全 文 ：书中国新疆紫花苜蓿复合体３个种的遗传
多样性及亲缘关系研究
李飞飞１，崔大方２，３，羊海军３，邓超宏１，李庆艳３
（１．华南农业大学生命科学学院，广东 广州５１０６４２；２．华南农业大学林学院，广东 广州５１０６４２；
３．华南农业大学公共基础实验教学中心，广东 广州５１０６４２）
摘要：利用１５对ＳＳＲ引物和１０个ＩＳＳＲ引物对紫花苜蓿复合体３个种黄花苜蓿、多变苜蓿及紫花苜蓿共１０个居
群的遗传多样性及亲缘关系进行研究。结果表明，ＳＳＲ标记下，１０个居群中多变苜蓿 ＶＧ居群多态位点百分率、
Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数及Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数均最高；ＩＳＳＲ标记下，黄花苜蓿ＦＨ居群以上３个指数均最高；黄花苜
蓿居群ＦＨ在２种分子标记下都存在特有位点。说明在１０个居群中多变苜蓿居群ＶＧ与黄花苜蓿居群ＦＨ表现
出较丰富的遗传多样性，值得进一步保护。ＵＰＧＭＡ聚类分析结果表明，在２种分子标记下３个种可以被有效区
分，结合它们在新疆境内的分布，本研究支持仍将紫花苜蓿、黄花苜蓿和多变苜蓿划分为３个种。
关键词：紫花苜蓿复合体；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５５１＋．９０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０１９００９
苜蓿属（犕犲犱犻犮犪犵狅）植物是豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）一个重要的类群，大多数苜蓿属物种都是广泛分布在温带草
原上的优质牧草。而紫花苜蓿（犕．狊犪狋犻狏犪）、黄花苜蓿（犕．犳犪犾犮犪狋犪）以及多变苜蓿（犕．狏犪狉犻犪）更是畜牧业主要的
饲料来源［１３］。
紫花苜蓿复合体包括９个可以自然杂交的分类群［４］，包含有二倍体和四倍体物种。在我国仅分布有３个种，
即紫花苜蓿、黄花苜蓿和多变苜蓿。３个种均为苜蓿属多年生草本植物，紫花苜蓿花冠各色，淡黄，深蓝或暗紫
色、荚果螺旋２～４圈、中央无孔或近无孔，在全国各地都有栽培或呈半野生状态；黄花苜蓿花冠黄色、荚果镰形，
分布于我国东北、华北和西北地区以及中亚及欧洲地区；多变苜蓿是紫花苜蓿与黄花苜蓿自然杂交产生的类型，
其花冠浅紫色、黄色或其他、荚果螺旋０．５～２．０圈、中央有孔，在我国新疆和高加索、中亚细亚、西伯利亚一带多
有分布［５］。
由于这３个种形态相似，并且长期以来在不同的地理条件下杂交，子代和亲本类型多样，使其分类问题存在
很大争议。前苏联学者在２０世纪初到５０年代把它们分成许多种，而中国、美国、加拿大学者则支持将它们定为
一个种即多变苜蓿。在Ｓｍａｌ和Ｊｏｍｐｈｅ［６］系统中将多变苜蓿以及Ｌｅｓｉｎｓ和Ｌｅｓｉｎｓ［７］系统中的紫花苜蓿、黄花苜
蓿划分为紫花苜蓿种下的３个亚种，分别是犕．狊犪狋犻狏犪ｓｕｂｓｐ．狏犪狉犻犪、犕．狊犪狋犻狏犪ｓｕｂｓｐ．狊犪狋犻狏犪及犕．狊犪狋犻狏犪ｓｕｂ
ｓｐ．犳犪犾犮犪狋犪。我国学者何咏松和吴仁润［８］通过形态学特点和遗传现象的观察认为紫花苜蓿和黄花苜蓿属同１个
种的２个亚种或生物型或生态型。李拥军和苏加楷［９，１０］采用种子贮藏蛋白技术及ＲＡＰＤ（随机扩增ＤＮＡ多态
性，ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）标记分析发现新疆大叶苜蓿、新牧１号多变苜蓿和新疆黄花苜蓿之间的
遗传距离为０，支持将这３个苜蓿类型划分为紫花苜蓿的３个亚种。而王俊杰［１１］认为荚果形态在苜蓿属植物
“种”及以上分类地位的界定上是十分有效的，而在种下分类单位的界定上则难以发挥作用，因此不支持Ｓｍａｌ和
Ｊｏｍｐｈｅ［６］系统中的划分，并且将中国黄花苜蓿野生种群的荚果划分为１３个类型。因此，紫花苜蓿、黄花苜蓿及
多变苜蓿这３个种及其种下类型的分类地位需进一步研究确定。
近十余年来，许多分子标记包括简单串联重复序列ＳＳＲ（简单重复序列，ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）［１２１４］，
１９０－１９８
２０１２年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１１０２２８；改回日期：２０１１０５０６
基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７０１４５）资助。
作者简介：李飞飞（１９８３），女，新疆乌鲁木齐人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｆｅｉｆｅｉ３０７６１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃｕｉｄｆ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＲＡＰＤ［１５，１６］，ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）［１７］以及细胞器基因片
段［１８，１９］都曾对苜蓿属植物进行过研究。但这些研究中绝大部分以栽培的紫花苜蓿为主要研究材料，对野生分布
的多变苜蓿及黄花苜蓿研究较少，而将共显性与显性分子标记结合对广泛分布于新疆地区的紫花苜蓿复合体３
个种的研究还未有报道。因此本研究利用ＳＳＲ及ＩＳＳＲ（简单重复序列区间，ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）分子
标记技术，比较分析在中国新疆分布的紫花苜蓿、黄花苜蓿和多变苜蓿３个种共１０个居群的遗传多样性及其亲
缘关系，为苜蓿属植物的分类学问题以及苜蓿属植物资源的合理开发利用和保护提供分子依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料及引物
实验材料于２００７－２００８年在野外采集，共有３个种１０个居群，每个居群选取１９份单株，共采集１９０份单
株，记录编号后分别放入装有变色硅胶的封口袋中干燥。居群编号、采集地及采集地经纬度见表１。４０对ＳＳＲ
引物来源于Ｂｅｒｎａｄｅｔｔｅ等［２０］发表的紫花苜蓿ＳＳＲ引物，３７个ＩＳＳＲ引物来源于ＵＢＣ大学公布的１００个通用引
物。
表１ 样品采集地信息
犜犪犫犾犲１ 犛犪犿狆犾犲犾犻狊狋狅犳犾狅犮犪狋犻狅狀
种名Ｓｐｅｃｉｅｓ 居群编号ＰｏｐｕｌａｔｉｏｎＮｏ． 采集地Ｃｏｌｅｃｔｐｌａｃｅ 纬度Ｌａｔｉｔｕｄｅ 经度Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
黄花苜蓿 犕．犳犪犾犮犪狋犪 ＦＢ 布尔津，新疆Ｂｕｅｒｊｉｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４８．４７２° ８７．１４６°
ＦＮ 那拉提，新疆 Ｎａｌａｔｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４３．３００° ８４．１３９°
ＦＥ 额敏，新疆Ｅｍｉｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４６．４７０° ８３．５３７°
ＦＨ 后峡，乌鲁木齐，新疆 Ｈｏｕｘｉａ，Ｕｒｕｍｕｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４３．４００° ８７．２１１°
紫花苜蓿 犕．狊犪狋犻狏犪 ＳＨ 呼图壁（栽培），新疆 Ｈｕｔｕｂｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４４．２３０° ８６．８２０°
多变苜蓿 犕．狏犪狉犻犪 ＶＦ 富蕴，新疆Ｆｕｙｕｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４６．９８５° ８９．５１２°
ＶＢ 布尔津，新疆Ｂｕｅｒｊｉｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４７．６９８° ８６．８５９°
ＶＱ 奇台，新疆 Ｑｉｔａｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４３．５８４° ８９．６１２°
ＶＧ 甘沟，乌鲁木齐，新疆 Ｇａｎｇｏｕ，Ｕｒｕｍｕｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４３．４４１° ８７．１１５°
ＶＨ 后峡，乌鲁木齐，新疆 Ｈｏｕｘｉａ，Ｕｒｕｍｕｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ４３．４００° ８７．２１１°
１．２ 实验方法
于２００８年将野外采集的苜蓿属植物每份单株摘取适量叶片，采用改良ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉ
ｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法提取植物总ＤＮＡ，并用１．０％的琼脂糖电泳检测ＤＮＡ的浓度和纯度。
ＳＳＲ反应体系：总体积２０μＬ，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２－）２μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．３μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物
各１μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，３０ｎｇ／μＬＤＮＡ模板２μＬ，去离子水１３．５μＬ。ＳＳＲ反应程序：９４℃变性５
ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５４℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存。ＩＳＳＲ反应体系：总
体积２０μＬ，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２－）２μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．２５μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ 引物１μＬ，Ｔａｑ酶（５
Ｕ／μＬ）０．２μＬ，３０ｎｇ／μＬＤＮＡ模板２μＬ，去离子水１４．５５μＬ。ＩＳＳＲ反应程序：９４℃变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，
５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，４２个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃保存。
ＳＳＲ扩增产物采用６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，ＩＳＳＲ扩增产物采用２％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结
果至凝胶成像仪拍照观察，并记录结果。
１．３ 数据统计分析
由于紫花苜蓿和多变苜蓿为同源四倍体，而黄花苜蓿既含有四倍体又含有二倍体［２１］，所以二倍体等位基因
的频率统计公式并不适合本研究，刘志鹏等［２２］曾采用一种将无效等位基因包含在内的统计方法统计四倍体，但
由于这种方法还未完善，部分统计指数还需进一步研究。因此本实验统一采用０／１法统计，以扩增条带在相对迁
１９１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
移位置有无，赋以“１”或“０”，生成分子数据矩阵。利用ＰｏｐＧｅｎｅ１．３２软件［２３］进行电泳谱带差异和各项遗传指数
的统计分析，包括：多态位点百分率（ＰＰＢ）、有效等位基因数（ｎｅ）、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数（ｈ）、遗传分化系数
（Ｇｓｔ）、基因流（Ｎｍ）、Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（Ｉ）、遗传距离（ＧＤ）。利用ＧｅｎｅＡＬＥｘ软件［２４］ＡＭＯＶＡ计算方差分量，
及 Ｍｅｎｔａｌ检测遗传距离和地理距离相关系数（ｒ）。ＳＳＲ／ＩＳＳＲ引物多态信息含量采用计算公式：
犘犐犆＝１－∑
狀－１
犻＝１
犘犻２－∑
狀－１
犻＝１
∑
狀
犼＝犻＋１
２犘犻２犘犼２［２５］
式中，犘犻为微卫星位点上第犻个等位基因频率（ａｌｅｌｉｃｆｒｅｑｕｅｎｃｙ），犘犼为第犻＋１个等位基因频率。利用
ＰＯＰＴＲＥＥ２［２６］软件采用非加权平均聚类法（ＵＰＧＭＡ）绘制聚类图，并重复１００００次计算自展支持率［２７］。
２ 结果与分析
２．１ ＳＳＲ及ＩＳＳＲ位点多态性
４０对ＳＳＲ引物中筛选出１５对多态性好、具清晰条带的ＳＳＲ引物用于进一步研究，在１０个居群１９０份材料
中共获得６６个位点，６４个多态性位点，位点数范围为２（ＭＴＩＣ２５８）～１１（ＭＴＩＣ２４８），平均位点数达到４．４个，
平均多态性位点数达４．３个，多态位点百分比达到９６．９７％；１０个ＩＳＳＲ引物共获得７４个位点，多态位点百分比
达到１００％，位点数范围为２（８９１）～１３（８２２），平均多态性位点数达７．４个（表２）。
表２ １５对犛犛犚引物及１０个犐犛犛犚引物在总群体中的遗传多样性信息
犜犪犫犾犲２ 犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犻狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀狊狅犳１５狆犪犻狉狊狅犳犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊犪狀犱１０犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊犻狀狋狅狋犪犾犵狉狅狌狆
ＳＳＲ引物
ＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒ
位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｂａｎｄｓ
多态性位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂａｎｄｓ
多态位点百分比
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄ（ＰＰＢ，％）
多态信息含量
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ（ＰＩＣ）
ＩＳＳＲ引物
ＩＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒ
位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｂａｎｄｓ
多态性位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂａｎｄｓ
多态位点百分比
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄ
（ＰＰＢ，％）
多态信息含量
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ（ＰＩＣ）
ＭＴＩＣ４４７ ３ ３ １００ ０．４８ ８１５ １０ １０ １００ ０．８１
ＭＴＩＣ２５８ ２ １ ５０．００ ０．３４ ８１７ ７ ７ １００ ０．７９
ＭＴＩＣ２７８ ４ ４ １００ ０．４８ ８２２ １３ １３ １００ ０．８１
ＭＴＩＣ２３７ ５ ５ １００ ０．５４ ８２３ ４ ４ １００ ０．４９
ＭＴＩＣ１６９ ６ ６ １００ ０．５４ ８２５ １１ １１ １００ ０．７９
ＭＡＡ６６０４５６ ５ ５ １００ ０．６１ ８７３ ７ ７ １００ ０．７２
ＭＴＩＣ９３ ３ ３ １００ ０．５４ ８８０ ４ ４ １００ ０．４６
ＭＴＩＣ４３２ ６ ６ １００ ０．６４ ８８１ １１ １１ １００ ０．８１
ＭＴＩＣ４７０ ３ ２ ６６．６７ ０．４６ ８９０ ５ ５ １００ ０．４６
ＭＴＩＣ２９９ ４ ４ １００ ０．５５ ８９１ ２ ２ １００ ０．３６
ＭＴＩＣ２４８ １１ １１ １００ ０．８４
ＭＡＬ３６９４７１ ６ ６ １００ ０．６４
ＭＴＩＣ２７ ２ ２ １００ ０．３６
ＭＴＩＣ２７２ ３ ３ １００ ０．５５
ＭＴＩＣ３３１ ３ ３ １００ ０．４７
总计 Ｔｏｔａｌ ６６ ６４ ９６．９７ 总计 Ｔｏｔａｌ ７４ ７４ １００
平均 Ｍｅａｎ ４．４ ４．３ ０．５４ 平均 Ｍｅａｎ ７．４ ７．４ ０．６５
多态信息含量是衡量微卫星位点多态性高低的较好的指标，当ＰＩＣ＞０．５０时，具有高度多态性；当０．２５＜
ＰＩＣ＜０．５０时，具有中度多态性；当ＰＩＣ＜０．２５时，具有低度多态性。ＳＳＲ标记中１５个位点中９个位点具有高度
多态性，６个位点具有中度多态性，其中 ＭＴＩＣ２４８引物ＰＩＣ值最高（０．８４），ＭＴＩＣ２５８引物ＰＩＣ值最低（０．３４），平
均值为０．５４。ＩＳＳＲ标记中１０个位点中６个位点具有高度多态性，４个位点具有中度多态性，其中８８１引物ＰＩＣ
值最高（０．８１），８９１引物最低（０．３６），平均值为０．６５。
２９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
２．２ 紫花苜蓿复合体１０个居群遗传多样性分析
ＳＳＲ标记下１０个居群的遗传变异显示（表３），不同居群内的多态位点百分率不同，范围为５７．５８％ （ＦＥ）～
７５．７６％ （ＶＧ），平均值为６８．７９％，总群体为９６．９７％；各居群Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．２４（ＦＥ）～０．３３（ＶＧ），平
均值为０．３０，总群体为０．３５；各居群Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数为０．１６（ＦＥ）～０．２１（ＶＧ），平均值为０．１９，１０个群
体基本接近，变异幅度不大，总群体为０．２２。１０个居群中多变苜蓿居群ＶＧ以上３个指数均最高，可见在ＳＳＲ
分子标记反映的结果中多变苜蓿居群ＶＧ遗传多样性最丰富，黄花苜蓿居群ＦＥ的３个指数均最低；多变苜蓿５
个居群中３个指数最高的为居群ＶＧ，最低的为居群ＶＱ，黄花苜蓿４个居群中３个指数最高的为居群ＦＢ，最低
的为居群ＦＥ；多变苜蓿总群体多态位点百分率（９２．４２％）、Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（０．３５）、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数
（０．２２）均大于黄花苜蓿总群体指数（ＰＰＢ＝８６．３６％、Ｉ＝０．３２、ｈ＝０．２０）；紫花苜蓿复合体总群体基因分化系数为
０．１２，基因流为３．６２，多变苜蓿居群间基因流 （７．７５）大于黄花苜蓿居群间基因流（５．２１）。
ＩＳＳＲ标记下１０个居群的多态位点百分率为４７．３０％ （ＳＨ）～７５．６８％ （ＦＨ），平均值为６６．４９％，总群体为
１００％；各居群Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．１９（ＳＨ）～０．３０（ＦＨ），平均值为０．２６，总群体为０．３３；各居群Ｎｅｉ’ｓ基因
多样性指数为０．１２（ＳＨ）～０．１９（ＦＨ），平均值为０．１７，１０个群体非常接近，总群体为０．２０。与ＳＳＲ分析结果
不同的是１０个居群中黄花苜蓿居群ＦＨ以上３个指数均最高，紫花苜蓿３个指数均最低；多变苜蓿５个居群中
居群ＶＢ以上３个指数最高，居群ＶＧ最低，黄花苜蓿４个居群中居群ＦＨ以上３个指数最高，居群ＦＥ最低；多
变苜蓿总群体多态位点百分率 （９３．２４％）大于黄花苜蓿总群体（９１．８９％），但多变苜蓿总群体Ｓｈａｎｎｏｎ指数
（０．３０）和Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数 （０．１８）略小于黄花苜蓿（Ｉ＝０．３２，ｈ＝０．２０）；总群体基因分化系数为０．１８，基因
流为２．３４，基因流低于ＳＳＲ标记的分析结果，但多变苜蓿居群间基因流（５．４３）同样高于黄花苜蓿（４．９４）。黄花
苜蓿居群ＦＨ在２种分子标记下都存在特有位点，但在ＩＳＳＲ标记下紫花苜蓿存在１个特有位点。
表３ 紫花苜蓿复合体１０个居群遗传变异比较
犜犪犫犾犲３ 犌犲狀犲狋犻犮狏犪狉犻犪狋犻狅狀狅犳１０狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犕．狊犪狋犻狏犪犮狅犿狆犾犲狓
项目
Ｉｔｅｍ
标记方式
Ｍａｒｋｅｒ
黄花苜蓿
犕．犳犪犾犮犪狋犪
ＦＢ ＦＮ ＦＥ ＦＨ
平均值
Ｍｅａｎ
总计
Ｔｏｔａｌ
紫花苜蓿
犕．狊犪狋犻狏犪
ＳＨ
多变苜蓿
犕．狏犪狉犻犪
ＶＦ ＶＢ ＶＱ ＶＧ ＶＨ
平均值
Ｍｅａｎ
总计
Ｔｏｔａｌ
平均值
Ｍｅａｎ
总计
Ｔｏｔａｌ
ＰＰＢ
（％）
ＳＳＲ ６９．７０ ６８．１８ ５７．５８ ６８．１８ ６５．９１ ８６．３６ ６５．１５ ６９．７０ ７４．２４ ６６．６７ ７５．７６ ７２．７３ ７１．８２ ９２．４２６８．７９９６．９７
ＩＳＳＲ ７１．６２ ６７．５７ ６０．８１ ７５．６８ ６８．９２ ９１．８９ ４７．３０ ７１．６２ ７１．６２ ６６．２２ ６４．８６ ６７．５７ ６８．３８ ９３．２４６６．４９１００．０
ｎｅ ＳＳＲ １．３３ １．３３ １．２５ １．２９ １．３０ １．３３ １．３０ １．３５ １．３３ １．３３ １．３５ １．３５ １．３４ １．３６ １．３２ １．３６
ＩＳＳＲ １．２７ １．２９ １．３１ １．３１ １．３０ １．３２ １．１９ １．２８ １．２９ １．２６ １．２５ １．２７ １．２７ １．２９ １．２７ １．３２
Ｉ ＳＳＲ ０．３０ ０．３１ ０．２４ ０．２７ ０．２８ ０．３２ ０．２８ ０．３２ ０．３１ ０．３１ ０．３３ ０．３２ ０．３２ ０．３５ ０．３０ ０．３５
ＩＳＳＲ ０．２８ ０．２８ ０．２７ ０．３０ ０．２８ ０．３２ ０．１９ ０．２８ ０．２８ ０．２６ ０．２５ ０．２７ ０．２７ ０．３０ ０．２６ ０．３３
ｈ ＳＳＲ ０．２０ ０．２０ ０．１６ ０．１８ ０．１８ ０．２０ ０．１８ ０．２１ ０．２０ ０．２０ ０．２１ ０．２１ ０．２１ ０．２２ ０．１９ ０．２２
ＩＳＳＲ ０．１７ ０．１８ ０．１８ ０．１９ ０．１８ ０．２０ ０．１２ ０．１７ ０．１８ ０．１６ ０．１５ ０．１７ ０．１７ ０．１８ ０．１７ ０．２０
Ｇｓｔ ＳＳＲ ０．０９ ０．０６ ０．１２
ＩＳＳＲ ０．０９ ０．０８ ０．１８
Ｎｍ ＳＳＲ ５．２１ ７．７５ ３．６２
ＩＳＳＲ ４．９４ ５．４３ ２．３４
ＮＰＢ ＳＳＲ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １
ＩＳＳＲ ０ ０ ０ ２ ２ １ ０ ０ ０ ０ ０ ２ ３
ＰＰＢ：多态位点百分率Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄ；ｎｅ：有效等位变异数Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆａｌｅｌｅｓ；Ｉ：Ｓｈａｎｎｏｎ指数Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎ
ｄｅｘ；ｈ：Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｄｅｘ；Ｇｓｔ：基因分化系数Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ；Ｎｍ：基因流Ｇｅｎｅｆｌｏｗ；ＮＰＢ：特有位
点数Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｒｉｖａｔｅｂａｎｄｓ．
３９１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
２．３ 紫花苜蓿复合体亲缘关系分析
在２种分子标记下总群体Ｓｈａｎｎｏｎ指数 （０．３５，０．３３）以及Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数 （０．２２，０．２０）均高于１０个
居群的平均值（Ｉ＝０．３０，ｈ＝０．１９；Ｉ＝０．２６、ｈ＝０．１７），可反映出遗传多样性主要来源于居群内而不是居群间，群
体的ＡＭＯＶＡ分子方差分析得出ＳＳＲ标记下遗传变异的７％来源于种间，７％来源于种内居群间，８６％来源于居
群内，ＩＳＳＲ标记下遗传变异的１２％来源于种间，遗传变异的１０％来源于种内居群间，７９％来源于居群内，２种分
子标记均证明遗传变异主要分布在居群内。但２种标记对种间、居群间、居群内差异的划分并不十分明显
（表４）。
表４ 紫花苜蓿复合体１０个居群犛犛犚变异的分子方差分析
犜犪犫犾犲４ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犿狅犾犲犮狌犾犪狉狏犪狉犻犪狀犮犲（犃犕犗犞犃）犳狅狉１９０犻狀犱犻狏犻犱狌犪犾狆犾犪狀狋狊狌狊犻狀犵
６６犛犛犚犪犾犲犾犲狊犪狀犱７４犐犛犛犚犫犪狀犱狊狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔
标记方式
Ｍａｒｋｅｒ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅｏｆ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
自由度
Ｄｅｇｒｅｅｏｆ
ｆｒｅｅｄｏｍ（ｄｆ）
离差平方和
Ｓｕｍｏｆｓｑｕａｒｅｄ
ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＳＳ）
均方
Ｍｅａｎｓｑｕａｒｅｄ
ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＭＳ）
方差分量
Ｖａｒｉａｎｃｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
ｅｓｔｉｍａｔｅ（Ｅｓｔ．Ｖａｒ．）
方差分量百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｔｏｔａｌ
ｖａｒｉａｎｃｅ（％）
犘值
犘ｖａｌｕｅ
ＳＳＲ 种间Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ２ １０２．５４ ５１．２７ ０．６１ ７ ０．０７
居群间 Ａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ７ １２４．６２ １７．８０ ０．５６ ７ ０．０７
居群内 Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ １８０ １２９３．６８ ７．１９ ７．１９ ８６ ０．１４
ＩＳＳＲ 种间Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ２ １７７．４１ ８８．７０ １．１４ １２ ０．１２
居群间 Ａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ７ １８１．９１ ２５．９９ ０．９６ １０ ０．１１
居群内 Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ １８０ １３８８．２１ ７．７１ ７．７１ ７９ ０．２１
ＳＳＲ标记中Ｎｅｉ’ｓ遗传距离平均值为０．０７，ＩＳＳＲ标记中Ｎｅｉ’ｓ遗传距离平均值为０．１９。利用 Ｍａｎｔｅｌ检
测，２种分子标记下１０个居群的遗传距离相关系数（ｒ）为０．５０，犘＜０．００１，呈显著相关。ＳＳＲ与ＩＳＳＲ两种分子
标记的ＵＰＧＭＡ聚类分析表明（图１）：３个种中，黄花苜蓿与多变苜蓿关系较近，紫花苜蓿与其他２种遗传距离
较远，单独形成一支，自展支持率为１００％；紫花苜蓿的所有居群在２种标记下均聚为一类；而黄花苜蓿的ＦＥ居
群在ＳＳＲ标记下单独成为一支，且自展支持率为６５％。
图１ 基于犛犛犚（犃）及犐犛犛犚（犅）标记下紫花苜蓿复合体３个种１０个居群犖犲犻’狊遗传距离构建的犝犘犌犕犃树状图
犉犻犵．１ 犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿狊狅犳狋犺犲犵犲狀犲狋犻犮狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狊犪犿狅狀犵１０狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犕．狊犪狋犻狏犪犮狅犿狆犾犲狓犮狅狀狊狋狉狌犮狋犲犱
犳狉狅犿犲狊狋犻犿犪狋犲犱狊犻犿狆犾犲犿犪狋犮犺犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲犫犪狊犲犱狅狀犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊（犃）犪狀犱犐犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊（犅）
自展支持率标在分支上。下同。Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｓｕｐｐｏｒｔｖａｌｕｅｓａｒｅｓｈｏｗｎｗｉｔｈｔｈｅｂｒａｎｃｈｅｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
４９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
Ｓｕｎ等［２８］认为不同标记体系的数据综合起来进
图２ 基于全部分子数据的紫花苜蓿复合体３个种
１０个居群的犖犲犻’狊遗传距离犝犘犌犕犃树状图
犉犻犵．２ 犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳狋犺犲犵犲狀犲狋犻犮狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狊犪犿狅狀犵１０
狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳３狊狆犲犮犻犲狊犮狅狀狊狋狉狌犮狋犲犱犳狉狅犿犲狊狋犻犿犪狋犲犱狊犻犿狆犾犲犿犪狋犮犺犻狀犵
犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲犫犪狊犲犱狅狀犛犛犚犪狀犱犐犛犛犚犮狅犿犫犻狀犲犱犱犪狋犪
行整体分析，更能客观的反映种间关系。因此，本研
究将ＩＳＳＲ和ＳＳＲ数据合并起来，计算紫花苜蓿复合
体１０个居群的遗传距离，并构建 ＵＰＧＭＡ树。结
果显示遗传距离范围为０．０５（ＶＦ和 ＶＢ）～０．２３
（ＶＱ和ＳＨ），平均遗传距离为０．１２，大于ＳＳＲ标记
下的平均遗传距离，小于ＩＳＳＲ标记下的平均遗传
距离。基于２种分子标记构建的ＵＰＧＭＡ树（图２）
显示，多变苜蓿的所有居群聚为一支，自展支持率为
８６％。在多变苜蓿的５个居群中进一步划分为２个
亚分支，一支包含 ＶＱ、ＶＧ和 ＶＨ 居群，另一支包
含ＶＦ和ＶＢ居群。黄花苜蓿的３个居群聚为一
支，自展支持率为７９％，ＦＥ居群从其他居群中分离
出来。Ｍｅｔａｌ相关性分析证明，多变苜蓿５个居群
和黄花苜蓿４个居群的遗传距离与其相应的地理距
离（表５）不相关，相关系数（ｒ）分别为０．４９，犘＞
０．０５；－０．３２，犘＞０．１。
表５ 黄花苜蓿居群间及多变苜蓿居群间的地理距离
犜犪犫犾犲５ 犌犲狅犵狉犪狆犺犻犮犪犾犱犻狊狋犪狀犮犲狊犪犿狅狀犵狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犕．犳犪犾犮犪狋犪犪狀犱犕．狏犪狉犻犪 ｋｍ
居群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ＦＢ ＦＮ ＦＥ ＦＨ 居群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ＶＦ ＶＢ ＶＱ ＶＧ ＶＨ
ＦＢ ０．００ ＶＦ ０．００
ＦＮ ６２０．２８ ０．００ ＶＢ ２１５．０３ ０．００
ＦＥ ３５０．８５ ３５５．６６ ０．００ ＶＱ ３７８．２６ ５０４．９６ ０．００
ＦＨ ５６４．００ ２４８．６３ ４４７．３０ ０．００ ＶＧ ４３６．４７ ４７３．７８ ２０１．９８ ０．００
ＶＨ ４３７．４７ ４７８．７０ １９４．７６ ８．９９ ０．００
３ 讨论
３．１ 紫花苜蓿复合体３个种及种下居群遗传多样性分析
本研究首次以ＳＳＲ和ＩＳＳＲ标记对紫花苜蓿复合体居群内及居群间的遗传分化模式进行了探讨，结果发现，
２种分子标记的平均多态信息含量都达到了高度多态性，且ＳＳＲ及ＩＳＳＲ位点在居群内及居群间均表现为丰富
的遗传变异，表明居群内及居群间均存在丰富的遗传多样性。此外ＳＳＲ等位变异与ＩＳＳＲ位点在居群间和居群
内的变异程度极不平衡，不同位点间的变异相差较大。结果还发现ＳＳＲ标记中仅ＦＨ具有特有变异位点，ＩＳＳＲ
标记中仅居群ＦＨ和ＶＨ具有特有变异位点，这２个居群的采集地都位于新疆乌鲁木齐后峡距白杨沟１０ｋｍ
处，因此推测这个采集地的黄花苜蓿与多变苜蓿具有较丰富的遗传多样性，保存价值大。
在ＳＳＲ分子标记下的群体遗传多样性分析表明，黄花苜蓿居群ＦＥ的多态位点百分率、Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数、
Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数、ＰＩＣ指数均最低，并具有最多纯合位点，与其他居群差别较大，分析主要有以下２个原因，
１）黄花苜蓿居群ＦＥ的样品形态特征为叶片小、黄色花、荚果镰形，且生境偏旱，为黄花苜蓿的变种草原苜蓿（犕．
犳犪犾犮犪狋犪ｖａｒ．狉狅犿犪狀犻犮犪）。２）采自额敏喇嘛昭山前荒漠草原，地理分布上处于相对封闭的状态，人口牲畜来往不
频繁，不会带来太多的杂交机会。
１０个居群相比较的结果表明，ＳＳＲ标记分析中居群ＶＧ遗传多样性最高，ＦＥ遗传多样性最低，ＩＳＳＲ标记分
析中居群ＦＨ遗传多样性最高，紫花苜蓿遗传多样性最低。因此不同的分子标记在分析遗传多样性时所得到的
５９１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
结果有所不同，进一步分析发现ＶＧ位于新疆乌鲁木齐甘沟草原站的保护区内，分布区内的植被得到了当地很好
的保护，而ＦＨ具有特有变异位点，因此这２个居群在不同分子标记中表现出最丰富的遗传多样性具有其合理
性。而紫花苜蓿在ＩＳＳＲ标记中表现出较低的遗传多样性，推测与其为栽培品种有关。多变苜蓿与黄花苜蓿总
体遗传多样性相差不大，在２种分子标记中高低各有不同，但多变苜蓿多态性比率在２种分子标记中均高于黄花
苜蓿，说明多变苜蓿遗传变异略大于黄花苜蓿。
通过种间－种内、居群间－居群内各层次结构的ＡＭＯＶＡ分析发现，２种标记均显示群体遗传变异主要来
源于居群内。Ｈｉｌｄｅ和Ｌｇｏｒ［２９］认为，一年生或短命多年生、自交和演替阶段早期的类群在居群间保持有高的遗
传变异，而寿命长、异交、演替阶段晚期的类群在居群内保持有高的遗传变异。而紫花苜蓿复合体３个种均为多
年生、异交、演替阶段晚期植物，因此在居群内具有高的遗传变异与其本身生物学特性有关。
多变苜蓿５个居群之间的基因流（ＳＳＲＮｍ＝７．７５２，ＩＳＳＲＮｍ＝５．４３１）大于黄花苜蓿４个居群之间的基因
流（ＳＳＲＮｍ＝５．２１４，ＩＳＳＲＮｍ＝４．９３９）；ＳＳＲ标记中总群体基因流为３．６１９，ＩＳＳＲ标记分析中总群体基因流为
２．３３６。本研究结果中的基因流均大于一般广布种植物的基因流（Ｎｍ＝１．８８１）［３０］，且 Ｗｒｉｇｈｔ［３１］认为，当Ｎｍ值
大于１时基因流就可以防止由遗传漂变引起的居群之间的分化，因此紫花苜蓿复合体种群中的基因流防止了３
个种居群之间的分化，并防止了同源四倍体在进化过程上变得呆板。
虽然基因流对防止物种分化具有很重要的作用，但另一方面，在人类活动干扰或自然环境变化过程中，种间
基因流和杂交可能导致原生境隔离的近缘物种间产生杂交没化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｍｅｒｇｉｎｇ），使得物种间的区别不再
像以前明显进而导致物种合并［３２，３３］，形成不同分类群间遗传同化（ｇｅｎｅｔｉｃａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）现象。因此介于紫花苜蓿
复合体３个种之间具有的杂交现象，其种群的基因流会随时间而改变，需定时对其进行测定，以了解当前这３个
种的遗传分化。
３．２ 紫花苜蓿复合体３个种的亲缘关系分析
从聚类图上分析，ＳＳＲ与ＩＳＳＲ数据合并构成的聚类图不仅符合２个标记共有的特征，且所反映三者之间的
关系更为客观。ＵＰＧＭＡ树上形成３个主要的分支，紫花苜蓿独立成一支，来源于同一采集地的黄花苜蓿居群
ＦＨ与多变苜蓿居群ＶＨ都已分开，充分说明多变苜蓿、黄花苜蓿和紫花苜蓿虽然遗传关系较近，但三者之间仍
可以得到有效地划分，因此尽管这３个种之间的遗传关系非常近，但本研究仍支持将多变苜蓿、黄花苜蓿和紫花
苜蓿划分为３个种。很长一段时间，黄花苜蓿是否应当划分为一个单独的种都存在争议。Ｂｒｕｍｍｅｒ等［３４］采用
ＲＦＬＰ分析二倍体和四倍体苜蓿发现黄花苜蓿与犕．犮犪犲狉狌犾犲犪不同，能有效的区分。Ｈａｖａｎａｎｄａ等［３５］基于叶绿
体和线粒体基因同样也讨论了黄花苜蓿与犕．犮犪犲狉狌犾犲犪的关系，叶绿体的结果显示黄花苜蓿明显的与较原始的
种犕．犮犪犲狉狌犾犲犪分别开来，而线粒体的结果却不明显。因四倍体的紫花苜蓿是由犕．犮犪犲狉狌犾犲犪直接进化而来，故
本研究中基于ＳＳＲ和ＩＳＳＲ两种分子标记分析的结果与 Ｈａｖａｎａｎｄａ等［３５］的研究结果相似。而孙毅等［３６］利用核
基因ＩＴＳ的研究结果显示黄花苜蓿与紫花苜蓿应该合并为一个种。因此，这些研究结果并不能决定这３个分类
群为种或亚种，但可以确定的是他们的ＤＮＡ序列很不相同，利用不同的基因片段分析得出的结果会不一样。从
地理分布和物种特性上来看，完全野生的紫花苜蓿没有记载，而黄花苜蓿多为野生分布。因此本研究支持将这３
个分类群作为３个种的划分。遗传关系显示多变苜蓿与黄花苜蓿关系较近，这与李拥军和苏加楷［１０］利用ＲＡＰＤ
分子标记所得到的结果有所不同，他认为多变苜蓿与紫花苜蓿遗传距离更小。
多变苜蓿、黄花苜蓿各居群的遗传距离与其地理距离相关性分析发现没有显著相关性存在于多变苜蓿及黄
花苜蓿的遗传距离与地理距离之间。这主要由于紫花苜蓿各居群的生长环境不一致导致，而黄花苜蓿居群ＦＥ
主要为草原苜蓿与其他居群遗传分化较大，明显区分于其他居群分支而单独存在。因此本研究的分子标记所得
到的结果支持Ｌｅｓｉｎｓ和Ｌｅｓｉｎｓ［７］的结论，即草原苜蓿为黄花苜蓿一个变种的分类学地位。
通过以上研究，得出以下３个结论：１）多变苜蓿居群ＶＧ和黄花苜蓿居群ＦＨ在１０个居群中遗传多样性最
高，并且居群ＦＨ及居群ＳＨ含有特有多态性位点，因此需要加强保护。２）本研究结果支持仍将紫花苜蓿复合体
３个分类群划分为３个种。３）ＳＳＲ和ＩＳＳＲ标记作为研究紫花苜蓿复合体的遗传多样性及遗传关系是非常有效
的分子标记。
６９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
致谢：感谢牧草植物分类学专家崔乃然教授的指导，感谢新疆畜牧科学院李捷老师提供的帮助。
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狏犪狉犻犪ａｎｄ犕．狊犪狋犻狏犪，ｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｔｈｅ犕．狊犪狋犻狏犪ｃｏｍｐｌｅｘｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇ１５ｐａｉｒｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄ１０
ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＶＧｏｆ犕．狏犪狉犻犪ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
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ｌｅｖｅｌ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｏｍｐｌｅｘ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
８９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１