全 文 ：书贵州野生匍匐剪股颖种质资源
遗传多样性的犐犛犛犚分析
尚以顺１，杨春燕２，钟理１
（１．贵州省草业研究所，贵州 独山５５８２００；２．都匀市农业局，贵州 都匀５５８０００）
摘要：匍匐剪股颖是我国重要的冷季型草坪草之一。为了研究贵州野生匍匐剪股颖居群遗传变异水平、遗传结构
及亲缘关系，本试验采用ＩＳＳＲ标记技术对贵州的４个匍匐剪股颖居群共２８５个个体进行了遗传变异分析。９个引
物共扩增出８１条带，其中多态性条带６６条，无论是在居群水平还是在物种水平，均表明贵州野生匍匐剪股颖居群
存在丰富的遗传变异；３个野生居群间遗传分化系数（犌狊狋）为０．４９２０，居群间基因流的估测值（犖犿）为０．５１６４，表
明居群间存在较为严重的遗传分化；亚居群间的遗传距离（犌犇）为０．０８７７～０．５９２６，遗传距离（犌犇）的聚类分析结
果与居群地理分布存在密切联系。利用ＳＰＳＳ１１．０软件对地理距离与亚居群间遗传距离相关性进行分析，表明地
理距离与遗传距离呈显著正相关（狉＝０．４９４）；用ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１软件对居群间的遗传关系分析表明，各居群间的
遗传一致度比较高，分布为０．７００３～０．９４０９，但栽培居群（ＫＲＯＭＩ）与其他３个野生居群存在明显的遗传差异。
关键词：匍匐剪股颖；遗传多样性；ＩＳＳＲ
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．２；Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０３００６７０７
　 匍匐剪股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪）隶属禾本科剪股颖属［１］，该属植物全世界已知有２００多种，多分布于寒温
带，尤以北半球居多，在我国有２９个种１０个变种，主要分布于四川东部、云南、贵州及华东、华中等省区［２］。匍匐
剪股颖是目前国内重要的冷季型草坪草之一，在绿化草坪及高尔夫球场、足球场等运动草坪中广为运用。国内对
匍匐剪股颖引进品种的草坪建植、病虫害防治等方面的研究较多，但涉及到野生种质资源收集、评价方向的较少。
ＩＳＳＲ标记，又称简单序列重复区间扩增多态性（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）标记，是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ
等［３］于１９９４年创建的一种ＤＮＡ标记技术，有多态性丰富、试验稳定性好等优点，现已成功应用于多个物种遗传
多样性的研究［４～８］。本试验采用ＩＳＳＲ分子标记技术研究贵州野生匍匐剪股颖种质资源的遗传变异，以了解贵州
野生匍匐剪股颖遗传多样性水平及在不同空间尺度的变化，野生居群遗传结构及野生居群间的遗传关系，为野生
匍匐剪股颖种质资源的合理开发利用提供依据 。
１　材料与方法
１．１　供试材料及ＤＮＡ提取
材料为产于贵州省的野生匍匐剪股颖，详见表１。ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法［９］，混合取样，即每亚居群采集
１５个单株的叶片，等量混合后，提取叶片总ＤＮＡ，以国外品种克罗米（ＫＲＯＭＩ）为对照，进行ＩＳＳＲ分析。
１．２　剪股颖ＩＳＳＲ反应体系的建立
试验于２００７年１０月进行。采用鸭茅（犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪）［１０］、剪股颖属［１１］反应体系，通过试验最终确定剪
股颖ＩＳＳＲ分子标记的最优化反应体系为２５μＬ，包含：１７．６μＬｄｄＨ２Ｏ、１μＬ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）ｄＮＴＰｓ、２μＬ１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、２μＬ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｇ
２＋、０．４Ｕ（２．５Ｕ／Ｌ）Ｔａｑ酶、１μＬＰｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ）、ＤＮＡ模板５０ｎｇ。经试验优
化后确定其扩增条件为：９４℃预变性７ｍｉｎ，３５个循环，９４℃变性３０ｓ，５０℃复性４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ；循环结束
后７２℃延伸７ｍｉｎ，ＰＣＲ扩增产物在４℃冰箱保存。
第１８卷　第３期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
６７－７３
２００９年６月
 收稿日期：２００８１１２０；改回日期：２００９０２０３
基金项目：贵州省草业工程技术中心建设项目［黔科合农字（２００５）４００２号］，贵州省省长基金项目［合同号：黔省专合字（２００６）８７号］和贵州省
“十一五”攻关项目［黔科合ＮＹ字（２００８）３０４７号］资助。
作者简介：尚以顺（１９６９），男，贵州岑巩人，副研究员。Ｅｍａｉｌ：ｇｚｓｙｉｓｈｕｎ＠ｖｉｐ．ｃｏｍ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｌｉｙｃｙ＠１２６．ｃｏｍ
表１　供试材料来源
犜犪犫犾犲１　犗狉犻犵犻狀狊狅犳犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
亚居群
Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
采集地点
Ｏｒｉｇｉｎｓ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ（ｍ）
生境情况
Ｈａｂｉｔａｔ
备注
Ｒｅｍａｒｋ
毕节东南区
Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ
ｏｆＢｉｊｉｅ
（ＢＳＥ）
１ 亚居群ＢＳＥ１ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ１ 清镇市城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＱｉｎｇｚｈｅｎ ９７０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 优势种Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
２ 亚居群ＢＳＥ２ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ２ 黔西县灵泉镇Ｌｉｎｇｑｕａｎ，Ｑｉａｎｘｉ １３９０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
３ 亚居群ＢＳＥ３ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ３ 黔西县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＱｉａｎｘｉ １２６０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
４ 亚居群ＢＳＥ４ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ４ 纳雍县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＮａｙｏｎｇ １３４０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
５ 亚居群ＢＳＥ５ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ５ 纳雍县王家寨 Ｗａｎｇｊｉａ，Ｎａｙｏｎｇ １５００ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 优势种Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
６ 亚居群ＢＳＥ６ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＳＥ６ 织金县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＺｈｉｊｉｎ １５８０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
毕节西北区
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ
ｏｆＢｉｊｉｅ
（ＢＮＷ）
７ 亚居群ＢＮＷ１ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ１ 大方县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＤａｆａｎｇ １６００ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
８ 亚居群ＢＮＷ２ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ２ 大方县黄泥塘镇 Ｈｕａｎｇｎｉｔａｎｇ，Ｄａｆａｎｇ １５９０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
９ 亚居群ＢＮＷ３ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ３ 毕节市朱镇Ｚｈｕ，Ｂｉｊｉｅ １５００ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１０ 亚居群ＢＮＷ４ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ４ 毕节市城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＢｉｊｉｅ １５７０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１１ 亚居群ＢＮＷ５ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ５ 威宁县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＷｅｉｎｉｎｇ ２３７０ 稻田Ｐａｄｄｙｆｉｅｌｄ优势种Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
１２ 亚居群ＢＮＷ６ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ６ 赫章县野马川镇Ｙｅｍａｃｈｕａｎ，Ｈｅｚｈａｎｇ ２０８０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１３ 亚居群ＢＮＷ７ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＢＮＷ 赫章县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＨｅｚｈａｎｇ １８４０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
六盘水地区
Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ
（ＬＰＳ）
１４ 亚居群ＬＰＳ１ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＬＰＳ１ 普定县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＰｕｄｉｎｇ １４６０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１５ 亚居群ＬＰＳ２ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＬＰＳ２ 水城县城郊ＳｕｂｕｒｂｏｆＳｈｕｉｃｈｅｎｇ １７５０ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１６ 亚居群ＬＰＳ３ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＬＰＳ３ 六枝特区郎岱镇Ｌａｎｇｄａｉ，Ｌｉｕｚｈｉ ２１００ 山坡 Ｈｉｌｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１７ 亚居群ＬＰＳ４ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＬＰＳ４ 六盘水市钟山区Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ，Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ１７８０ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
１８ 亚居群ＬＰＳ５ＳｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＬＰＳ５ 六盘水市梅花山 Ｍｅｉｈｕａｓｈａｎ，Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ２２００ 路边Ｒｏａｄｓｉｄｅ 伴生种Ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓ
对照ＣＫ １９ ＫＲＯＭＩ（美国品种Ａｍｅｒｉｃａｎｓｐｅｃｉｅｓ） 引进品种Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｃｕｌｔｉｖａｒ － － －
１．３　引物筛选、扩增及检测
试验从哥伦比亚大学提供的９６条引物序列中选出６０条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，采用
表型差异大的ＢＳＥ１、ＢＮＷ２、ＬＰＳ２三个亚居群ＤＮＡ对６０条引物进行筛选，将多态性好、重复性稳定、扩增条带
清晰的ＵＢＣ８１０、ＵＢＣ８１１、ＵＢＣ８１２、ＵＢＣ８１７、ＵＢＣ８３１、ＵＢＣ８３４、ＵＢＣ８３９、ＵＢＣ８４０、ＵＢＣ８６０共９条引物进行正
式试验。扩增在ＢＩＯ－ＲＡＤ公司生产的 ＭｙＣｙｃｌｅｒＴＭＰＣＲ仪上进行。扩增产物用１．４％的琼脂糖凝胶进行电泳
检测，在每个样品中加入４μＬ电泳指示液（溴酚蓝０．２５％，蔗糖４０％）混匀，每个泳道上样５μＬ，在１００Ｖ电压下
电泳３ｈ左右，将胶板放于０．５μｇ／ｍＬ的ＥＢ溶液中染色３０ｍｉｎ，然后在ＢｉｏＳｅｎｓＳＣ８１０系列凝胶成像系统上观
察、拍照。
１．４　统计分析
１．４．１　居群遗传多样性及遗传结构分析　对获得的ＤＮＡ条带进行统计，在相同迁移位置，扩增清晰的条带记
为“１”，否则记为“０”，构建０／１数据矩阵。应用ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１软件，假定居群处于 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡状
态，计算多态性位点百分比（犘犘犅），平均每个位点的观测等位基因数（犖犪），平均每个位点的有效等位基因数
（犖犲），Ｎｅｉ氏多样性指数（犺），Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐），总的基因多样度（犎狋）和各居群内的多样度（犎狊）；基因分
化系数（犌狊狋）和基因流（犖犿）。各指数的计算公式为：
多态位点百分率 （犘犘犅）：犘犘犅＝犽／狀×１００％
式中，犽为多态位点数目；狀为位点总数。多态位点指在某一基因位点上最常见的等位基因的频率小于或等于
０．９９的位点。
平均每个位点的观测等位基因数（犖犪）：犖犪＝∑狓／狀
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
式中，∑狓为所有测定位点上等位基因的数目之和；狀为测定位点总数。
平均每个位点的有效等位基因数（犖犲）：犖犲＝∑犢／狀
式中，∑犢 为所有测定位点上有效等位基因的数目之和；狀为测定位点总数。
Ｎｅｉ氏多样性指数（犺）：犺＝犎狋－犎狊
Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐）：犐＝－∑π犻ｌｎπ犻
πｉ为某条扩增带在某种群内出现的频率。
总的基因多样度（犎狋）：犎狋＝１－∑犻∑犼－＞犿犘犻犼２／犿
式中，犘犻犼表示第犼位点第犻等位基因的频率；犿表示位点总数。
各居群内的多样度（犎狊）：犎狊＝１－犑犛
式中，犑犛 表示居群内种群一致度。
基因分化系数（犌狊狋）：犌狊狋＝（犎犜－犎犛）／犎犜
犎犜 表示整个居群的的基因多样度，犎犛 表示居群内基因多样度。
基因流（犖犿）：犖犿＝（１－犌狊狋）／４犌狊狋
１．４．２　聚类分析　用ＮＴＳＹＳ２．１软件采用算数平均数的非加权成组配对法（ＵＰＧＭＡ）对各亚居群根据Ｎｅｉ氏
遗传距离进行聚类分析。
１．４．３　相关性分析　采用ＳＰＳＳ１１．０软件对亚居群间地理距离和遗传距离之间的相关性进行分析，并作显著性
检测。
２　结果与分析
２．１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
试验采用９条ＩＳＳＲ引物对３个野生匍匐剪股颖居群进行扩增，共检测到８１条条带，多态性条带６６条，多态
位点百分率为８１．４８％。其中每条引物扩增的条带数为５～１３条，平均每条引物扩增７．３３条，通过与 Ｍａｒｋｅｒ的
比较分析，扩增的条带片断大小为１２０～１５００ｂｐ。其ＵＢＣ８１０号引物扩增的ＩＳＳＲ标记指纹图谱见图１和２。
图１　犝犅犆８１０号引物犘犆犚扩增电泳图谱
犉犻犵．１　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫犪狀犱狊犫狔狆狉犻犿犲狉犖狅．犝犅犆８１０
图２　犝犅犆８１２号引物犘犆犚扩增电泳图谱
犉犻犵．２　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫犪狀犱狊犫狔狆狉犻犿犲狉犖狅．犝犅犆８１２
９６第１８卷第３期 草业学报２００９年
２．２　野生匍匐剪股颖的遗传多样性分析
在各居群水平上多态性条带比率（犘犘犅）分布范围为４３．２１％～５９．２６％，平均值为５０．２１％（表２）。３个野生
居群中，毕节东南居群（ＢＳＥ）多态性条带比率最大，其对应的Ｎｅｉ氏多样性指数（犺）与Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐）也
为最大值，表明该居群遗传多样性最为丰富；其次为毕节西北居群（ＢＮＷ）；六盘水居群（ＬＰＳ）遗传多样性最低。
表２　匍匐剪股颖居群间遗传变异
犜犪犫犾犲２　犌犲狀犲狋犻犮狏犪狉犻犪狋犻狅狀犪犿狅狀犵狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
多态性位点比率
犘犘犅（％）
观察等位基因数
犖犪（ｓ．ｄ．）
有效等位基因数
犖犲（ｓ．ｄ．）
Ｎｅｉ氏多样性指数
犺（ｓ．ｄ．）
Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数
犐（ｓ．ｄ．）
ＢＳＥ ５９．２６ １．５９２６（０．４９４４） １．３３３０（０．３５２３） ０．２００４（０．１９２１） ０．３０３６（０．２７６７）
ＢＮＷ ４８．１５ １．４８１５（０．５０２８） １．２６２６（０．３４９２） ０．１５７１（０．１８９２） ０．２３９０（０．２７３６）
ＬＰＳ ４３．２１ １．４３２１（０．４９８５） １．２８４０（０．３９７９） ０．１５８８（０．２０５７） ０．２３４８（０．２９１４）
平均Ａｖｅｒａｇｅ ５０．２１ １．５０２１ １．２９３２ ０．１７２１ ０．２５９１
物种水平Ｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌ ８１．４８ １．８１４８（０．３９０９） １．３９８２（０．３４８７） ０．２４１４（０．１７９０） ０．３７１９（０．２４６３）
　犘犘犅：Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ；犖犪：Ｏｂｓｅｒｖｅｄｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｅｌｅｓ；犖犲：Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｅｌｅｓ；犺：Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；犐：
Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ
Ｎｅｉ氏多样性指数（犺）分布为０．１５７１～０．２００４，Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐）变化与其趋于一致，经ＳＰＳＳ１１．０
软件进行相关性检验，两者达到极显著相关水平（狉＝０．９９９，犘＜０．０１）。物种水平多态位点比率（犘犘犅）远高于居
群平均水平，为８１．４８％，相应地，物种水平Ｎｅｉ氏多样性指数（犺）与Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐）也远高于居群水平
对应指数。
２．３　贵州野生匍匐剪股颖居群遗传结构分析
居群间遗传分化分析结果表明，匍匐剪股颖野生居群内遗传多样性（犎狊）为０．１２９１，总的遗传多样性（犎狋）
为０．２５４。遗传分化系数（犌狊狋）为０．４９２，即分布在居群间的遗传变异占总遗传变异的４９．２％，居群内遗传变异占
５０．８％。居群间基因流的估测值（犖犿）为０．５１６４，表明居群间存在较强的遗传分化。
２．４　贵州野生匍匐剪股颖亚居群、居群间遗传距离及聚类分析
通过对贵州野生匍匐剪股颖各亚居群遗传关系分析可知，各亚居群间的Ｎｅｉ氏遗传距离（犌犇）值为０．０８７７
～０．５９２６，变幅为０．４９５１，平均遗传距离（犌犇）为０．４６５２。
基于Ｎｅｉ氏遗传距离（犌犇），对匍匐剪股颖各亚居群进行聚类分析（图３）。匍匐剪股颖可分为三大类，即来
自毕节东南居群的ＢＳＥ１、ＢＳＥ２、ＢＳＥ３三个亚居群聚为第Ⅰ类；第Ⅲ类包含了毕节西北居群的ＢＮＷ３、ＢＮＷ４、
ＢＮＷ５、ＢＮＷ６、ＢＮＷ７五个亚居群；第Ⅱ类聚类情况相对较为复杂，包含了六盘水的所有亚居群，以及毕节西北
居群的ＢＳＥ４、ＢＳＥ５、ＢＳＥ６三个亚居群和毕节东南居群的ＢＮＷ１、ＢＮＷ２二个亚居群。利用ＳＰＳＳ１１．０软件对
地理距离与遗传距离的相关性进行分析，结果表明地理距离与遗传距离呈显著正相关（狉＝０．４９４）。
用ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１对各居群间的亲缘关系做进一步分析，计算各居群间的Ｎｅｉ氏遗传一致度和遗传距离的
无偏估计值（表３），各居群间的遗传一致度比较高，变化范围为０．７００３～０．９４０９。
基于Ｎｅｉ氏遗传距离，采用ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析（图４），毕节西北居群与六盘水居群遗传距离最小，最
先聚为一类；与毕节东南居群次之，聚为第二类。这为毕节东南地区与西北地区因海拔、生境差异大而划分为两
大居群提供了合理的解释。对照（ＫＲＯＭＩ）为美国品种，引进后人工繁育的居群，与三大野生居群遗传距离范围
为０．２４６２～０．３５６２，远大于野生居群间的遗传距离，表现出较大的遗传差异。
３　讨论
３．１　匍匐剪股颖野生居群的遗传多样性
试验采用多态性位点比率、Ｎｅｉ氏多样性指数及Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数对贵州野生匍匐剪股颖遗传多样性进
０７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
图３　匍匐剪股颖基于犖犲犻氏遗传距离的犝犘犌犕犃聚类图
犉犻犵．３　犇犲狀犵狉狅犵狉犪犿狅犳犝犘犌犕犃犮犾狌狊狋犲狉犪狀犪犾狔狊犻狊犫犪狊犲犱狅狀犖犲犻’狊犵犲狀犲狋犻犮
犱犻狊狋犪狀犮犲犪犿狅狀犵狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪
行评价，结果表明，贵州野生匍匐剪股颖多态性位点百
分率为８１．４８％，Ｎｅｉ氏多样性指数为０．２４１４，Ｓｈａｎ
ｎｏｎ多样性指数为０．３７１９，与ＩＳＳＲ标记分析的其他
物种相比较［１２～１５］，野生匍匐剪股颖遗传多样性较为丰
富。
３．２　匍匐剪股颖野生居群的遗传结构和分化
就单个居群而言，匍匐剪股颖多态性位点比率
（犘犘犅）并不高，３个野生居群分别为５９．２６％（毕节东
表３　居群间犖犲犻氏遗传距离（左下角）和遗传一致度（右上角）
犜犪犫犲３　犖犲犻′狊犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲（犫犲犾狅狑犱犻犪犵狅狀犪犾）犪狀犱犵犲狀犲狋犻犮
犻犱犲狀狋犻狋狔（犪犫狅狏犲犱犻犪犵狅狀犪犾）狅犳犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪
居群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ＢＮＷ ＢＳＥ ＬＰＳ ＫＲＯＭＩ
ＢＮＷ  ０．８８７１ ０．８７６１ ０．７００３
ＢＳＥ ０．１１９８  ０．９４０９ ０．７７２８
ＬＰＳ ０．１３２２ ０．０６０９  ０．７８１８
ＫＲＯＭＩ ０．３５６２ ０．２５７７ ０．２４６２ 
图４　匍匐剪股颖基于犖犲犻氏遗传距离的犝犘犌犕犃聚类图
犉犻犵．４　犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿犫犪狊犲犱狅狀犖犲犻’狊犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲犪犿狅狀犵狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪犫狔犝犘犌犕犃
南居群）、４８．１５％（毕节西北居群）、４３．２１％（六盘水居群），远低于物种水平８１．４８％，这表明匍匐剪股颖居群间
存在较为强烈的分化。根据ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１分析结果，来自群体间的遗传变异占总变异的４９．２％，低于一般的
自花授粉植物［１６］，高于一般的异花授粉植物［１７］，这与匍匐剪股颖无性繁殖能力强、异花授粉的特性有关。
根据聚类结果，各亚居群呈明显的地域性分布，来自相同地区或地理位置较近的亚居群能聚为一类（如：来自
清镇的２个亚居群）。这表明地理位置对匍匐剪股颖种质交换造成一定的影响，地理距离与遗传距离显著正相关
也证明了这一结果。除地理距离之外，海拔对遗传分化也有一定的影响，聚为第Ⅰ类的３个亚居群海拔较低，而
１７第１８卷第３期 草业学报２００９年
聚为第Ⅲ类的５个亚居群海拔偏高，这可能是因海拔差异而引起的生殖隔离产生的后果，分布在不同海拔的亚居
群，因温度差异而导致物候期（主要是开花期）不一致，从而引起生殖隔离。
除交配系统及隔离机制之外，匍匐剪股颖居群大小结构对居群分化也造成很大的影响。匍匐剪股颖多以小
亚居群的形式存在于自然界中，亚居群间的空间隔离很可能限制了不同亚居群个体间的相互基因交流。在漫长
的进化过程中适应新的微生境的遗传变异体得以保存下来，致使同一亚居群的个体在遗传多样性上愈来愈呈现
出明显的趋同性，这从一方面也解释了匍匐剪股颖物种水平遗传多样性远高于居群水平遗传多样性的原因。
３．３　混合取样法对群体遗传学统计量的影响
混合取样法从本质上来说，就是选取一定合理数目的单株混合组成一个样品，提取混合样品的ＤＮＡ，从而代
表整个居群进行居群间遗传多样性研究。它与提取单株ＤＮＡ最主要的区别在于，混合取样法无法计算个体之
间的差异，但用于居群间遗传多样性的研究时是可行的，马丹炜等［１８］曾将每个金发草（犘狅犵狅狀犪狋犺犲狉狌犿狆犪狀犻犮犲狌犿）
居群１５个个体的叶片进行混合，提取总ＤＮＡ，对２２个金发草居群间的遗传关系进行了研究。与提取单株植物
ＤＮＡ相比，混合取样法计算出群体遗传学统计量的差别，来源于检测到的等位基因数目减少。因此，选择合适数
目的单株进行混合对试验结果的准确性尤为关键。王铁固等［１９］和刘雪等［２０］通过４种多株叶片混合ＤＮＡ取样
方法对检测等位基因数目的影响，研究结果表明，当所选取混合的单株数目过多而造成等位基因漏检，这会使检
测到的群体遗传信息有所降低，但同时也表明，如果选择合理数目的单株组成一个混样，基本能反映出一个居群
的遗传变异，混合取样法用于居群间的遗传多样性研究是可行的。
综合以上研究结果，混合取样法单株数目主要受到两方面的限制，一方面为了代表整个居群的遗传变异，需
要选取一定数目的个体，一般来说，选取个体数目越多，越能代表整个居群的遗传变异，结果越准确；另一方面，混
合取样包含的单株数目太多，可能检测不出一些频率很低的等位基因，这会使检测到的群体遗传信息有所降低。
因此在一个较大的居群，所含个体数目过多时，另一种混合取样方法更趋于合理，即用包括少量个体组成的多个
混样（用５～１０个个体组成２个以上的混样）用来代表一个居群进行研究。
本试验鉴于贵州野生匍匐剪股颖主要以小范围的居群形式（分布范围多在２００ｍ２ 内）存在，同时因其无性繁
殖能力强，为避免收集到同一无性系克隆后代，在采样时还需间隔一定距离（因分布范围大小而不同，３～５ｍ），
综合这两方面的原因，取１５个单株叶片混合代表整个亚居群的遗传变异是适宜的；当所选取混合的单株数目过
多而造成等位基因漏检时，扩增带型会有一定的表现，比如带型模糊，弱带、杂带多。从本试验结果来看，采取１５
个单株混合能获得较清楚的带型，混合取样法是可行的。
３．４　匍匐剪股颖野生居群保护
物种的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存适应和发展进化的前提，是生命进化和物种分化的基
础。根据试验分析结果，贵州野生匍匐剪股颖遗传多样性水平较高，表明它能较好的适应当前环境，但贵州野生
匍匐剪股颖分布区域多为岩溶地区，石漠化程度严重，生态环境极其脆弱，因此，其野生种质资源的保护也不容忽
视。根据匍匐剪股颖呈地域性分布、居群遗传分化较强等研究结果，在今后的材料收集中，应保证材料来源的生
境多样性、海拔多样性，才能建立基因型丰富的种质资源库。
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犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪
犵犲狉犿狆犾犪狊犿狉犲狊狅狌狉犮犲狊犻狀犌狌犻狕犺狅狌
ＳＨＡＮＧＹｉｓｈｕｎ１，ＹＡＮＧＣｈｕｎｙａｎ２，ＺＨＯＮＧＬｉ１
（１．ＧｕｉｚｈｏｕＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｕｓｈａｎ５５８２００，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
ＢｕｒｅａｕｏｆＤｕｙｕｎ，Ｄｕｙｕｎ５５８０００，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪ｉｓａｗｉｄｅｌｙｇｒｏｗｎ，ｃｏｏｌｓｅａｓｏｎｔｕｒｆｇｒａｓｓｉｎＣｈｉｎａ．Ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉ
ｔｙａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆ犃．狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２８５ｐｌａｎｔｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅｗｉｌｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓａｎｄａｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎｉｎＧｕｉｚｈｏｕｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｎｉｎｅｏｆ６０ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｐｒｏ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＩＳＳＲ
３７第１８卷第３期 草业学报２００９年