧 1 号杂花苜蓿(Med icago varia M artin. cv. Xinmu No. 1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L. cv.
Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料 ,通过根癌农杆菌 EHA105 介导转化犁苞滨藜 N HX 耐盐基因 , 提高植株
耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究 , 结果表明:以预培养 3 d 的子叶为转化受体 , 菌液浓度 OD600为 0. 4 ～
0. 5 时 , 浸染 10 ～ 15 min ,然后转入附加 20 ～ 30 mg / L 乙酰丁香酮的共培养基 , 培养 4 d , 可以获得较高的转化效
率;对抗性芽的 PCR检测初步证明 , 外源基因整合到苜蓿的基因组中。
关键词:苜蓿;农杆菌;N HX 基因;遗传转化
中图分类号:S541. 035. 03 文献标识码:A
Influencing Factors on Alfalfa Transformation with Atriplex dimorphostegia
NHX Gene Mediated by Agrobacterium tumefaciens
ZHAO Hong-juan , ZHANG Bo* , LI Pei-ying , CHEN Ai-ping
(Xinjiang Key Lab oratory of G ras sland Resou rces and Ecology , College of Grassland S cience ,
Xin jiang Agricu ltural University , Urumqi , Xinjiang 830052 , China)
Abstract:The leaves and cotyledons of Medicago varia Mar tin cv. Xinmu No. 1 and Medicago sat iva L.
cv. Xinjiang Daye w ere used as materials and influencing facto rs on the salt-tolerant gene (NH X) t rans-
fo rmation of Atriple x dimorphostegia Kar. et. Kir. by Agrobacterium tume f aciens EHA105 w ere stud-
ied. The results show ed that the optimum transfo rmation condition for cotyledon precultured 3 day s and
bacterial concentrat ion of OD 600 0. 4 ～ 0. 5 w as immersing for 10 ～ 15 minutes , then laying co tyledons in co-
culture medium w ith addi tion o f 20 ～ 30 mg /L acetosy ringone for 4 day s. The PCR analy sis showed that
the NHX gene had been integ rated into the genome of alfalfa.
Key words:Alfalfa;Agrobacterium tume faciens;NHX gene;Genet ic t ransformation
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要
因素。全世界的盐碱地约占陆地面积的三分之一 ,我
国也有大面积的盐碱地 ,仅海岸 、滩涂就达 6. 67×106
hm
2 ,且有逐年增加的趋势。苜蓿(Medicago sativa)
具有营养价值高 ,抗逆性强 ,适口性好等优点 ,是生
态环境治理的优良草种。但苜蓿属于中等耐盐植
物 ,适宜在轻度盐碱地上种植 ,超过它的耐盐极限时
就不能正常生长 ,那么 ,如何提高其耐盐性 ,扩大种
植范围 ,是当前苜蓿生产面临的重要研究课题 。而
采用传统的育种方法选育耐盐品种进展缓慢 ,随着
生物技术的发展和广泛应用 ,利用转基因技术提高
苜蓿的耐盐性已成为可行的手段 。
NHX(Na+ /H+ antipor ter)为液泡膜中的一种
Na
+
/H
+反向运输体 ,可促进 N a+和 Cl -在液泡中
的分室效应 ,不仅可以作为有效的渗透调节剂 ,同时
还可减小细胞毒性[ 1 , 2] 。在转基因拟南芥 、油菜和
西红柿中过量表达 AtN H X1 可在液泡膜中积累大
量的运输体 ,并且极大地提高了它们的耐盐性[ 3 ～ 5] 。
本研究以农杆菌介导犁苞滨藜 NHX 基因转
入苜蓿基因组中为目标 ,对影响农杆菌转化的因素
收稿日期:2007-06-04;修回日期:2007-07-03
基金项目:新疆维吾尔自治区教育厅高校重点研究项目(XJEDU2004118)
作者简介:赵红娟(1979-),女 ,宁夏人 ,硕士研究生 ,主要从事牧草生物技术育种研究;*通讯作者 Au th or for cor respondence , E-mail:
xjauzb@126. com
第 5期 赵红娟等:农杆菌介导犁苞滨藜 N HX基因转化苜蓿的影响因素
进行研究 ,优化转化体系 ,以提高转化效率 ,为培育
耐盐苜蓿新品种提供技术参考 。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 供试材料为新牧 1号杂花苜蓿
(Medicago varia Mar tin. cv. Xinmu No. 1)和新疆
大叶苜蓿(Medicago sativa L. cv. Xinjiang Daye),
由新疆农业大学草业工程学院牧草与草坪教研室提
供。将种子在 70%乙醇中浸泡 30 s , 0. 1% HgCl2
消毒 10 min ,无菌水清洗 3 ～ 5次 ,接种到含琼脂 0.
7%和蔗糖 3%的 1 /2 M S固体培养基上 , 25℃,12 h
光照下培养。切取无菌苗 5 ～ 7 d龄子叶和 15 ～ 20
d 龄叶片 , 用于遗传转化试验 。根癌农杆菌
(Agrobacterium tume f aciens)菌株为 EHA105 , 植
物表达载体为 pBin438 ,该载体含新霉素磷酸转移
酶基因(N PT Ⅱ)和犁苞滨藜 NHX 基因[ 6] ,基因克
隆 、质粒构建及转化均在新疆大学新疆生物资源基
因工程实验室完成。
1. 1. 2 培养基 以苜蓿叶片为外植体 ,预培养培养
基(MS1):MS+2 mg /L 2 , 4-D+1 mg /L NAA +1
mg /L K T +3%蔗糖 +0. 7%琼脂[ 7] ;共培养基:
MS1+20 mg /L AS;脱菌培养基:MS1+200 mg /L
Ca rb;抗性愈伤组织筛选培养基:MS1 +40 mg /L
Kan+200 mg /L Carb。
以苜蓿子叶为外植体 ,预培养培养基(MS2):
MS+2 mg /L 2 , 4-D+0. 5 mg /L KT +3%蔗糖+
0. 7%琼脂;分化培养基(MS3):MS +0. 1 mg /L
NAA+0. 5 mg /L 6-BA +3%蔗糖+0. 7%琼脂;共
培养基:MS2+20 mg /L AS;脱菌培养基:MS2 +
200 mg /L Carb;抗性愈伤组织筛选培养基:MS2+
50 mg /L Kan +200 mg /L Ca rb;抗性芽筛选培养
基:MS3+10 mg /L Kan+200 mg /L Carb。
1. 2 试验方法
挑取单菌落接种于含有 50 mg /L 卡那霉素
(Kan)的 YEB 液体培养基[ 8] , 28℃振荡培养 16 h ,
以液体诱导培养基稀释菌液。外植体预培养后浸入
稀释的菌液中 ,取出置于无菌滤纸上 ,吸干表面菌
液 ,接种到共培养基上 ,外植体和农杆菌共培养后转
入脱菌培养基 , 2周后把外植体愈伤组织转至筛选
培养基 ,再过 3周将抗性愈伤组织转至抗性芽筛选
培养基 ,诱导抗性绿芽的发生 。
1. 2. 1 选择培养基中 Kan选择压的确定 取无菌
苗 15 ～ 20 d龄叶片和 5 ～ 7 d龄子叶 ,接种于含 0 、
10 、20 、30 、40 、50 、60 、80 、100 mg /L Kan的 MS 诱导
培养基中。取叶片和子叶的胚性愈伤组织转至含
0 、10 、20 、30 、40 、50 mg /L Kan的分化培养基上。
1. 2. 2 影响苜蓿转化效果因子的设计 主要因子
有:不同品种(新牧 1号杂花苜蓿 、新疆大叶苜蓿)、
外植体类型(叶片 、子叶)、农杆菌浓度(OD600值分别
为 0. 1 、0. 3 、0. 4 、0. 5 、0. 6 、0. 7 、0. 9)、乙酰丁香酮
(AS)浓度(0 、10 、20 、30 、50 mg /L)、浸染时间(1 、5 、
10 、15 、20 、25 min)、预培养时间(0 、1 、3 、5 d)、共培
养时间(1 、2 、3 、4 、5 、6 d)。各处理设 3次重复。采
用 DPS数据处理系统 3. 01进行显著性分析 。
1. 2. 3 转化效率评价指标 抗性愈伤率(%)=抗
性愈伤组织数 /浸染的外植体总数×100
1. 2. 4 PCR检测 抗性愈伤组织不定芽的 DNA提
取(CTAB 法)和 PCR检测参照王关林和方宏筠的方
法[ 8] 。对根据 NHX 基因和 NPTⅡ基因已知序列设
计引物 ,扩增其片段大小分别为 1008 bp和 462 bp。
犁苞滨藜 N HX 基因 PCR扩增引物:
Primer 1 5′-GAACGAG TCCA TCACTGCC-
CTAC-3′;
Primer 2 5′-GACAATCTGCTGGTTGAAAG-
TGA-3′。
NP TⅡ基因 PCR扩增引物:
Primer 1 5′-CG TTG TCACTGAAGCGGGA-
AGG-3′;
Primer 2 5′-GAGCGGCGATACCGTAAAGC -
ACC-3′。
2 结果与分析
2. 1 确定培养基中 Kan选择压
由图 1 可知 ,在不同 Kan 浓度的诱导培养基
上 ,30 d后叶片和子叶都出现不同程度的白化 ,Kan
浓度超过 40和 50 mg /L 时 ,叶片和子叶都没有愈
伤组织形成 ,外植体全部死亡。愈伤组织分化胚状
体时期 ,对 Kan较为敏感 。本试验中随 Kan浓度的
升高 ,愈伤组织分化率降低 ,在 Kan为 20 mg /L 和
10 mg /L 时 ,叶片和子叶形成的小植株多数白化 ,不
能发育为正常的再生苗。在愈伤组织形成时期 ,叶
片以 40 mg /L Kan ,子叶以 50 mg /L Kan对转化体
进行筛选;在胚状体形成时期 , 叶片以 20 mg /L
Kan ,子叶以 10 mg /L Kan对转化体进行筛选 。
419
草 地 学 报 第 15卷
图 1 Kan对愈伤组织诱导率(A)和分化率(B)的影响
F ig . 1 Effect o f kanamycin on callus ratio(A) and diffe rentiation ratio(B)
a:子叶 b:叶片 a:Cotyledon;b:Leaf
2. 2 转化体系的优化
2. 2. 1 品种及外植体类型对转化效率的影响 由
表1可知 ,在相同培养条件下 ,新牧 1号杂花苜蓿抗
性愈伤率为 33. 1%,新疆大叶苜蓿为 31. 5%,两者
差异不显著 。以新疆大叶苜蓿的叶片和子叶为材
料 ,叶片的抗性愈伤率为 15. 8%,子叶为 36. 4%,两
者的差异极显著(P <0. 01),故本试验中采用苜蓿
子叶为转化受体 。
表 1 品种和外植体类型对转化效率的影响
Table 1 Effects of va riety and explant type on
tr ansfo rmation efficiency
品种
Variety
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resis tant cal lus
外植体类型
Explants type
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resis tant callus
XM 33. 1aA 叶片 Leaf 15. 8bB
DY 31. 5aA 子叶 Cotyledon 36. 4aA
注:XM 新牧 1号杂花苜蓿;DY新疆大叶苜蓿;同列中不同小写
字母间差异显著(P<0. 05),不同大写字母间差异极显著(P<0. 01)
Note:XM:Med icago. var ia Mart in. cv. Xinm u No. 1;DY:
Med ica go sa tiva L. cv. Xinjiang Daye;Dif ferent let ters in th e sam e
column indicate sig ni fican t diff erences at level
2. 2. 2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 分别
以不同 OD 600值的根癌农杆菌浸染苜蓿子叶 ,结果
见表 2 。OD600值为 0. 4 ～ 0. 5 时 ,抗性愈伤率超过
40%,转化效率较高 , 差异极显著(P <0. 01)。
OD 600值过高或过低转化效率都不高 , OD600值为
0. 1时 ,转化率仅为 12. 5%,菌液浓度过低 ,不利于
农杆菌附着于外植体的伤口上;OD600 >0. 7时 ,在
后期的筛选培养中农杆菌过度繁殖 ,抑菌较为困难 ,
而且过高的菌液浓度往往使外植体褐化 ,影响其生
长发育。因此 ,在转化中应控制好菌液浓度 ,本试验
中适宜的菌液浓度 OD600值为 0. 4 ～ 0. 5。
表 2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响
Table 2 Effects o f bacterial concentration on
transforma tion efficiency
菌液浓度(OD600)
A grobacterium
concent rat ion
接种外植体总数
Numbers of
explants
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resistant callu s
0. 1 196 12. 5cD
0. 3 205 24. 8bcBC
0. 4 210 41. 8aAB
0. 5 202 45. 1aA
0. 6 198 34. 7abBC
0. 7 203 21. 6bcBC
0. 9 198 16. 4cCD
注:同列中不同小写字母间差异显著(P<0. 05),不同大写字母
间差异极显著(P<0. 01),下同
Note:Dif ferent small let ters in the same colum n indicate signifi-
cant dif ferences at(P<0. 05)level , an d dif ferent capi tal let ters in the
same column indicate signif icant di ff erences at (P<0. 01) level , the
same as below
表 3 AS浓度和预培养时间对转化效率的影响
Table 3 Effects of AS concentra tion and pre-culture time
on transformation efficiency
AS浓度
AS concent ration
(mg /L)
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resi stant callus
预培养时间
Pre-cultu re
t ime(d)
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resistant callu s
0 21. 9 cB 0 11. 2cC
10 22. 0 bcB 1 22. 0bcB
20 41. 7 aA 3 45. 6aA
30 36. 3 abAB 5 31. 7abB
50 26. 3 bcB
2. 2. 3 不同 AS 浓度对转化效率的影响 许多研
究表明 ,AS可以激活农杆菌 Ti质粒Vir 基因 ,提高
转化效率 。由表 3 可知 ,共培养基中加入 20 ～ 30
mg /L AS ,抗性愈伤率较高 ,达到 36%以上 ,与其他
处理比较差异极显著;不加 AS ,抗性愈伤率仅为
21. 9%;当 AS浓度为 50 mg /L 时 ,转化效率降低至
26. 3%。本试验结果初步表明:添加酚类物质 AS
420
第 5期 赵红娟等:农杆菌介导犁苞滨藜 N HX基因转化苜蓿的影响因素
可提高转化效率 ,过量则抑制转化 。
2. 2. 4 预培养时间对转化效率的影响 关于植物
外源基因的转化 ,许多研究认为预培养使植物组织
代谢活跃 ,可促进细胞分裂 ,而分裂状态下的细胞更
易整合外源 DNA ,促进酚类物质的产生 ,酚类物质
可活化 Vir 基因 ,有助于提高转化效率[ 9 , 10] 。本试
验中(表 3),预培养 3 d ,转化效率为 45. 6%,差异极
显著(P<0. 01);预培养 0 d ,转化效率为 11. 2%;预
培养 5 d 的抗性愈伤率下降为 31. 7%,可能时间过
长 ,酚类物质失去活性 ,不利于T-DNA整合到植物基
因组中[ 9] 。
表 4 浸染时间和共培养时间对转化效率的影响
Table 4 Effects of infection time and co-culture time
on t ransfo rmation efficiency
浸染时间
Infection t ime
(min)
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resistant callus
共培养时间
Co-cul tu re
time(d)
抗性愈伤率(%)
Rate of Kan-
resis tant callus
1 22. 9bC 1 8. 7cD
5 33. 3abBC 2 18. 9bcC
10 41. 4aAB 3 24. 2abB
15 44. 3aA 4 35. 0aA
20 39. 4aBC 5 22. 9abB
25 25. 0bC 6 13. 5cCD
2. 2. 5 浸染时间对转化效率的影响 在农杆菌
对植物材料的浸染过程中 ,浸染时间的长短影响着
植物材料的抗性愈伤组织率和生长状态 。短时间的
浸染转化率较低 ,但长时间的浸染 ,植物材料会发黄
腐烂 ,农杆菌污染严重 ,抑菌较困难 ,不利于后期转
化培养 。由表 4可知:浸染 10 ～ 15 min ,抗性愈伤
率超过 40%,高于其他处理 ,差异极显著 ,在后继的
培养中脱菌效果也较理想;浸染时间大于 25 min
时 ,植物材料发黄腐烂 ,受毒害较重。试验结果表明
浸染时间在 10 ～ 15 min较适宜 。
2. 2. 6 共培养时间对转化效率的影响 共培养时
间过短或过长都不利于外源基因转化。过短 , T-
DNA 转移过程不能完成 ,过长则农杆菌会对与之共
培养的植物材料造成伤害 ,不能再生出植株[ 8] 。由
表 4可知 ,苜蓿子叶共培养 1 d的转化效率仅为 8.
7%;共培养6 d ,转化率为 13. 5%,且农杆菌过度繁
殖 ,造成外植体褐化腐烂 ,无法进行后期培养。本试
验中共培养4 d ,农杆菌没有对苜蓿子叶愈伤组织造
成伤害 ,转化效率为 35. 0%,差异极显著(P<0. 01),
因此共培养 4 d较适宜。
2. 3 抗性愈伤组织的 PCR检测
随机抽取 20块经过 Kan筛选具有 Kan抗性绿
芽的愈伤组织进行 PCR检测。结果表明(图 2):19
块扩增出了与阳性对照一致的特异条带 ,同时阴性
对照没有扩增出任何条带。初步证明外源基因已经
整合到了苜蓿抗性芽基因组中。
图 2 抗性愈伤组织分化出绿芽(A);NPT-Ⅱ基因(B)和 NHX基因(C)PCR 电泳检测
F ig . 2 Green buds from Kan resistant callus(A):NP T-Ⅱ gene(B) and N HX gene(C) PCR detec tion
M :DL2000 bp M ark er;1.阳性对照;2.阴性对照;B 3～ 6 , 8:转基因愈伤组织系;7:未转化成功的愈伤组织系;C 3～ 16:转基因愈伤组织系
M:DL2000 bp Marker;1:Posi tive cont rol;2:Negative cont rol;B 3～ 6 , 8:Posit ive call;7:Non-t ran sgenic calli;C 3～ 16:T ransgenic cal li
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草 地 学 报 第 15卷
3 讨 论
在相同的转化体系中 ,新牧 1号杂花苜蓿和新
疆大叶苜蓿的转化效率差异不显著 ,可能是所用材
料对农杆菌敏感性和细胞潜在的转化能力较为一
致[ 8] 。苜蓿不同类型外植体的转化率差异很大 ,子
叶受体比茎段 、叶柄和叶片更为理想 ,这与子叶组织
细胞生长快 、体胚分化力强的特点有关[ 11] 。本试验
子叶转化率为 36. 4%,高于叶片 ,重复性较好 。遗
传转化中 ,菌液浓度直接影响着转化效率 ,梁慧敏
等[ 12]对 5种无性系叶片进行转化 ,农杆菌最适浓度
OD 600值为 0. 3 ～ 0. 5;试验结果表明菌液浓度为 0. 4
～ 0. 5转化效率较高 ,与梁慧敏等人的研究结果较
一致。乙酰丁香酮(AS)是一种常用的诱导 Vir 基
因活化的酚类化合物 ,可促进 T-DNA 的转移 ,提高
转化效率。本试验将 20 ～ 30 mg /L AS加入农杆菌
和外植体的共培养基中 ,转化效率较高 ,这在葡萄[ 9]
的遗传转化研究中有类似的效果。在苜蓿外源基因
转化中 ,许多研究表明不同外植体预培养时间不同 ,
草原 1 号苜蓿(Medicago varia Mart in. cv. Ca-
oyuan N o. 1)子叶[ 13] 和新疆大叶苜蓿下胚轴[ 13] 无
需预培养 ,苜蓿叶片预培养 5 d[ 12] ,都可得到较好的
转化效果;本试验中预培养 3 d转化效率较高 。农
杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常重要的
环节 ,T-DNA 的转移及整合都在此时期内完成 ,苜
蓿不同转化受体共培养最适时间不同 ,梁慧敏等[ 12]
以叶片为转化受体 ,共培养 3 d转化效率较高;而马
晖玲等[ 14]将子叶 、下胚轴 、叶片 、叶柄分别共培养 1 、
2和 3 d ,其转化效率没有体现出差异。本试验中子
叶与农杆菌共培养 4 d 得到了较好的转化效果 ,可
能是所用菌株的不同造成了试验结果的差异 。
选择培养基中加入抗生素 ,愈伤组织的生成率
和愈伤组织分化率都低于对照 。在愈伤组织诱导阶
段不加入选择压 ,获得愈伤组织后 ,转至选择培养基
中进行转化体的筛选 ,愈伤组织分化过程中适当降
低选择压 ,可以提高愈伤组织的分化率和不定芽的
生成率 ,PCR检测结果显示 ,这种选择方法对转化
效果影响不大。
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(责任编辑 马丽萍)
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