全 文 ：书冷诱导转录因子犃狋犆犅犉１转化紫花苜蓿的研究
徐春波１，２，王勇１，赵海霞２，米福贵１
（１．内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古 呼和浩特０１００１８；２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特０１００１０）
摘要：为研究冷诱导转录因子犆犅犉１（Ｃｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因对我国优良豆科牧草紫花苜蓿的抗寒性改良作
用，本实验以拟南芥基因组ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ方法克隆得到了冷诱导转录因子犃狋犆犅犉１基因，测序结果表明
所克隆的ＤＮＡ片段长度为６４２ｂｐ，将该序列与ＧｅｎＢａｎｋ上的犆犅犉１基因序列进行ＤＡＮＭＡＮ序列比较分析，同
源性可达９９．８４％。在此基础上成功构建了含有犃狋犆犅犉１基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１，并采用根癌农杆菌
介导法对紫花苜蓿进行了遗传转化，获得了经卡那霉素筛选的抗性转化植株，进一步经ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测，得
到了６５０ｂｐ左右的电泳条带，表明犃狋犆犅犉１基因已在紫花苜蓿中得到表达。这为选育紫花苜蓿抗寒新品种奠定了
良好的基础。
关键词：紫花苜蓿；犆犅犉１基因；遗传转化；抗寒性
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４１＋．１０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１６８０７
　　紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）简称苜蓿，是全世界栽培历史最悠久、面积最大、利用最广泛的一种豆科多年生
优质牧草。它具有蛋白质含量高、草质好、营养丰富等特点，还具有固氮、保持水土等作用，故又将其称之为“牧草
之王”［１３］。近年来，随着我国草地畜牧业的发展和农业产业结构的调整，草产业呈现出强劲的发展势头。苜蓿作
为草产业发展的主导草种，它在北方高纬度、冬季严寒、倒春寒常出现等地区的安全越冬问题，一直是制约上述地
区草产业健康发展的突出问题。因此，如何在短时间内培育出适合我国北方高纬度等地区种植的抗寒高产苜蓿
新品种，便成为一个急待解决的问题。转基因技术的快速发展和在苜蓿育种中的应用［４６］，为快速选育抗寒高产
苜蓿品种提供了新的研究手段。
ＣＢＦ１转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用因子［７９］。它能与ＣＲＴ／ＤＲＥＤＮＡ［Ｃｒｅｐｅａｔ／ｄｅｈｙ
ｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＤＲＥ）ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ］调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件
的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种耐逆机制［１０］。目前已经在油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪
狆狌狊）、番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）和黄瓜（犆狌犮
狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）等［１１２０］植物中得到了应用。金建凤等［２１］、吴关庭等［２２］和林秀锋等［２３］均利用农杆菌介导法成功地
将抗冻转录激活因子基因犆犅犉１转入水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪），并获得了Ｔ１ 代转基因植株。金建凤等［２１］的研究结果
表明，Ｔ１ 代植株体内的脯氨酸含量均比野生型明显提高，同时，耐低温表型也在Ｔ１１株系中出现。吴关庭等［２２］
和林秀锋等［２３］对Ｔ１ 代进行低温试验表明，转基因株系的叶片相对电导率显著或极显著低于对照，转基因植株比
对照的抗寒能力提高。袁维风等［２４］和金万梅等［２５］利用根癌农杆菌介导法将犆犅犉１基因导入草莓（犉狉犪犵犪狉犻犪
犪狀犪狀犪狊狊犪）的不同品种中，采用电解质渗漏法对转基因株系进行抗寒生理鉴定结果显示，转基因株系的电导率普
遍低于对照。金万梅等［２５］采用生长恢复法抗寒鉴定结果表明，将转基因株系和对照于－２～０℃放置７ｄ，在转基
因株系８３中有６５％的植株出现了萎蔫，而对照植株有９１％出现了萎蔫，经２２～２５℃下进行恢复生长，转基因株
系８３有７４％完全恢复，而对照株系只有１８％恢复，转基因草莓的抗寒能力较未转化植株有明显提高，且不同转
基因株系之间提高程度有差异。王渭霞等［２６］将来源于拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的犆犅犉１基因通过农杆菌
１６８－１７４
２０１２年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１１０６２０；改回日期：２０１１１１０９
基金项目：内蒙古自然科学基金项目（２０１１ＭＳ０４０２）和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院草原研究所）项目
（１６１０３３２０１１００３）资助。
作者简介：徐春波（１９７９），女，内蒙古扎兰屯人，助研，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｘｃｂ９７２００２＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍｆｇｕｉｎｍ＠１６３．ｃｏｍ
法导入松南结缕草（犣狅狔狊犻犪ｓｐ．）植株中，ＰＣＲ验证后１８７株表现为阳性。阳性植株移栽成活后，离体叶片抗巴龙
霉素检测表明１８７株均表现出抗性。
本实验以拟南芥基因组ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ（聚合酶链式反应，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法克隆得到了
冷诱导转录因子犃狋犆犅犉１基因，在此基础上成功构建了含有此基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１，并采用根癌农
杆菌介导法对紫花苜蓿进行了遗传转化，经ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ（反转录ＲＣＲ，ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ）检测，得
到了６５０ｂｐ左右的电泳条带，表明犃狋犆犅犉１基因已在紫花苜蓿中得到表达。这为选育紫花苜蓿抗寒新品种奠定
了良好的基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料　拟南芥为哥伦比亚生态型，由北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心提供；紫花苜蓿
品种为“Ｈｕｎｔｅｒｒｉｖｅｒ”，由中国农业科学院草原研究所提供。
１．１．２　菌株及载体　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌株Ｃ５８、质粒
ｐＢＩ１２１由北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心园林实验室保存；载体ｐＧＥＭＴｖｅｃｔｏｒ（简称Ｔ载体）购
自上海生物工程有限公司。
１．１．３　供试试剂　实验中所用的各种限制性内切酶、ＲＮａｓｅＡ、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、Ｔ４连接酶等购自ＴａＫａＲａ公司；
质粒小提试剂盒、Ｔ载体连接试剂盒等购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｍａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ公司；其他化学试剂均为国产
分析纯产品。
１．２　方法
１．２．１　引物设计　根据ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ已报道犆犅犉１基因的ＤＮＡ序列，应用ＤＮＡＭＡＮ软件设计引物（ＣＢＦ１
ＢａｍＨＩ５′端：５′ＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧ３′；ＣＢＦ１Ｓａｃ１３′端：５′ＴＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＡ
ＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧ３′），由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
１．２．２　犃狋犆犅犉１基因的克隆　以拟南芥基因组ＤＮＡ为模板，用设计好的引物进行ＰＣＲ扩增，反应体系２０μＬ，
反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ；１８℃反应结束。
ＰＣＲ产物连接Ｔ载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态，在含有ＩＰＴＧ（异丙基βＤ硫代吡喃半乳糖苷，ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ
Ｄ１ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）和Ｘｇａｌ（５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷，５ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｌｙｌβＤｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ）的ＬＢ＋Ａｍｐ（细菌培养，ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ＋氨苄青霉素，ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）固体平板上筛选白色菌落，对重组子Ｔ
ＣＢＦ１进行ＰＣＲ和酶切检测鉴定后，送交北京奥科生物技术有限责任公司进行测序验证。
１．２．３　植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１的构建　将质粒ｐＢＩ１２１和质粒 ＴＣＢＦ１同时用ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ双酶切后，
回收载体片段和犃狋犆犅犉１基因片段，将２个片段用Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，
在含有Ｋａｎ抗性的ＬＢ培养基平板上筛选阳性菌落，挑单菌落进行菌液ＰＣＲ，经ＰＣＲ鉴定和酶切鉴定，构建成植
物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１。
１．２．４　植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１的农杆菌转化　通过电击法将植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１转化入感受态农
杆菌Ｃ５８中，在直径９ｃｍ的筛选培养基［ＬＢ＋２５ｍｇ／ＬＲｉｆ（氯福平，ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）＋１００ｍｇ／ＬＫａｎ（卡那霉素，ｋａ
ｎａｍｙｃｉｎ）＋５ｍｇ／ＬＴｅｔ（四环素，ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）］获得转化菌落，用ＰＣＲ法对转化菌落进行鉴定。
１．２．５　紫花苜蓿遗传转化及抗性筛选　将紫花苜蓿种子用７０％的酒精和２０％的次氯酸钠分别处理１和１５ｍｉｎ
后接种到无菌苗培养基１／２ＭＳ上培养。切取７ｄ龄无菌苗下胚轴，在愈伤诱导培养基［改良ＳＨ＋４．０ｍｇ／Ｌ
２，４Ｄ（２，４二氯苯氧乙酸钠，２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ（６苄基嘌呤，６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕ
ｒｉｎｅ）］预培养３ｄ，在活化的农杆菌（含犆犅犉１基因）菌液中侵染１０ｍｉｎ，置于愈伤诱导培养基上共培养３ｄ，经过
愈伤诱导筛选培养［改良ＳＨ＋４．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋３５０ｍｇ／ＬＣｅｆ（头孢霉素，ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）＋６０
ｍｇ／ＬＫａｎ］、继代筛选培养［ＭＳＯ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ（萘乙酸，ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）＋１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋１．０
ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３＋３５０ｍｇ／ＬＣｅｆ＋６０ｍｇ／ＬＫａｎ］、分化筛选培养（ＭＳ＋３５０ｍｇ／ＬＣｅｆ＋２０ｍｇ／ＬＫａｎ）和生根筛
选培养（１／２ＭＳ＋３５０ｍｇ／ＬＣｅｆ＋２０ｍｇ／ＬＫａｎ）后得到紫花苜蓿抗性转化植株。
９６１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
１．２．６　转化植株的ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定　转化植株ＰＣＲ检测：用ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵法，ｈｅｘａｄｅ
ｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法提取转化植株ＤＮＡ，以未经转化植株作为阴性对照进行ＰＣＲ检测。反应体
系２５μＬ，反应条件同犃狋犆犅犉１基因克隆时的条件。
转化植株ＲＴ－ＰＣＲ检测：按照ＲＮＡ提取试剂盒的操作方法提取转化植株总ＲＮＡ，根据ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒
所提供的操作方法进行反转录及ＰＣＲ反应。
２　结果与分析
２．１　犃狋犆犅犉１基因克隆的鉴定及序列分析
以拟南芥ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，得到６５０ｂｐ左右的ＤＮＡ片段（图１），与预期结果相符。将其连接到
Ｔ载体上得到重组质粒ＴＣＢＦ１，对其进一步进行酶切鉴定后，得到３０００和６５０ｂｐ左右的２条ＤＮＡ片段（图
２），与预期结果一致。将其送交北京奥科生物技术有限责任公司进行测序验证。测序结果表明所克隆的ＤＮＡ
片段长度为６４２ｂｐ，将该序列与 ＧｅｎＢａｎｋ上的犆犅犉１基因序列进行ＤＡＮＭＡＮ序列比较分析，同源性可达
９９．８４％（图３），核苷酸比较结果表明本实验通过ＰＣＲ克隆的犃狋犆犅犉１片段确为拟南芥的犆犅犉１基因，具有正常
的生理功能，可用于下一步遗传转化研究。
图１　犃狋犆犅犉１基因片段的犘犆犚扩增
犉犻犵．１　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犃狋犆犅犉１犵犲狀犲犳狉犪犵犿犲狀狋
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２：ＰＣＲ扩增产物犃狋犆犅犉１ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犃狋犆犅犉１．
图２　犜犆犅犉１酶切鉴定
犉犻犵．２　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳犜犆犅犉１
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２：ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切条带
ＥｎｚｙｍｅｂａｎｄｓｏｆＢａｍＨⅠａｎｄＳａｃⅠ．
２．２　植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１的鉴定
构建的ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１植物表达载体图谱（图４），增加了１个ＢａｍＨＩ位点和１个ＳａｃＩ酶切位点，根据载体上
这２种酶的酶切位点的特点，用ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ进行双酶切鉴定，得到２个片段，一个为犃狋犆犅犉１基因，大约为
６５０ｂｐ，另一个为载体，约为１２．９ｋｂ。从电泳检测的结果来看（图５），所构建的ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１表达载体正确。
２．３　农杆菌的转化
采用电击法将构建好的载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１转入农杆菌菌株Ｃ５８，随机挑取６个转化菌落进行ＰＣＲ鉴定，结
果显示６个转化菌落均扩增出６５０ｂｐ左右的特异性条带，说明表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１成功转化农杆菌Ｃ５８中
（图６）。
２．４　紫花苜蓿抗性转化植株的获得
将紫花苜蓿的下胚轴经过预培养３ｄ后，用农杆菌侵染１０ｍｉｎ，置于愈伤诱导培养基上共培养３ｄ后，转入
愈伤诱导筛选培养基中，在经过继代筛选培养后转入分化筛选培养基中，待分化出３～５ｃｍ的小苗时转入生根筛
选培养基，最终获得抗Ｋａｎ的紫花苜蓿转化植株（图７）。
０７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图３　犃狋犆犅犉１基因序列比对图（同源性９９．８４％）
犉犻犵．３　犛犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犆犅犉１（犻犱犲狀狋犻狋狔＝９９．８４％）
　上排：ＰＣＲ扩增产物犃狋犆犅犉；下排：拟南芥犆犅犉１ｃＤＮＡ。方框表示两序列碱基的不同处。Ｕｐｐｅｒｌｉｎｅ：ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犃狋犆犅犉；Ｌｏｗｅｒ
ｌｉｎｅ：犆犅犉１ｃＤＮＡｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪．Ｂｏｘｓｈｏｗｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｔｗｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｂａｓｅｓ．
２．５　转化植株的ＰＣＲ鉴定
图４　植物表达载体狆犅犐１２１犆犅犉１质粒图谱
犉犻犵．４　犘犾犪狊犿犻犱犿犪狆狅犳狆犾犪狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１犆犅犉１
提取转化植株的基因组 ＤＮＡ，以质粒ｐＢＩ１２１
ＣＢＦ１做阳性对照，以非转基因植株作为阴性对照，进
行ＰＣＲ扩增。结果表明，部分转化植株扩增出了与阳
性对照相同的大小为６５０ｂｐ左右的特异带，而阴性对
照的泳道上没有该特征带，表明目的基因犆犅犉１已经
整合到“Ｈｕｎｔｅｒｒｉｖｅｒ”紫花苜蓿基因组中（图８）。
２．６　转化植株的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定
为了检测犆犅犉１基因在苜蓿转化植株中 ｍＲＮＡ
水平上的表达情况，提取转化植株总ＲＮＡ（图９），进
行了ＲＴ－ＰＣＲ检测。结果显示（图１０），在ＰＣＲ结果
呈阳性的转化植株中，ＲＴ－ＰＣＲ结果并不全呈阳性，
说明 ＰＣＲ 有假阳性的存在，同时也表明外源基因
犆犅犉１在部分苜蓿转化植株的转录水平上表达。
图５　狆犅犐１２１犆犅犉１酶切鉴定
犉犻犵．５　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳狆犅犐１２１犆犅犉１
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２：ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切条带
ＥｎｚｙｍｅｂａｎｄｓｏｆＢａｍＨⅠａｎｄＳａｃⅠ．
图６　狆犅犐１２１犆犅犉１导入农杆菌的犘犆犚检测
犉犻犵．６　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犅犐１２１犆犅犉１狋狉犪狀狊犳犲狉狉犲犱犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２：阳性对照Ｃｈｅｃｋｎｅｇａｔｉｖｅ；３～８：重组质粒
Ｃｈｅｃｋｐｏｓｉｔｉｖｅ３－８ｐｌａｓｍｉｄ．
１７１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图７　转化再生植株流程图
犉犻犵．７　犗犫狋犪犻狀犻狀犵狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
Ａ：无菌苗Ａｓｅｐｔｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇ；Ｂ：愈伤组织诱导Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｃ：愈伤组织分化Ｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｄ：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
图８　转化植株的犘犆犚鉴定
犉犻犵．８　犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２～５：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ；６：阴性对照Ｃｈｅｃｋ
ｎｅｇａｔｉｖｅ；７：阳性对照Ｃｈｅｃｋｐｏｓｉｔｉｖｅ．
图９　转化植株总犚犖犃
犉犻犵．９　犜狅狋犪犾犚犖犃狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２～６：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
图１０　转化植株的犚犜－犘犆犚鉴定
犉犻犵．１０　犚犜－犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
１：标记 Ｍａｋｅｒ；２～９：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ；１０：阴性
对照Ｃｈｅｃｋｎｅｇａｔｉｖｅ；１１：阳性对照Ｃｈｅｃｋｐｏｓｉｔｉｖｅ．
３　讨论
３．１　犃狋犆犅犉１基因的克隆
植物的耐逆性属于复杂的数量性状，是多种耐逆
机制共同作用的结果。用单一的功能基因转化植物，
虽能使转基因后代的耐冷性、耐旱性或耐盐性得到提
高，但效果并不十分理想。ＣＢＦ转录激活因子的发现
则为基因工程改良植物耐逆性提供了一种全新的技术
途径［２７］。本实验以拟南芥ＤＮＡ为模板，用筛选出的
犆犅犉１特异引物进行 ＰＣＲ 扩增，得到了约６５０ｂｐ
ＤＮＡ片段，通过ＰＣＲ和酶切鉴定后进行ＤＮＡ测序，
结果表明ＤＮＡ片段实际大小为６４２ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ中基因序列进行比对，同源性达９９．８４％，只是在４６０ｂｐ的
碱基Ａ置换成Ｔ，２个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异，但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上，推测其
不会影响基因功能，可用于下一步的实验。
２７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
３．２　表达载体的构建
构建含有目的基因的高效植物表达载体，是进行植物遗传转化的一个重要前提。本实验构建成功了由组成
型启动子ＣａＭＶ３５ｓ调控冷诱导转录因子犃狋犆犅犉１基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１，并将其转入农杆菌Ｃ５８
中，为进一步进行紫花苜蓿农杆菌遗传转化奠定基础。在载体的构建中，现普遍用的是３５Ｓ启动子，它能使外源
基因在植物的各个部位都表达，特异性较差，且大多数基因都存在功能定位，外源基因在植物体内表达会产生许
多没有功能的蛋白质，可能会影响植物的正常生理代谢，下一步拟构建用犃狋犆犅犉１特异性启动子替换ＣａＭＶ３５ｓ
启动子的植物表达载体，便于更好地发挥犃狋犆犅犉１基因的功能，更加有利于紫花苜蓿的遗传转化。
３．３　农杆菌菌株对转化效率的影响
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，含有致瘤Ｔｉ质粒，宿主范围广泛，在自然状态下能通过伤口侵染植物。
菌株的侵染能力是转化中关键的因素之一。菌株对材料的转化能力体现在２个方面：一是农杆菌能否吸附在植
物细胞表面，Ｖｉｒ区能否诱导表达，Ｔ－ＤＮＡ能否转至植物细胞并整合到植物基因组中；二是菌株对植物材料细
胞的伤害程度。菌株的侵染能力是转化中最关键的因素之一。农杆菌有效地附着于植物细胞上是保证其 Ｔ
ＤＮＡ进入寄主植物细胞的前提，因此选择合适的菌株是转化成功的必要前提。本实验使用的农杆菌菌株Ｃ５８，
载体ｐＢＩ１２１ＣＢＦ１含有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、犌犝犛基因、犃狋犆犅犉１基因和犓犪狀基因，这为基因的成功转化提供了很
好的条件。
３．４　Ｋａｎ对转化率的影响
在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，而转化细胞由于有抗性，可以继续存活，因
而有利于从大量的非转化细胞和组织中选择出转化克隆［２８，２９］。不同植物的外植体对Ｋａｎ具有不同的敏感性，因
此在转化之前确定合适浓度的Ｋａｎ，以便在这个合适浓度的选择压力下，非转化细胞的生长能有效地被抑制，缓
慢死亡，转化细胞正常生长，发育［３０］。本实验中，苜蓿的外植体在愈伤阶段对Ｋａｎ不太敏感，需要６０ｍｇ／Ｌ来进
行筛选。但过高的选择压可能会降低转化体细胞的分裂活性，致使再生芽出现很少，因此本实验采用了在其分化
和生根阶段将Ｋａｎ浓度降低至２０ｍｇ／Ｌ，有利于转化率的提高。
参考文献：
［１］　范霞，那顺．紫花苜蓿栽培技术及应用［Ｊ］．内蒙古农业科技，２００１，（５）：４７．
［２］　赵淑芬，陈志远．内蒙古自治区农牧交错带紫花苜蓿优质高产栽培关键技术［Ｊ］．华北农学报，２００４，１９（专辑）：１３１１３３．
［３］　刘众，杨华．紫花苜蓿的价值及其栽培利用［Ｊ］．内蒙古农业科技，２００５，（４）：４２４３．
［４］　刘晓静，郝凤，张德罡．抗冻基因ＣＢＦ２表达载体构建及转化紫花苜蓿的研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（２）：１９３２００．
［５］　蒋世翠，王义，孙春玉．ａＦＧＦ植物表达载体构建及转化紫花苜蓿的初步研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（４）：１８０１８６．
［６］　张立全，牛一丁，郝金凤．通过花粉管通道法导入红树总ＤＮＡ获得耐盐紫花苜蓿Ｔ０代植株及其ＲＡＰＤ验证［Ｊ］．草业学
报，２０１１，２０（３）：２９２２９７．
［７］　吴楚，王政权．拟南芥中ＣＢＦ对ＣＯＲ基因表达的调控［Ｊ］．植物生理学通讯，２００１，３７（４）：３６５３６８．
［８］　邓江明，简令成．植物抗冻机理研究新进展：抗冻基因表达及其功能［Ｊ］．植物学通报，２００１，１８（５）：５２１５３０．
［９］　ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ．Ｒｏｌｅｏｆｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｉｎｐｌａｎｔｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１１８：１７．
［１０］　刘强，赵南明，ＹａｍａｇｕｃｈＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ，犲狋犪犾．ＤＲＥＢ转录因子在提高植物抗逆性中的作用［Ｊ］．科学通报，２０００，４５：１１
１６．
［１１］　ＪａｇｌｏＫＲ，ＫｌｅｆｆＳ，ＡｍｕｎｄｓｅｎＫＬ，犲狋犪犾．Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊Ｃｒｅｐｅａｔ／ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｅｐａｔｈｗａｙａｒｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎ犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊ａｎｄｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，１２７：９１０
９１７．
［１２］　甄伟，陈溪，孙思洋，等．冷诱导基因的转录因子ＣＢＦ１转化油菜及烟草及抗寒性鉴定［Ｊ］．自然科学进展，２０００，１０（１２）：
１０１１１０１４．
［１３］　ＬｅｅＳＣ，ＨｕｈＫＷ，ＡｎＫ，犲狋犪犾．ＥｃｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｃｏｌｄｉｎｄｕｃｉｂｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＣＢＦ１／ＤＲＥＢ１ｂｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ
犗狉狔狕犪狊犪犾犻狏犪Ｌ．）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄＣｅｌｓ，２００４，１８（１）：１０７１１４．
３７１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
［１４］　ＩｔｏＹ，ＫａｔｓｕｒａＫ，ＭａｒｕｙａｍａＫ，犲狋犪犾．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｉｃｅＤＲＥＢ１／ＣＢＦｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｌｄ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，４７（１）：１４１１５３．
［１５］　ＨｓｉｅｈＴＨ，ＬｅｅＪＴ，ＣｈａｒｎｇＹＹ，犲狋犪犾．Ｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓｅｃｔｏｐｉｃａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ＣＢＦ１ｓｈｏｗｅｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｔｏｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，１３０：６１８６２６．
［１６］　ＨｓｉｅｈＴＨ，ＬｅｅＪＴ，ＹａｎｇＰＴ，犲狋犪犾．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊Ｃｒｅｐｅａｔ／ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ
ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓｅｌｅｖａｔｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｃｈｉｌｉｎｇａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
２００２，１２９：１０８６１０９４．
［１７］　ＫａｓｕｇａＭ，ＭｉｕｒａＳ，ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ．Ａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ＤＲＥＢ１ＡｇｅｎｅａｎｄｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅＲＤ２９Ａｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｉｍｐｒｏｖｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｏｂａｃｃｏｂｙｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，４５：３４６
３５０．
［１８］　杨凤萍，梁荣奇，张立全，等．抗逆调节转录因子ＣＢＦ１基因提高多年生黑麦草的抗旱能力［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（１）：
１４１８．
［１９］　邓小燕，张兴国，井鑫，等．冷诱导转录因子基因ＣＢＦ１转化黄瓜的研究［Ｊ］．西南农业大学学报，２００４，２６（５）：６０３６０５．
［２０］　王舟，刘建秀．ＤＲＥＢ／ＣＢＦ类转录因子研究进展及其在草坪草和牧草抗逆基因工程中的应用［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（１）：
２２２２３６．
［２１］　金建凤，高强，陈勇．转移拟南芥ＣＢＦ１基因引起水稻植株脯氨酸含量提高［Ｊ］．细胞生物学杂志，２００５，２７：７３７６．
［２２］　吴关庭，郎春秀，胡张华．转ＣＢＦ１基因增强水稻的耐逆性［Ｊ］．核农学报，２００６，２０（３）：１６９１７３．
［２３］　林秀锋，郭喜英，刘志明．转ＣＢＦ１基因提高水稻抗寒能力的初步研究［Ｊ］．吉林农业科学，２００８，３３（５）：６８，１１．
［２４］　袁维风，尹淑萍，金万梅，等．根癌农杆菌介导转录因子ＣＢＦ１基因对草莓的转化［Ｊ］．生物学杂志，２００６，２３（４）：３７４０．
［２５］　金万梅，董静，尹淑萍．冷诱导转录因子ＣＢＦ１转化草莓及其抗寒性鉴定［Ｊ］．西北植物学报，２００７，２７（２）：２２３２２７．
［２６］　王渭霞，朱廷恒，胡张华，等．农杆菌介导的ＣＢＦ１基因对松南结缕草的遗传转化［Ｊ］．园艺学报，２００５，（５）：９５３．
［２７］　吴关庭，胡张华，陈锦清．ＣＢＦ转录激活因子及其在提高植物耐逆性中的作用［Ｊ］．植物生理学通讯，２００３，３９（４）：４０４
４１０．
［２８］　盖树鹏，孟祥栋．转基因植物的筛选和检测［Ｊ］．山东农业大学学报，２０００，３１（１）：９５１００．
［２９］　徐茂军．转基因植物中卡那霉素抗性（Ｋａｎｒ）标记基因的生物安全性［Ｊ］．生物学通报，２００１，３６（２）：１８１９．
［３０］　王紫萱，易自力．卡那霉素在植物转基因中的应用［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００３，２３（６）：９１２．
犃狊狋狌犱狔狅狀犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪狑犻狋犺狋犺犲犃狋犆犅犉１犵犲狀犲
ＸＵＣｈｕｎｂｏ１，２，ＷＡＮＧＹｏｎｇ１，ＺＨＡＯＨａｉｘｉａ２，ＭＩＦｕｇｕｉ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＧｒａｓｓｌａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｃｏｌｄｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ犆犅犉１（Ｃｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ）
ｇｅｎｅｏｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙａｍｐｌｉｆｙｉｎｇａｎ犃狋犆犅犉１ｇｅｎｅａｎｄｃｌｏｎｉｎｇｉｔｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ
ｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪．ＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅＤＮＡｃｌｏｎｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓ６４２
ｂｐ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ犆犅犉１ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒａｔｅｗａｓ９９．８４％．Ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆ
ｔｈｅ犆犅犉１ｇｅｎｅ，ｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ＣＢＦ１ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅ犃狋犆犅犉１ｇｅｎｅａｎｄ犕．狊犪狋犻
狏犪ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊．Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｗｉｔｈｋａｎａｍｙｃｉｎ．
Ａｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｂａｎｄｏｆ６５０ｂｐｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）．Ｔｈｅ犃狋犆犅犉１ｇｅｎｅｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ犕．狊犪狋犻狏犪．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓａｇｏｏｄｂａｓｉｓｆｏｒｂｒｅｅｄｉｎｇｎｅｗ
犕．狊犪狋犻狏犪ｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；犆犅犉１ｇｅｎｅ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
４７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
玉米持绿相关犙犜犔整合图谱构建及一致性
犙犜犔区域内候选基因发掘
方永丰１，２，３，李永生３，白江平１，２，３，慕平３，孟亚雄１，２，３，
张金林４，王汉宁１，２，３，尚勋武３
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
３．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；４．兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：以玉米高密度遗传连锁图谱ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ为参考图谱，收集来自不同实验中的１７３个玉米持绿相关
数量性状位点（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，ＱＴＬ）信息，利用ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件，构建出玉米持绿相关 ＱＴＬ整合图
谱；采用元分析技术，在１，４，５，９号染色体上发掘出５个持绿“一致性”ＱＴＬ区间。根据“一致性”ＱＴＬ区间两端标
记在玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２上的位置，将“一致性”ＱＴＬ区间进行物理图谱定位，利用ＰｌａｎｔＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ／）在线区段批量下载工具（ｄｏｗｎｌｏａｄｒｅｇｉｏｎｄａｔａ）下载“一致性”区间的１４４５个预测基因序列并
进行生物信息学分析，发现预测基因主要参与具体的细胞过程，执行结合功能，催化、转移酶活性和氧化还原酶活
性等分子功能。根据“一致性”ＱＴＬ区间的基因位点名称，在ＮＣＢＩ中下载相关基因序列，与所在“一致性”ＱＴＬ区
间所有预测基因保守结构域进行比对，在５个“一致性”持绿 ＱＴＬ区间内初步确定８个持绿相关候选基因。利用
ＧＲＡＭＥＮＥ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）的Ｃｍａｐ功能，将水稻持绿基因狊犵狉（ｓｔａｙｇｒｅｅｎ）转定位于玉米物理
图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２上，找到与其同源的玉米候选基因ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１，其序列与已发表的玉米衰老诱导
叶绿体持绿蛋白基因狊犵狉１序列一致。
关键词：玉米；持绿性；数量性状位点（ＱＴＬ）；整合图谱；元分析
中图分类号：Ｓ５１３．０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１７５１１
　　玉米（犣犲犪犿犪狔狊）是重要的饲料、工业加工原料和粮食作物，其产量和品质对保障粮食安全和人民生活具有
举足轻重的战略作用［１］。持绿性是指在籽粒生理成熟期叶片因衰老进程延缓而保持绿色的特性，被认为是作物
的理想农艺性状［２］。玉米持绿型品种后期绿色叶片数和重量、叶面积指数、叶面积持续期等均优于常规品种，具
有较高的光合活性，较高的蛋白质、蔗糖及脂类含量，较低的纤维含量，其生物产量、籽粒产量和秸秆营养价值也
较高［３５］，并且对一些不良的条件如病害、旱灾、倒伏等具有较强的抗性［６］，是玉米品种的演进方向［７，８］。但由于玉
米的持绿性表现为一个典型的数量性状，而且只有在籽粒到达生理成熟期才能准确鉴定，使得用传统方法选育具
持绿性状的品种进展缓慢［９］。分子数量遗传学和分子标记技术的发展使得剖析数量性状的多基因遗传行为成为
可能，至今在玉米中已定位１７０多个持绿相关数量性状位点（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，ＱＴＬ）［１０１６］，但由于各实验
所用的材料、作图群体、实验设计、统计方法、性状多少、标记多少、群体大小等互不相同，致使不同实验检测出的
ＱＴＬ数目和座位存在较大差异，虽然这些研究结果在探索玉米持绿性的遗传机制及其与环境的互作上提供了有
益的参考，但在玉米持绿性育种实践中应用仍有限［１７］。
元分析（ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ）是一种可以合并不同研究数据进行统计分析且可以对实际数据进行全面检验的方
法［１８］。它可以在整合ＱＴＬ的基础上，建立数学模型优化ＱＴＬ，缩小置信区间，提高ＱＴＬ定位的准确度和有效
性［１９］。随着生物信息学、比较基因组学理论和方法的发展以及水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、玉米等重要作物全基因组测
序的完成，在全基因组序列水平，功能水平上进行比较基因组研究成为了可能［２０，２１］。２００４年，Ｃｈａｒｄｏｎ等［２２］利用
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１７５－１８５
２０１２年８月
收稿日期：２０１２０２２０；改回日期：２０１２０４１８
基金项目：９７３计划前期研究专项（２０１２ＣＢ７２２９０２）和甘肃省科技攻关计划项目（２ＧＳ０６４Ａ４１００１０５）资助。
作者简介：方永丰（１９７６），男，甘肃临洮人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｆａｎｇｙｆ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｎ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｓｈａｎｇｘｕｎｗｕ＠１６３．ｃｏｍ
元分析的方法对３１３个玉米花期相关ＱＴＬ信息进行整合分析，最后确定６２个“一致性”ＱＴＬ的准确位置，并通
过与水稻花期性状基因的共线性分析进行验证，发现玉米１９处“一致性”ＱＴＬ区域与水稻花期性状基因紧密相
关。目前，该方法已被广泛应用于各种作物不同性状的整合定位研究［２３，２４］。在玉米上，李雪华等［２５］、栗文娟
等［２６］分别对不同遗传背景的遗传图谱进行整合，构建了玉米抗旱性的一致性遗传图谱；王毅等［２７］、张耿等［２８］、王
帮太等［２９］、王晓丽等［３０］分别构建了玉米产量及构成因子一致性遗传图谱；吉海莲等［３１］构建了玉米抗丝黑穗病一
致性遗传图谱，但对玉米持绿性状ＱＴＬ的一致性遗传图谱的构建及元分析还未见报道。
本研究利用生物信息学方法，对前人定位的玉米持绿相关性状ＱＴＬ进行收集整理，利用ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１
软件［１９］，以玉米高密度分子标记连锁图谱ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ为参考图谱，将原始图谱上不同来源的ＱＴＬ映
射到参考图谱上，构建玉米持绿性状ＱＴＬ整合图谱，通过元分析的方法进行“一致性”ＱＴＬ区间的鉴定，结合玉
米基因组序列信息以及生物信息学方法，发掘玉米持绿相关的基因组区域及其候选基因，为深入理解玉米持绿性
状的遗传控制机制和分子设计育种提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　实验材料
以玉米基因组数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅＧＤＢ．ｏｒｇ／）和已发表文献中的玉米持绿相关ＱＴＬ定位信息为研
究对象。
１．　实验方法
１．２．１　玉米持绿性相关ＱＴＬ数据的收集　从玉米基因组数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅＧＤＢ．ｏｒｇ／）和已发表的文
献中对玉米成熟期绿色叶片数、成熟期绿叶面积、叶片叶绿素含量、光合速率等持绿相关性状ＱＴＬ定位信息进
行收集，将收集到的每个ＱＴＬ数据按ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件的要求建立ＱＴＬ数据。ＱＴＬ的位置（最大可能性
的位置及其置信区间）、连锁系数（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｏｆｏｄｄｓ，ＬＯＤ）（当ＬＯＤ值≥３．０时，表明标记和ＱＴＬ连锁）和贡献
率犚２（解释表型变异的比率）是ＱＴＬ的３个重要参数，如果某一ＱＴＬ的置信区间未知，则根据Ｄａｒｖａｓｉ和Ｓｏｌ
ｌｅｒ［３２］的公式推断其９５％的置信区间。
犆．犐．＝５３０／（犖×犚２） （１）
犆．犐．＝１６３／（犖×犚２） （２）
式中，犆．犐．指ＱＴＬ的置信区间（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｉｎｔｅｒｖａｌ），犖 代表作图群体的大小，犚２ 代表该 ＱＴＬ的贡献率，公式
（１）适用于回交和Ｆ２ 作图群体，公式（２）适用于重组自交系群体。
１．２．２　玉米持绿性相关ＱＴＬ信息的整合　根据收集到的玉米持绿ＱＴＬ信息确定其所涉及的染色体，以ＩＢＭ２
２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ为参考图谱，将原始图谱和参考图谱上相关标记载入ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件，构建图谱信息库，然
后将ＱＴＬ数据分不同性状载入对应图谱，利用齐序函数（ｈｏｍｏｔｈｅｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎ）计算共有标记间距，将原始ＱＴＬ
的最大可能性位置及置信区间的两端标记按比例标注到参考图谱上，即映射（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ），如果某个ＱＴＬ的任一
位置标记不能映射，则去掉该ＱＴＬ［１９］。
１．２．３　玉米持绿性相关ＱＴＬ的元分析　利用ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件中的元分析（ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ）程序估算“一致
性”ＱＴＬ存在的位置和置信区间。按照软件要求和综合图谱上ＱＴＬ置信区间信息，通过染色体步移法，对不同
性状ＱＴＬ分别进行元分析，对独立来源的同一染色体上相同性状且位于同一座位或有重叠座位的ＱＴＬ计算出
一个“一致性”ＱＴＬ，这个“一致性”ＱＴＬ包括１，２，３，４和 ＮＱＴＬ五个模型，其中可靠性检验值（ａｋａｉｋｅｔｙｐｅ
ｃｒｉｔｅｒｉａｖａｌｕｅｓ，ＡＩＣ）最小的模型为最优模型，即最优“一致性”ＱＴＬ，也是比较接近“真实”ＱＴＬ的模型，并通过高
斯定理最大似然比估算“一致性”ＱＴＬ存在的位置和置信区间［１９］。
１．２．４　玉米持绿性“一致性”ＱＴＬ区间的物理图谱定位及候选基因 ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析　利用 Ｍａｉｚｅ
ＧＤＢ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅＧＤＢ．ｏｒｇ／）中的ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒ工具将玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２序列信
息与ＩＢＭ２２００８连锁图谱的标记信息进行整合，将元分析所得“一致性”ＱＴＬ区间进行物理图谱定位，利用Ｐｌａｎｔ
ＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ／）在线区段批量下载工具（ｄｏｗｎｌｏａｄｒｅｇｉｏｎｒａｔａ），下载“一致性”ＱＴＬ区间所
有候选基因序列，利用ＡｇＢａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｂａｓｅ．ｍｓｓｔａｔｅ．ｅｄｕ）在线 ＧＯＳｌｉｍＶｉｅｗｅｒ功能，对候选基因进行
６７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析［３３］，以了解玉米持绿“一致性”ＱＴＬ区间候选基因所涉及的生物学功能。
１．２．５　玉米持绿性“一致性”ＱＴＬ范围内持绿相关基因位点候选基因发掘　在参考图谱ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ
上，对“一致性”ＱＴＬ区间及其邻近区域的持绿相关基因位点进行整理，根据“一致性”ＱＴＬ区间的基因位点名
称，在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）中检索，即可得到该基因或相似功能基因的序列信息。利用
ＰｌａｎｔＧＤＢ在线区段批量下载工具，下载“一致性”区间所有蛋白序列，然后，利用Ｐｆａｍ网站（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎ
ｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）批量搜索工具（ｂａｔｃｈｓｅａｒｃｈ），对所有蛋白序列进行保守结构域分析。最后将这些分析的结果与
ＮＣＢＩ网站提供的基因注释信息进行对比与整合，发掘“一致性”ＱＴＬ区间及其邻近区域的持绿相关基因位点玉
米持绿相关候选基因。
１．２．６　基于基因比较定位的玉米持绿性候选基因发掘　从水稻基因组数据库 ＧＲＡＭＥＮＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）检索水稻持绿相关基因信息，利用ＧＲＡＭＥＮＥ网站的Ｃｍａｐ功能，将其转定位于玉米ＩＢＭ２００８
连锁图谱上；利用ＰｌａｎｔＧＤＢ网站在线区段批量下载工具分段下载该区间范围内已预测基因蛋白序列，利用
Ｐｆａｍ网站批量搜索工具，将下载的预测基因蛋白序列与水稻持绿基因的蛋白序列进行保守结构域分析，发掘与
水稻持绿基因同源的玉米持绿候选基因。
２　结果与分析
２．１　玉米持绿性相关ＱＴＬ信息的收集与整理
从玉米基因组数据库和已发表的相关文献中共收集了来源于Ｂ７３×Ｍｏ１７、Ｑ３１９×Ｍｏ１７、Ａ１５０３２×Ｍｏ１７、
黄Ｃ×１７８、４４４×Ｍｏ１７等７个作图群体、涉及４个玉米持绿相关性状的１７３个 ＱＴＬ。包含８１个叶绿素含量
ＱＴＬ，１６个成熟期绿叶数ＱＴＬ，４２个绿叶面积相关ＱＴＬ，３４个叶片光合特性ＱＴＬ（表１）。１７３个ＱＴＬ在１０
条玉米染色体上呈不均匀分布，其中，在第１，４，５染色体上较多，第３，６，１０染色体上较少；叶片叶绿素含量ＱＴＬ
主要分布在第１，４，５，７染色体上，成熟期绿叶面积和叶片光合特性ＱＴＬ主要集中在第１染色体上，而成熟期绿
叶数ＱＴＬ在各染色体上的分布差别不大。
表１　叶片持绿相关性状犙犜犔在各染色体上的分布
犜犪犫犾犲１　犇犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犙犜犔狊犳狅狉犿犪犻狕犲狊狋犪狔犵狉犲犲狀犪狀犱犻狋狊狉犲犾犪狋犲犱狋狉犪犻狋狊狅狀犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲狊
性状
Ｔｒａｉｔ
ＱＴＬ类别
ＱＴＬｔｙｐｅ
ＱＴＬ数目
ＱＴＬｎｕｍｂｅｒ
染色体Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
叶绿素含量Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｏｎｔｅｎｔ ｑｃｈｌ ８１ １０ ５ ２ １６ ２１ ０ １０ ５ ８ ４
绿叶面积 Ｒｅｌａｔｉｖｅｇｒｅｅｎｌｅａｆａｒｅａ ｑｇｌ ４２ １５ ４ ２ ４ ７ ３ ０ ３ ３ １
成熟期绿叶数 Ｇｒｅｅｎｌｅａｆｎｕｍｂｅｒａｔｍａｔｕｒｅｔｉｍｅ ｑｓｔａｇｒ １６ ２ ２ １ １ ３ ２ ０ ２ ２ １
叶片光合特性Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｑｐｎｌ ３４ ８ １ ３ ４ ２ ３ ３ ３ ３ ４
总计 Ｔｏｔａｌ １７３ ３５ １２ ８ ２５ ３３ ８ １３ １３ １６ １０
整合的ＱＴＬＴｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆＱＴＬｏｎｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｐ １５０ ３２ ８ ８ １９ ３３ ８ ４ １３ １６ ９
２．２　玉米持绿性相关ＱＴＬ的图谱整合
将原始图谱与参考图谱ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ上相关标记载入ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件，利用其图谱映射程序
（Ｍａｐｓｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）构建玉米持绿相关性状ＱＴＬ整合图谱。当ＬＯＤ值≥３．０时，１７３个ＱＴＬ中有１５０个被成功
整合到ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ图谱，被整合的ＱＴＬ在玉米１０条染色体上均有分布，但分布不均匀（表１），其中，
在第１，４，５，９染色体上集中了６６．７％的ＱＴＬ，其余６条染色体上分布的ＱＴＬ数较少，第７染色体上最少，仅整
合了４个ＱＴＬ。
玉米持绿相关性状ＱＴＬ在整合图谱上有明显成簇分布现象，存在 ＱＴＬ富集区域（图１），在第１染色体的
ｕｍｃ１５９８～ｕｍｃ２３９０、ｕｍｃ１３９５～ｂｎｌｇ４２１和ｕｍｃ１２４５～ｕｍｃ２０４７标记区间分别集中了８，１０和６个ＱＴＬ；第２染
色体的ｕｍｃ１８４５～ｕｍｃ１５４１标记区间集中了５个 ＱＴＬ；第３染色体的ｕｍｃ１３４７～ｕｍｃ１４４９和ｕｍｃ１２６６～
７７１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
ｕｍｃ１２８６标记区间分别集中了３和２个ＱＴＬ；第４染色体的ｐｈｉ７２～ｕｍｃ１２８８和ｂｎｌｇ１２６～ｕｍｃ１７０２标记区间分
别集中了８和７个ＱＴＬ；第５染色体的ｕｍｃ１２４０～ｕｍｃ１４９６、ｕｍｃ１５８７～ｕｍｃ１８７０和ｐｈｉ８５～ｕｍｃ１７９２标记区间
分别集中了６，１２和７个ＱＴＬ；第６染色体的ｐｈｉ２６～ｕｍｃ２３１４和ｕｍｃ２３１７～ｕｍｃ１７９５标记区间分别集中了４和
３个ＱＴＬ；第７染色体的４个 ＱＴＬ主要分布在ｂｎｌｇ１６４２～ｕｍｃ１０１５标记区间；第８染色体的ｕｍｃ１１３９～
ｕｍｃ１４８３和ｐｈｉ１１５～ｃｓｕ３１ａ标记区间分别集中了５和６个ＱＴＬ；第９染色体的ｗｘ１～ｕｍｃ１１０７标记区间集中了
１２个ＱＴＬ；第１０染色体的ｂｎｌｇ１４５１～ｕｍｃ１０７７和ｕｍｃ１６７７～ｂｎｌ７．４９ａ标记区间各集中了４个 ＱＴＬ。一些
ＱＴＬ重叠区域与单个性状有关，如集中在第４染色体的ｐｈｉ７２～ｕｍｃ１２８８标记区段内的８个ＱＴＬ均为控制叶片
叶绿素含量的ＱＴＬ；还有一些ＱＴＬ重叠群由多个持绿相关性状ＱＴＬ组成，如第９染色体ｗｘ１～ｕｍｃ１１０７标记
区间集中了６个控制叶片叶绿素含量、２个成熟时绿叶面积、３个叶片光合特性和１个成熟时绿叶数的ＱＴＬ。
图１　第４和第５染色体持绿性相关犙犜犔在犐犅犕２犖犲犻犵犺犫狅狉狊２００８上的整合图谱
犉犻犵．１　犜犺犲犻狀狋犲犵狉犪犾犿犪狆狅犳狊狋犪狔犵狉犲犲狀犙犜犔狊狅犳犿犪犻狕犲狅狀狋犺犲犳狅狌狉狋犺犪狀犱犳犻犳狋犺犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犪狀犪犾狔狕犲犱犫狔犐犅犕２犖犲犻犵犺犫狅狉狊２００８
２．３　玉米持绿性相关ＱＴＬ的元分析
利用ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件中元分析（ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ）程序对整合ＱＴＬ数目较多的第１，４，５，９染色体进行分
析，以每次 Ｍｅｔａ分析中ＡＩＣ值最小，确定１个“一致性”ＱＴＬ（图２），最终得到５个“一致性”ＱＴＬｓ（表２）。
在第１染色体上确定２个“一致性”ＱＴＬ，其中１个控制绿叶面积和光合特性的“一致性”ＱＴＬ（ＣＱＴＬ１），另
１个控制叶绿素含量和绿叶面积的“一致性”ＱＴＬ（ＣＱＴＬ２）（表２）；在第４染色体上确定１个控制叶片叶绿素含
８７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
量的“一致性”ＱＴＬ（ＣＱＴＬ３），介于标记ｕｍｃ１２７６～ｕｍｃ１７５７，置信区间为３３．９０～７０．２３ｃＭ，间距３６．３３ｃＭ（表
２）；在第５染色体上得到１个控制叶片叶绿素含量、成熟期绿叶面积及绿叶数的“一致性”ＱＴＬ（ＣＱＴＬ４），置信区
间为２０７．５７～２２２．２８ｃＭ，间距１４．７１ｃＭ，由标记ｕｍｃ１８５２和ｕｍｃ１４６８界定（表２）；在第９染色体上确定１个控
制叶片叶绿素含量和叶片光合特性的“一致性 ＱＴＬ”（ＣＱＴＬ５），置信区间为２２５．６３～２２６．２７ｃＭ，间距０．６４ｃＭ，
由标记ｐｈｉ０６５和ｂｎｌｇ１２７界定（表２）。与原来的ＱＴＬ相比，检测到的５个“一致性”ＱＴＬ的置信区间明显变窄。
图２　第４染色体持绿性相关犙犜犔元分析
犉犻犵．２　犜犺犲犿犲狋犪犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犙犜犔狉犲犾犪狋犲犱狋狅狊狋犪狔犵狉犲犲狀狋狉犪犻狋狊狅犳犿犪犻狕犲狅狀狋犺犲犳狅狌狉狋犺犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲
表２　玉米持绿性相关犙犜犔的元分析
犜犪犫犾犲２　犜犺犲犿犲狋犪犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犙犜犔狉犲犾犪狋犲犱狋狅狊狋犪狔犵狉犲犲狀狋狉犪犻狋狊犻狀犿犪犻狕犲
“一致性”ＱＴＬ
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬ
染色体
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ＡＩＣ值
ＶａｌｕｅｏｆＡＩＣ
位置
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｃＭ）
置信区间
Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｉｎｔｅｒｖａｌ（ｃＭ）
间距
Ｉｎｔｅｒｖａｌ（ｃＭ）
置信区间标记
Ｍａｒｋｏｎｉｎｔｅｒｖａｌ
ＣＱＴＬ１ １．０４ １３９．６８ ３８６．４４ ３８４．５２～３８８．３７ ３．８５ ｕｍｃ２３９０～ｕｍｃ２２２８
ＣＱＴＬ２ １．０７ １３９．６８ ６６２．３７ ６４７．４７～６７７．２７ ２９．８０ ｕｍｃ１４８６～ｕｍｃ１２４５
ＣＱＴＬ３ ４．０１ ２４７．０２ ５２．０５ ３３．９０～７０．２３ ３６．３３ ｕｍｃ１２７６～ｕｍｃ１７５７
ＣＱＴＬ４ ５．０３ ２６２．１４ ２１４．９２ ２０７．５７～２２２．２８ １４．７１ ｕｍｃ１８５２～ｕｍｃ１４６８
ＣＱＴＬ５ ９．０３ １５３．３３ ２２５．９２ ２２５．６３～２２６．２７ ０．６４ ｐｈｉ０６５～ｂｎｌｇ１２７
２．４　玉米持绿性“一致性”ＱＴＬ区间的物理图谱定位及候选基因ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析
根据“一致性”ＱＴＬ区间两端标记在玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２上的位置，将“一致性”ＱＴＬ进行物理图
谱定位，统计“一致性”ＱＴＬ区间内包含的基因个数（表３）。５个“一致性”ＱＴＬ区间总计包含１４４５个预测基因，
其中ＣＱＴＬ２覆盖范围最大（９．１１Ｍｂ），包含的基因个数最多（７０９个）；ＣＱＴＬ５覆盖范围最小，仅为０．１９Ｍｂ，其
包含的基因个数也最少（２８个）。单位长度基因个数最少的是ＣＱＴＬ１，为６１．３０个基因，单位长度基因个数最多
的是ＣＱＴＬ５，包含１４７．４个基因。
利用ＰｌａｎｔＧＤＢ在线区段批量下载工具（ｄｏｗｎｌｏａｄｒｅｇｉｏｎｄａｔａ），下载５个“一致性”ＱＴＬ区间所有基因序
列，利用ＡｇＢａｓ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｂａｓｅ．ｍｓｓｔａｔｅ．ｅｄｕ）的ＧＯＳｌｉｍＶｉｅｗｅｒ对候选基因进行ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ分
析，发现１４４５个候选基因中，有５１３个基因参与植物体内的生物过程，１６５个基因是细胞组成成分，７６７个基因
具有分子功能，分别涉及２２种生物过程，２３种分子功能，１１种细胞成分。具有分子功能的基因中最主要涉及的
类是：结合功能，催化活性，转移酶活性以及氧化还原酶活性（图３Ａ）；从细胞组成分类来看，细胞及细胞组成成分
所占比例最大，其次为胞内物质、细胞质及细胞膜（图３Ｂ）；所参与的生物学过程按照比例从大到小依次包括：细
胞过程、代谢过程、大分子代谢过程、生物学过程、刺激的应答反应、核酸代谢过程、生物合成、细胞间通讯、运输、
分解代谢过程、细胞死亡、细胞内氨基酸代谢过程等（图３Ｃ）。
９７１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
表３　“一致性”犙犜犔区间的物理图谱定位
犜犪犫犾犲３　犜犺犲犮狅狀狊犲狀狊狌狊犙犜犔狉犲犵犻狅狀狅狀犿犪犻狕犲狆犺狔狊犻犮犪犾犿犪狆狅犳犅７３
“一致性”ＱＴＬ
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬ
染色体
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
物理图谱距离
Ｉｎｔｅｒｖａｌｏｆｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐ（Ｍｂ）
间距
Ｉｎｔｅｒｖａｌ（Ｍｂ）
ＱＴＬ范围内基因个数
Ｇｅｎｅｓｎｕｍｂｅｒｉｎｉｎｔｅｒｖａｌ
ＣＱＴＬ１ １．０４ ７１．０２～７３．１９ ２．１７ １３３
ＣＱＴＬ２ １．０７ ２０５．７３～２１４．８５ ９．１１ ７０９
ＣＱＴＬ３ ４．０１ ２．８８～４．６８ １．８０ ２２３
ＣＱＴＬ４ ５．０３ １６．１５～２０．９０ ４．７５ ３５２
ＣＱＴＬ５ ９．０３ ２６．８２～２７．０１ ０．１９ ２８
总计Ｔｏｔａｌ １４４５
利用ＰｌａｎｔＧＤＢ在线区段批量下载工具（ｄｏｗｎｌｏａｄｒｅｇｉｏｎｄａｔａ），下载“一致性”ＱＴＬ区段的１４４５个候选基
因对应的蛋白序列，利用Ｐｆａｍ在线批量搜索工具（ｂａｔｃｈｓｅａｒｃｈ），对其蛋白序列进行保守结构域分析，发现在５
个“一致性”ＱＴＬ区段分别包含ＧＲＡＳ、ＣＢＦ、ＳＲＦ转录调控因子、叶绿体结合蛋白、植物激素诱导（响应）蛋白及
细胞分裂周期相关蛋白、细胞色素Ｐ４５０氧化酶、细胞分裂素脱氢酶、磷脂酶ＰＬＤ、ＲｕＢＰ羧化酶、糖基转移酶等已
报道的与持绿性相关的功能蛋白或转录因子家族的保守结构域。
图３　“一致性”犙犜犔区间候选基因犌犗分析
犉犻犵．３　犌犲狀犲犗狀狋狅犾狅犵狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犵犲狀犲狊狉犲犾犪狋犲犱狋狅犮狅狀狊犲狀狊狌狊犙犜犔
　Ａ：参与细胞组成的基因 Ｇｅｎｅｓｃｏｎｃｅｒｎｅｄｗｉｔｈｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；Ｂ：具有分子功能的基因 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｇｅｎｅ；Ｃ：参与生物过程的基因
Ｇｅｎｅｓｃｏｎｃｅｒｎｅｄｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ．
２．５　玉米持绿性“一致性”ＱＴＬ范围内持绿相关基因位点候选基因发掘
在参考图谱ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ上，对“一致性”ＱＴＬ区间及其邻近区域的持绿相关基因位点进行整理，
发现７个与玉米持绿性有关的基因（表４），涉及到信号传递、胁迫应答、细胞组成、代谢调节等多种生理生化途
径。根据“一致性”ＱＴＬ区段的基因名称，在ＮＣＢＩ中搜索，即可得到该基因或相似功能基因的序列信息，下载后
在Ｐｆａｍ 网站搜索其保守结构域信息，与所在“一致性”ＱＴＬ区段的所有基因序列保守结构域进行比对发现，
０８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
ＣＱＴＬ１区间的基因 犿狊狏１与该区段内的 ＧＲＭＺＭ２Ｇ１７２３２２＿Ｔ０１基因序列保守结构域相同，序列同源比为
７４％；犵狊狋４２基因与该区段内的 ＧＲＭＺＭ２Ｇ３９８３５７＿Ｔ０４基因序列保守结构域相同，且序列相似度高达９５％。
ＣＱＴＬ２区间狅狆狉７基因与该区段的ＧＲＭＺＭ２Ｇ１４８２８１＿Ｔ０２基因序列一致，且保守结构域相同；犮狀犮狉１基因与该
区段的ＧＲＭＺＭ２Ｇ１３１２０５＿Ｔ０１基因序列保守结构域相同，且序列相似度达９０％。ＣＱＴＬ３区间犫狓３和犫狓４两个
基因分别与该区段的ＧＲＭＺＭ２Ｇ１６７５４８＿Ｔ０２和ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７３４８０＿Ｔ０２基因序列一致，且保守结构域相同。
ＣＱＴＬ４区间狋犺犪９基因与该区段的ＧＲＭＺＭ２Ｇ８０２０２９＿Ｔ０１基因序列一致，且保守结构域相同。ＣＱＴＬ５区间
狆犲狆１基因与该区段的序列ＧＲＭＺＭ２Ｇ０８３８４１＿Ｔ０２保守结构域相同，序列同源比为８４％。
表４　“一致性”犙犜犔区间基因与玉米基因组预测基因序列的一致性
犜犪犫犾犲４　犆狅犺犲狉犲狀犮犲狅犳犵犲狀犲犾狅犮犻犪狀犱狆狉犲犱犻犮狋犲犱犵犲狀犲狊犳狉狅犿犿犪犻狕犲狊犲狇狌犲狀犮犲犱犪狋犪犫犪狊犲犻狀犮狅狀狊犲狀狊狌狊犙犜犔狉犲犵犻狅狀
“一致性”ＱＴＬ
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬ
基因
Ｇｅｎｅ
预测基因号
ＧｅｎｅＩＤｆｒｏｍＧｒａｍｅｎｅ
保守结构域是否相同
Ｗｉｔｈ（Ｙ）ｏｒｗｉｔｈｏｕｔ（Ｎ）ｅｑｕａｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎ
序列同源比例
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ（％）
ＣＱＴＬ１ 犿狊狏１ ＧＲＭＺＭ２Ｇ１７２３２２＿Ｔ０１ Ｙ ７４
犵狊狋４２ ＧＲＭＺＭ２Ｇ３９８３５７＿Ｔ０４ Ｙ ９５
ＣＱＴＬ２ 狅狆狉７ ＧＲＭＺＭ２Ｇ１４８２８１＿Ｔ０２ Ｙ １００
犮狀犮狉１ ＧＲＭＺＭ２Ｇ１３１２０５＿Ｔ０１ Ｙ ９０
ＣＱＴＬ３ 犫狓３ ＧＲＭＺＭ２Ｇ１６７５４８＿Ｔ０２ Ｙ １００
犫狓４ ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７３４８０＿Ｔ０２ Ｙ １００
ＣＱＴＬ４ 狋犺犪９ ＧＲＭＺＭ２Ｇ８０２０２９＿Ｔ０１ Ｙ １００
ＣＱＴＬ５ 狆犲狆１ ＧＲＭＺＭ２Ｇ０８３８４１＿Ｔ０２ Ｙ ８４
　犿狊狏１：玉米条纹病抗性基因 Ｍａｉｚｅｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｇｅｎｅ１；犵狊狋４２：谷胱甘肽Ｓ转移酶基因ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ４２；狅狆狉７：１２羰植物
二烯酸还原酶基因１２ｏｘｏｐｈｙｔｏｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅ７；犮狀犮狉１：肉桂酰辅酶 Ａ还原酶基因 ＣｉｎｎａｍｏｙｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅ；犫狓３，犫狓４：细胞色素
Ｐ４５０氧化酶基因Ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅ３，ｇｅｎｅ４；狋犺犪９：叶绿体类囊体构成基因 Ｔｈｙｌａｋｏｉｄａｓｓｅｍｂｌｙｇｅｎｅ９；狆犲狆１：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
基因Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅ１．
２．６　基于基因比较定位的玉米持绿性候选基因发掘
从ＧＲＡＭＥＮＥ网站检索到１个位于水稻遗传图ＩＧＣＮ１９９８第９染色体１３１．１～１３４．７ｃＭ区段的衰老诱导
叶绿体持绿蛋白基因（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓｔａｙｇｒｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎ）狊犵狉（ＬＯＣ＿Ｏｓ０９ｇ３６２００．１）（ＧｅｎＢａｎｋ：
ＡＹ８５０１３４．１）。利用ＧＲＡＭＥＮＥ网站的Ｃｍａｐ功能，将该基因成功转定位于玉米ＩＢＭ２００８图谱的第７染色体
上，位于ｒｚ６１７～ｒｚ４０４标记区间，区间长度为１７９．４ｃＭ（图４Ａ）；利用 ＭａｉｚｅＧＤＢ网站中的ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒ工
具将Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２序列信息与ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ标记信息进行整合，将水稻狊犵狉基因定位在玉米物理图
谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２的９４．４２～１４３．４１Ｍｂ范围，利用ＰｌａｎｔＧＤＢ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ／）的在线区段
批量下载工具（ｄｏｗｎｌｏａｄｒｅｇｉｏｎｄａｔａ），分段下载该区间范围内已预测基因蛋白序列，与水稻持绿狊犵狉（ＬＯＣ＿
Ｏｓ０９ｇ３６２００．１）基因的蛋白序列进行保守结构域分析，最后在玉米第７染色体上（ｃｈｒ７：１４３０２０４５２Ｍｂ～
１４３０２２３７２Ｍｂ）找到与水稻狊犵狉基因同源的玉米基因ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１（图４Ｂ），其编码蛋白序列与水稻
狊犵狉基因一致（图４Ｃ）。
进一步将该预测基因序列与ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）提供的基因注释信息进行比对，
发现预测基因ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１与ＧｅｎＢａｎｋ中的玉米衰老诱导叶绿体持绿蛋白基因（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄｕｃ
ｉｂｌｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓｔａｙｇｒｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎ）狊犵狉１（ＡＹ８５０１３８．１）序列一致，表明ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１为玉米叶片持绿
的一个候选基因。
３　讨论
叶片衰老是一个受特定基因调控的主动的衰退过程，受不同生理生化途径的调控。对玉米持绿相关的４个
性状的１７３个ＱＴＬ进行整理，当ＬＯＤ值≥３．０时，１７３个ＱＴＬ中有１５０个被成功整合到ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ
１８１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图４　水稻持绿基因（狊犵狉）在玉米图谱的比较定位及其蛋白序列比对
犉犻犵．４　犆狅犾犻狀犲犪狉犻狋狔犮狅犿狆犪狉犲犱狋犺犲狊狋犪狔犵狉犲犲狀犵犲狀犲狊（狊犵狉）犻狀狏狅犾狏犻狀犵犻狀狉犻犮犲犪狀犱犿犪犻狕犲犪狀犱狋犺犲犻狉狆狉狅狋犲犻狀狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊
　Ａ：在玉米ＩＢＭ２Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ２００８遗传图谱上水稻持绿基因（狊犵狉）的比较定位 Ｃｏｌｉｎｅａｒｉｔｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｓｔａｙｇｒｅｅｎｇｅｎｅ（狊犵狉）ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｉｎｒｉｃｅ
ａｎｄｍａｉｚｅｏｎＩＢＭ２Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ２００８ｍａｐ；Ｂ：水稻持绿基因（狊犵狉）在玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２上的比较定位 Ｍａｐｅｄｔｈｅｒｉｃｅｓｔａｙｇｒｅｅｎｇｅｎｅ
（狊犵狉）ｏｎＢ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２；Ｃ：持绿基因（狊犵狉）蛋白序列同源比对结果 Ｔｈｅｂｌａｓｔｐｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔａｙｇｒｅｅｎｇｅｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅａｎｄｍａｉｚｅ．
高密度连锁图谱上，被整合的ＱＴＬ在１０条染色体上均有分布，这一结果显示，玉米的持绿性作为一个复杂的数
量性状，受众多基因的控制，作用机理复杂，涉及的生理调控途径也较多。Ｔｕｂｅｒｏｓａ等［３４］和严建兵等［３５］均发现
了ＱＴＬ聚集现象，本研究也发现不同材料涉及相同性状的ＱＴＬ在同一区域聚集，如集中在第４染色体的ｐｈｉ７２
～ｕｍｃ１２８８标记区段内的８个ＱＴＬ均为控制叶片叶绿素含量的ＱＴＬ，说明ＱＴＬ可能不是随机分布，而是位于
染色体的特定区域，预示着该区域的确存在“真实”的ＱＴＬ，这也是本研究仅对玉米持绿ＱＴＬ相对集中的第１，
４，５，９染色体进行了详细分析的原因。而且涉及不同性状的 ＱＴＬ也有聚集的现象，如第９染色体 ｗｘ１～
ｕｍｃ１１０７标记区间集中了６个控制叶片叶绿素含量、２个成熟时绿叶面积、３个叶片光合特性和１个成熟时绿叶
数的ＱＴＬ。这预示着在这一染色体区段可能密集着玉米持绿相关的ＱＴＬ簇，即基因簇，这种现象进一步说明了
不同性状之间的相互关系可归因于基因多效性或是基因之间的紧密连锁，为下一步基于一致性ＱＴＬ进行持绿
性相关的关键基因的定位和发掘提供了依据。
Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ等［３６］对玉米大规模ｃＤＮＡ测序结果分析以及Ｃａｒｏｌ等［３７］对玉米基因组２７４５５条全长ｃＤＮＡ的
ＧＯ注释结果分析表明，玉米基因组生物过程分类中，参与代谢过程的基因比例最大；细胞成分分类中，构成膜系
统基因所占比例最大；分子功能分类中，执行结合功能的基因所占比例最大。本研究中参与代谢过程、执行结合
功能的基因所占比例与整个基因组基因的ＧＯ分类结果一致，而细胞、细胞组成成分以及胞内物质所占比例远高
于膜系统所占比例，而且生物学过程中的细胞过程、大分子代谢过程、核酸代谢过程、细胞间通讯、运输、分解代谢
过程、细胞死亡、细胞内氨基酸代谢等过程所占比例远远高于基因组基因ＧＯ分布中的相应比例。由此可见，本
２８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
研究的１４４５个持绿候选基因主要参与了具体的细胞过程，执行结合功能，催化、转移酶活性和氧化还原酶活性
等分子功能。Ｗｏｎｇ等［３８］发现，控制类胡萝卜素４种组分合成的几个 ＱＴＬ与相关基因狔１和狏狆９位置重叠。
Ｚｈａｎｇ等［３９］发现，控制玉米花丝内可凝性球蛋白水平的一个ＱＴＬ与２个相关候选基因狆１和狆２位置重叠。本
研究的５个“一致性”ＱＴＬ区间在ＩＢＭ２２００８Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ图谱内都检测到持绿相关基因，在包含持绿相关基因的
ＭＱＴＬ区域，存在与这些基因序列相同或相似的预测基因序列，最终在５个玉米持绿“一致性”ＱＴＬ内，初步确
定８个玉米持绿性候选基因，下一步将验证其功能。
禾本科作物基因组存在高度保守性，控制重要性状的基因在不同作物中可能位于相同或相近的位置，并与相
同的分子标记相连锁，在某一作物中定位的基因或ＱＴＬ信息可以用于其他作物［２２］。水稻由于其基因组相对较
小，遗传转化体系成熟，且与禾本科粮食作物存在共线性，使其成为作物分子遗传学及基因组学研究的模式植物，
已经有一大批的控制水稻高产、优质、抗逆和营养高效等许多重要农艺性状的基因被成功分离［４０］。本研究通过
比较定位将水稻衰老诱导叶绿体持绿蛋白基因狊犵狉转定位于在玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２上，采用染色体步
移的方法，找到与水稻狊犵狉基因同源的玉米基因ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１，将该基因序列与ＮＣＢＩ提供的基因注
释信息进行比对，发现与玉米衰老诱导叶绿体持绿蛋白基因狊犵狉１序列一致，为候选基因发掘提供了一条新途径。
４　结论
采用ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１软件构建出含１５０个玉米持绿性相关ＱＴＬ的整合图谱，１５０个ＱＴＬ在１０条染色体
上均有分布，但存在明显富集和成簇分布的现象。对玉米持绿ＱＴＬ相对集中的第１，４，５，９染色体进行元分析，
得到５个玉米持绿“一致性”ＱＴＬｓ。持绿“一致性”ＱＴＬ区间共有１４４５个基因，其中，５１３个基因参与植物体内
的生物过程，１６５个基因是细胞组成成分，７６７个基因具有分子功能，分别涉及２２种生物过程，２３种分子功能，１１
种细胞成分。候选基因主要参与了具体的细胞过程，主要执行结合功能，催化、转移酶活性和氧化还原酶活性等
分子功能，包含ＧＲＡＳ、ＣＢＦ、ＳＲＦ转录调控因子、叶绿体结合蛋白、植物激素诱导／响应蛋白及细胞分裂周期相关
蛋白、细胞色素Ｐ４５０氧化酶、细胞分裂素脱氢酶、磷脂酶ＰＬＤ、ＲｕＢＰ羧化酶、糖基转移酶等已报道的与持绿性相
关的功能蛋白或转录因子家族的保守结构域。在包含持绿性相关基因位点的“一致性”ＱＴＬ区域，均存在与这些
基因序列相同或相似的预测基因，最终，在５个“一致性”持绿ＱＴＬ区间内初步确定了８个玉米持绿性相关候选
基因。利用比较基因组学方法，将水稻衰老诱导叶绿体持绿蛋白基因狊犵狉转定位于在玉米物理图谱Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ
＿ｖ２上，并找到与该基因同源的玉米候选基因ＧＲＭＺＭ２Ｇ０９１８３７＿Ｔ０１，为候选基因发掘提供了一条新途径。
参考文献：
［１］　乔岩，王汉宁，张成，等．玉米胚乳突变基因ａｅ连锁累赘的ＳＳＲ分析［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（１）：１４０１４７．
［２］　ＴｈｏｍａｓＨ，ＳｍａｒｔＣＭ．Ｃｒｏｐｓｔｈａｔｓｔａｙｇｒｅｅｎ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１２３：１９３２１９．
［３］　ＧｅｎｔｉｎｅｔｔａＥ，ＣｅｐｐｉＤ，ＬｅｐｏｒｉＣ，犲狋犪犾．Ａｍａｊｏｒｇｅｎｅｆｏｒｄｅｌａｙｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｍａｉｚｅ：Ｐａｔｔｅｒｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈａｔｅｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄ，１９８６，９７：１９３２０３．
［４］　ＭａＢＬ，ＤｗｙｅｒＬＭ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎｕｐｔａｋｅａｎｄｕｓｅｏｆｔｗｏｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｍａｉｚｅｈｙｂｒｉｄｓｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔａｎｄＳｏｉｌ，
１９９８，１９９：２８３２９１．
［５］　ＰｏｍｍｅｌＢ，ＧａｌａｉｓＡ，ＣｏｑｕｅＭ，犲狋犪犾．Ｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｇｒａｉｎｆｉｌｉｎｇｉｎｔｈｒｅｅｍａｉｚｅｈｙｂｒｉｄｓｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｌｅａｆ
ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，２００６，２４：２０３２１１．
［６］　ＢｅｋａｖａｃＧ，ＰｕｒａｒＢ，ＳｔｏｊａｋｏｖｉｈＭ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔａｙｇｒｅｅｎｔｒａｉｔｉｎｂｒｏａｄｂａｓｅｄｍａｉｚｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＣｅｒｅａｌＲｅ
ｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７，３５（１）：１９３２０３．
［７］　董树亭，王空军，胡昌浩，等．玉米品种更替过程中群体光合特性的演变［Ｊ］．作物学报，２０００，２６（２）：２００２０４．
［８］　ＤｕｖｉｃｋＤＮ．Ｇｅｎｅｔｉｃｒａｔｅｓｏｆｇｒａｉｎｉｎｈｙｂｒｉｄｍａｉｚｅｙｉｅｌｄｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐａｓｔ４０ｙｅａｒｓ［Ｊ］．Ｍａｙｄｉｃａ，１９９７，２３：１８７１９６．
［９］　郑洪建，沈雪芳，吴爱忠．玉米叶片保绿性遗传研究进展［Ｊ］．上海农业学报，２００７，２３（４）：９０９４．
［１０］　ＢｅａｖｉｓＷＤ，ＳｍｉｔｈＯＳ，ＧｒａｎｔＤ，犲狋犪犾．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉｕｓｉｎｇａｓｍａｌｓａｍｐｌｅｏｆｔｏｐｃｒｏｓｓｅｄａｎｄＦ４
ｐｒｏｇｅｎｙｆｒｏｍｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，１９９４，３４：８８２８９６．
［１１］　ＶｉｅｎｎｅＤ，ＬｅｏｎａｒｄｉＡ．ＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｖａｒｉａｔｉｏｎｆｏｒＱＴＬｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎ
３８１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
ｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，１９９９，５０：３０３３０９．
［１２］　ＺｈｅｎｇＨＪ，ＷｕＡＺ，ＣａｉＲ，犲狋犪犾．ＱＴＬｍａｐｐｉｎｇｏｆｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊Ｌ．）ｓｔａｙｇｒｅｅｎｔｒａｉｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｙｉｅｌｄ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００９，１２８（１）：５４６２．
［１３］　王爱玉，张春庆．玉米叶绿素含量的ＱＴＬ定位［Ｊ］．遗传，２００８，３０（８）：１０８３１０９１．
［１４］　王春丽．玉米穗部性状及主要农艺性状发育动态的ＱＴＬ定位［Ｄ］．郑州：河南农业大学，２００５．
［１５］　刘宗华，谢惠玲，王春丽，等．氮胁迫和非胁迫条件下玉米不同时期叶绿素含量的 ＱＴＬ分析［Ｊ］．植物营养与肥料学报，
２００８，１４（５）：８４５８５１．
［１６］　于晓芳．玉米叶片水分利用效率及其相关性状的ＱＴＬ定位与分析［Ｄ］．包头：内蒙古农业大学，２０１０．
［１７］　王建康，李慧慧，张学才，等．中国作物分子设计育种［Ｊ］．作物学报，２０１１，３７（２）：１９１２０１．
［１８］　ＧｏｆｆｉｎｅｔＢ，ＧｅｒｂｅｒＳ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ：Ａｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，１５５：４６３４７３．
［１９］　ＡｒｃａｄｅＡ，ＬａｂｏｕｒｄｅｔｔｅＡ，ＦａｌｑｕｅＭ，犲狋犪犾．ＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｓａｎｄＱＴＬｔｏｗａｒｄｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，２０（１４）：２３２４２３２６．
［２０］　李立芹，黄玉碧，王西瑶．马铃薯 ＷＲＫＹ６基因的克隆、序列分析与原核表达研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（２）：１７７１８３．
［２１］　江腾，林勇祥，刘雪，等．苜蓿全基因组 ＷＲＫＹ转录因子基因的分析［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（３）：２１１２１８．
［２２］　ＣｈａｒｄｏｎＦ，ＶｉｒｌｏｎＢ，ＭｏｒｅａｕＬ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｔｉｃａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅｉｎｍａｉｚｅａｓｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ
ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｙｎｔｅｎｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｒｉｃｅｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１６８：２１６９２１８５．
［２３］　ＬｏｍｂａｒｄＶ，ＤｅｌｏｕｒｍｅＲ．Ａｃｏｎｓｅｎｓｕｓｌｉｎｋａｇｅｍａｐｆｏｒｒａｐｅｓｅｅｄ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍａｐｓｆｒｏｍ
ＤＨｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４９１５０７．
［２４］　ＭａｒｃｅｌＴＣ，ＶａｒｓｈｎｅｙＲＫ，ＢａｒｂｉｅｒｉＭ，犲狋犪犾．ＡｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｃｏｎｓｅｎｓｕｓｍａｐｏｆｂａｒｌｅｙｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＱＴＬｓ
ｆｏｒｐａｒｔｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＰｕｃｃｉｎｉａｈｏｒｄｅｉａｎｄｏｆｄｅｆｅｎｃｅｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，１１４：
４８７５００．
［２５］　李雪华，李新海，郝转芳，等．干旱条件下玉米耐旱相关性状的 ＱＴＬ一致性图谱构建［Ｊ］．中国农业科学，２００５，３８（５）：
８８２８９０．
［２６］　栗文娟，刘志斋，石云素，等．基于元分析和生物信息学分析的玉米抗旱相关性状 ＱＴＬ一致性区间定位［Ｊ］．作物学报，
２０１０，３６（９）：１４５７１４６７．
［２７］　王毅，姚骥，张征锋，等．基于玉米综合ＱＴＬ图谱的比较分析及株高ＱＴＬ的统合分析［Ｊ］．科学通报，２００６，５１（１５）：１７７６
１７８６．
［２８］　张耿，祝丽英，陈景堂，等．玉米产量相关性状 ＱＴＬ通用图谱的构建及功能候选基因的开发［Ｊ］．华北农学报，２００８，
２３（６）：２２２７．
［２９］　王帮太，吴建宇，丁俊强，等．玉米产量及产量相关性状ＱＴＬ的图谱整合［Ｊ］．作物学报，２００９，３５（１０）：１８３６１８４３．
［３０］　王晓丽，李新海，王振华，等．玉米产量因子ＱＴＬ整合图谱构建与“一致性”ＱＴＬ确定［Ｊ］．核农学报，２００８，２２（６）：７５６
７６１．
［３１］　吉海莲，李新海，谢传晓，等．基于元分析的抗玉米丝黑穗病 ＱＴＬ比较定位［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００７，８（２）：１３２
１３９．
［３２］　ＤａｒｖａｓｉＡ，ＳｏｌｅｒＭ．ＡｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｔｏｃａｌｃｕｌａｔｅｒｅｓｏｌｖｉｎｇｐｏｗｅｒａｎｄｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆＱＴＬｍａｐｌｏｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｅｈａｖ
ｉｏｒＧｅｎｅｔｉｃｅｓ，１９９７，２７：１２５１３２．
［３３］　ＡｓｈｂｕｍｅｒＭ．Ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｕｎｉｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｙ．ＴｈｅＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ，２０００，
２５（１）：２５２９．
［３４］　ＴｕｂｅｒｏｓａＲ，ＳａｌｖｉＳ，ＳａｎｇｕｉｎｅｔｉＭ，犲狋犪犾．ＭａｐｐｉｎｇＱＴＬｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｏｒｐｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｒａｉｔｓａｎｄｙｉｅｌｄ：Ｃａｓｅｓｔｕｄｉｅｓ，ｓｈｏｒｔ
ｃｏｍｉｎｇｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｅｄｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｅｓＢｏｔａｂｉｃｉＦｅｎｎｉｃｉ，２００２，８９（７）：９４１９６３．
［３５］　严建兵，汤华，黄益勤，等．玉米和水稻重要性状ＱＴＬ的比较研究［Ｊ］．遗传学报，２００４，３１：１４０１１４０７．
［３６］　ＡｌｅｘａｎｄｒｏｖＮＮ，ＢｒｏｖｅｒＷ，ＦｒｅｉｄｉｎＳ，犲狋犪犾．ＩｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｃｏｒｎｇｅｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｌａｒｇｅｓｃａｌｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００９，６９：１７９１９４．
［３７］　ＣａｒｏｌＳ，ＡｎｎｅＤ，ＤａｖｅＫ，犲狋犪犾．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆ２７，４５５ｍａｉｚｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓ［Ｊ］．ＰｌｏｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，
２００９，５（１１）：１０００７１３１０００７４１．
４８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
［３８］　ＷｏｎｇＪＣ，ＬａｍｂｅｒｔＲＪ，ＷｕｒｔｚｅｌＥＴ，犲狋犪犾．ＱＴＬａｎｄｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｐｈｙｔｏｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄｚｅｔａｃａｒｏｔｅｎｅｄｅｓａｔｕｒａｓｅａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０８（２）：３４９３５９．
［３９］　ＺｈａｎｇＰ，ＷａｎｇＹ，ＺｈａｎｇＪ，犲狋犪犾．ＡｍａｉｚｅＱＴＬｆｏｒｓｉｌｋｍａｙｓｉｎｌｅｖｅｌｓｃｏｎｔａｉｎｓｄｕｐｌｉｃａｔｅｄＭｙｂｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓｗｈｉｃｈ
ｊｏｉｎｔｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｆｌａｖｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（１）：１１５．
［４０］　肖景华，吴昌银，韩斌，等．中国水稻功能基因组研究进展［Ｊ］．中国科学Ｃ辑：生命科学，２００９，３９（１０）：９０９９２４．
犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犻狀狋犲犵狉犪狋犻狅狀犙犜犔犿犪狆犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犪狀犱犻犱犪狋犲犵犲狀犲狊犳狅狉狊狋犪狔犵狉犲犲狀犻狀犿犪犻狕犲
ＦＡＮＧＹｏｎｇｆｅｎｇ１，２，３，ＬＩＹｏｎｇｓｈｅｎｇ３，ＢＡＩＪｉａｎｇｐｉｎｇ１，２，３，ＭＵＰｉｎｇ３，ＭＥＮＧＹａｘｉｏｎｇ１，２，３，
ＺＨＡＮＧＪｉｎｌｉｎ４，ＷＡＮＧＨａｎｎｉｎｇ１，２，３，ＳＨＡＮＧＸｕｎｗｕ３
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｉｄｌａｎｄＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
４．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｓａｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｌａｙｅｄｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｒｓｔａｙｇｒｅｅｎｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｈａｓｒｅｃｅｉｖｅｄｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｎｅｇａｔｉｖｅｉｍｐａｃｔｏｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｎｕｔｒｉｅｎｔｒｅ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｔｈｅｐｌａｎｔ．Ｉｎｔｈｅｐａｓｔｆｅｗｄｅｃａｄｅｓ，ａｗｅａｌｔｈｏｆＱＴＬｓ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ）ｍａｐｐｉｎｇｄａｔａ
ｆｏｒｓｔａｙｇｒｅｅｎａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｒａｉｔｓｉｎｍａｉｚｅｈａｓｂｅｅｎｐｒｏｄｕｃｅｄｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏ
ｕｎｌｏｃｋｔｈｅｆｕｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｓｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，１７３ｓｔａｙｇｒｅｅｎａｎｄｒｅ
ｌａｔｅｄＱＴＬｓｉｎｍａｉｚｅｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｉｃｄａｔａｂａｓｅ（ｍａｉｚｅＧＤＢ），ａｎｄｗｅｒｅｃｏｍｐｉｌｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＱＴＬｍａｐｆｏｒｓｔａｙｇｒｅｅｎｉｎｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）．Ｔｈｅｈｉｇｈｓｃａｌｅｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐｏｆｍａｉｚｅ
ＩＢＭ２２００８ＮｅｉｇｈｂｏｒｓｗａｓｕｓｅｄａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅａｎｄｔｈｅｍａｐｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈＢｉｏＭｅｒｃａｔｏｒ２．１ｓｏｆｔｗａｒｅｂａｓｅｄ
ｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ．ＦｉｖｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬｆｏｒｍａｉｚｅｓｔａｙｇｒｅｅｎｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｏｎｍａｉｚｅｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅｓ１，４，５ａｎｄ９，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡｆｔｅｒｐｒｏｊｅｃｔｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬｒｅｇｉｏｎｏｎｍａｉｚｅｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆＢ７３Ｒｅｆ
Ｇｅｎ＿ｖ２，ａｔｏｔａｌｏｆ１４４５ｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓＱＴＬｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄａｎｄｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍ
ＰｌａｎｔＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ／）．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ，ｍｏｓｔ
ｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｍｉｇｈｔｔａｋｅｐａｒｔｉｎｔｈｅｃｅｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｏｔｈｅｒｂｉｏｌｏｇｉ
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Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ２．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓａｐｐｒｏａｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｕｓｅｆｕｌｔｏｏｌｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＱＴＬ
ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｓｔａｙｇｒｅｅｎａｎｄｏｔｈｅｒｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｉｎｍａｉｚｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣犲犪犿犪狔狊；ｓｔａｙｇｒｅｅｎ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ（ＱＴＬ）；ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｍａｐ；ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ
５８１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
添加酶和乳酸菌制剂对西藏苇状羊茅和箭薚豌豆
混合青贮发酵品质的影响
王奇１，余成群２，李志华１，赵庆杰１，下条雅敬３，邵涛１
（１．南京农业大学动物科学技术学院饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京２１００９５；２．中国科学院地理科学与资源研究所，
北京１００１０１；３．九州大学生物资源与环境学部动物饲料生产与利用研究室，日本 福冈８１２８５８１）
摘要：为评价添加酶、乳酸菌制剂和酶＋乳酸菌制剂对苇状羊茅与箭薚豌豆（７∶３）混合青贮发酵品质的影响，试验
设对照组（Ｃ）、酶制剂（Ｅ）、乳酸菌制剂（ＬＡＢ）和酶＋乳酸菌制剂（Ｅ＋ＬＡＢ）４个处理，３个重复，青贮后第７，２４，６０
天开窖取样，测定青贮饲料发酵品质。结果表明，与对照组相比，添加酶或乳酸菌制剂能有效地改善混合青贮发酵
品质，组合添加进一步提高了乳酸含量和降低了ｐＨ值。与对照组和单独添加乳酸菌组相比，在整个青贮过程中
无论是酶单独添加还是组合添加都显示较高的乙酸和总挥发性脂肪酸含量，最高的水溶性碳水化合物含量和最低
的氨态氮／总氮。这说明酶和乳酸菌制剂组合添加对改善青贮发酵品质有叠加效应。综上所述，酶和乳酸菌制剂
组合添加能更好的改善苇状羊茅和箭薚豌豆混合青贮的发酵品质。
关键词：苇状羊茅；箭薚豌豆；混合青贮；添加剂；发酵品质
中图分类号：Ｓ８１６．６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１８６０６
　　西藏地处我国西南边陲，素以“世界屋脊”和“地球第三极”著称于世。由于其特殊的地理位置和生态条件，畜
牧业在全区占有非常重要的地位，但是目前西藏牧区草地退化致使草畜矛盾日益突出，严重制约了西藏畜牧业的
可持续发展。在西藏农区实施优质牧草种植，加工与贮藏，为藏北牧区提供优质青贮饲料，对缓解藏北冬春季节
草地超载过牧压力，促进退化高寒草地恢复重建，实现藏北草地畜牧业减压增效具有重要意义。
箭薚豌豆（犞犻犮犻犪狊犪狋犻狏犪）和苇状羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）是西藏主要栽培牧草，箭薚豌豆具有抗寒性强、
产量高、适应性广；粗蛋白含量高、枝叶柔嫩、适口性好等优点［１］，但缓冲能高，水溶性碳水化合物含量低，单独青
贮难以成功［２］；苇状羊茅水溶性碳水化合物含量较高，但蛋白质含量低；将２种牧草混合青贮既可以提高苇状羊
茅青贮饲料的蛋白质含量及营养价值，又解决了箭薚豌豆单独青贮难以成功的难题［２］。
酶与乳酸菌制剂是目前应用于青贮饲料生产中最为常用的青贮添加剂［３］，添加乳酸菌制剂可以增加乳酸菌
的数量，促进青贮初期乳酸发酵，快速降低ｐＨ，有效地抑制青贮过程中有害微生物的活性，提高青贮发酵品
质［４，５］。酶制剂能将青贮原料中纤维素、半纤维素降解成水溶性碳水化合物，为乳酸菌提供更多的发酵底物［６，７］，
促进乳酸发酵，而酶和乳酸菌制剂组合添加可进一步提高其青贮发酵品质［８］。
本试验目的是根据苇状羊茅和箭薚豌豆混合青贮比例筛选的研究结果基础上，通过添加酶与乳酸菌制剂进
一步提高其混合青贮的发酵品质。
１　材料与方法
１．１　试验材料
将种植于西藏日喀则地区草原工作站试验地的苇状羊茅和箭薚豌豆于２０１０年９月８日刈割，刈割后在田间
用铡刀切成２ｃｍ左右，将７０％苇状羊茅和３０％箭薚豌豆充分混匀，作为青贮材料。苇状羊茅处于抽穗初期，箭
薚豌豆处于结荚期。各青贮材料化学成分见表１。
１８６－１９１
２０１２年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１１０８１７；改回日期：２０１１１０１９
基金项目：西藏主要农作物秸秆与栽培牧草混合青贮关键技术研究（ＸＺ２００９３ＺＤ）和国家科技支撑计划“藏北退化草地综合整治技术与示范”
（２０１０ＢＡＥ００７３９－０３）资助。
作者简介：王奇（１９８９），男，山东成武人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇ＿ｑｉ５７＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔａｏｓｈａｏｌａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　酶制剂为Ｃｏｒｎｚｙｍｅ酶（保康生），主要成分包括
纤维素、半纤维素和葡萄糖氧化酶，是芬兰饲料国际有
限公司（ＦＦＩ）研制的青贮饲料专用添加剂，添加量参
照使用说明。
乳酸菌制剂主要由植物乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌
以及葡萄糖等组成，保证每克青贮原料中含有２×１０６
ｃｆｕ。由南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所和
西藏高原草业工程技术研究中心研制。
１．２　试验设计
试验采用完全随机设计，设对照组和３个不同添
加剂处理组。对照组（Ｃ，无添加）；酶制剂添加组（Ｅ）：
表１　苇状羊茅和箭薚豌豆化学成分
犜犪犫犾犲１　犆犺犲犿犻犮犪犾犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狊狅犳狋犪犾
犳犲狊犮狌犲犪狀犱犮狅犿犿狅狀狏犲狋犮犺
青贮材料
Ｅｎｓｉｌａｇｅ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ
干物质
Ｄｒｙ
ｍａｔｔｅｒ
（ｇ／ｋｇＦＷ）
粗蛋白质
Ｃｒｕｄｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
水溶性碳水化合物
Ｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅ
ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
苇状羊茅Ｔａｌｆｅｓｃｕｅ ３２６．５８ ４３．４９ ２０９．３６
箭薚豌豆Ｃｏｍｍｏｎｖｅｔｃｈ １８３．９６ ２２６．５９ ２７．０１
　ＦＷ：鲜重Ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ；ＤＭ：干物质 Ｄｒｙｍａｔｔｅｒ．
３ｍＬ／ｋｇ鲜草；乳酸菌制剂添加组（ＬＡＢ）：２ｇ／ｋｇ鲜草；酶和乳酸菌制剂组合添加组（Ｅ＋ＬＡＢ）。在青贮后的第
７，２４和６０天打开青贮窖取样分析，每个处理各个时间点３个重复。
１．３　试验方法
１．３．１　青贮饲料的调制　苇状羊茅和箭薚豌豆用铡刀切成２ｃｍ左右后，按试验设计添加酶、乳酸菌制剂充分混
合均匀，装填至实验室青贮窖中压实密封，置于室温条件下保存。采用实验室青贮窖，容积为１２０ｍＬ的塑料容
器。每个实验室青贮窖填装８０ｇ鲜草。
１．３．２　样品处理　在青贮第７，２４和６０天分别打开青贮窖，取出全部青贮饲料将其混合均匀，称取３５ｇ放入
１００ｍＬ的广口三角瓶，加入７０ｇ的去离子水，４℃浸提２４ｈ，然后通过２层纱布和定性滤纸过滤，所得液体为青
贮饲料浸提液，将浸提液置于－２０℃冷冻冰箱保存待测。滤液用来测定ｐＨ值、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸。
将剩余部分青贮饲料收集烘干，测定干物质、总氮以及水溶性碳水化合物。
１．３．３　测定项目及分析方法　干物质含量测定（ｄｒｙｍａｔｔｅｒ，ＤＭ）在６５℃烘箱中干燥６０ｈ；ｐＨ值用 ＨＡＮＮＡ
ｐＨ２１１型ｐＨ计测定；乳酸含量（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ，ＬＡ）用对－羟基联苯比色法测定［９］；水溶性碳水化合物含量（ｗａｔｅｒ
ｓｏｌｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ，ＷＳＣ）采用蒽酮－硫酸比色法测定［１０］；氨态氮含量（ａｍｍｏｎｉａｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＡＮ）采用苯酚－
次氯酸钠比色法测定［１１］；总氮含量（ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＴＮ）采用凯氏定氮法测定［１２］；挥发性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙ
ａｃｉｄｓ，ＶＦＡｓ）采用高效气相色谱仪（日本岛津 ＧＣ１４Ｂ）测定［１３］，包括乙酸（ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＡＡ）、丙酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ
ａｃｉｄ，ＰＡ）与丁酸（ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ＢＡ），测定条件：色谱柱为毛细管柱，柱温１４０℃，汽化室温度１８０℃，氢气检测器
温度２２０℃，检测器ＦＩＤ，载气为氮气，压力为０．０５ＭＰａ，氢气压力为０．０５ＭＰａ，氧气压力为０．０５ＭＰａ。
１．４　数据处理与统计
采用ＳＡＳ（８．２）软件对试验数据进行单因子方差分析（ＡＮＯＶＡ），并用邓肯氏（Ｄｕｎｃａｎ）方法对处理间及青
贮天数间平均数进行多重比较（犘＜０．０５）［１４］。
２　结果与分析
２．１　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮过程中干物质、ｐＨ值和乳酸含量的影响
在整个青贮过程中，所有处理组干物质含量均随着青贮时间的延长呈下降趋势（表２），青贮过程中ＬＡＢ和
Ｅ＋ＬＡＢ处理组干物质含量始终显著（犘＜０．０５）高于对照和Ｅ处理组，但Ｅ和对照组间差异不显著（犘＞０．０５）。
整个青贮过程中添加处理组各时间点ｐＨ值均低于（犘＞０．０５）或显著（犘＜０．０５）低于对照组。在青贮第７
和６０天，Ｅ＋ＬＡＢ处理组ｐＨ值显著（犘＜０．０５）低于Ｅ和ＬＡＢ处理组，而ＬＡＢ和Ｅ处理组差异不显著（犘＞
０．０５）。与ｐＨ值相对应地，各添加处理组乳酸含量均高于（犘＞０．０５）或显著（犘＜０．０５）高于对照组。其中Ｅ＋
ＬＡＢ处理组在青贮第２４天显著（犘＜０．０５）高于Ｅ和ＬＡＢ处理组，第６０天Ｅ和Ｅ＋ＬＡＢ处理组显著（犘＜０．０５）
高于ＬＡＢ组。
２．２　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响
在青贮的整个过程中，随着青贮时间的延长，各处理组的乙酸含量（表３）除个别波动外，总体呈逐渐升高的
７８１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
趋势，ＬＡＢ处理组乙酸含量始终显著（犘＜０．０５）低于其他各处理组，Ｅ处理组显著（犘＜０．０５）高于其他各组。
除对照组检测到丁酸外，其他各组均未检测到丁酸产生，且整个青贮过程中基本上未发现丙酸的产生，总挥
发性脂肪酸变化趋势基本与乙酸变化趋势一致。
表２　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮过程中狆犎、干物质和乳酸含量的影响
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犱犱犻狀犵犮狅犲狀狕狔犿犲犪狀犱犾犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狅狀狆犎，犇犕犪狀犱犔犃犮狅狀狋犲狀狋狊狅犳犿犻狓犲犱狊犻犾犪犵犲狊犱狌狉犻狀犵犲狀狊犻犾犻狀犵
测定项目
Ｉｔｅｍｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
青贮天数Ｅｎｓｉｌｉｎｇｄａｙｓ（ｄ）
７ ２４ ６０
干物质Ｄｒｙｍａｔｔｅｒ
（ｇ／ｋｇＦＷ）
Ｃ ２３２．９９±５．３７Ｂａ ２３０．３５±５．０３Ｂａ ２２１．８４±５．０８Ｂａ
Ｅ ２３２．２４±１．５２Ｂａ ２３０．１６±５．０３Ｂａ ２２６．４８±５．３９Ｂａ
ＬＡＢ ２４６．７３±６．２３Ａａ ２４０．４７±６．７１Ａａ ２３９．７６±６．６６Ａａ
Ｅ＋ＬＡＢ ２４６．４６±４．４７Ａａ ２４５．６７±５．１７Ａａ ２３２．８７±５．２４Ａｂ
ｐＨ值ｐＨｖａｌｕｅ Ｃ ４．５４±０．１０Ａａ ４．１８±０．０２Ａｂ ４．２０±０．０３Ａｂ
Ｅ ４．４１±０．０４Ｂａ ４．０３±０．０３Ｂｂ ４．０３±０．０７Ｂｂ
ＬＡＢ ４．４６±０．０５ＡＢａ ４．０４±０．０７Ｂｂ ４．０３±０．０１Ｂｂ
Ｅ＋ＬＡＢ ４．２０±０．０７Ｃａ ３．９７±０．０２Ｂｂ ３．９４±０．００Ｃｂ
乳酸Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ ６０．０１±５．００Ａｂ ８５．０３±０．２２Ｃａ ８４．９８±３．３３Ｂａ
Ｅ ６１．９６±６．３６Ａｂ ９７．０３±７．９９Ｂａ ９３．７０±１．０８Ａａ
ＬＡＢ ６１．７２±２．６４Ａｃ ９２．９３±２．２７ＢＣａ ８７．４１±０．３３Ｂｂ
Ｅ＋ＬＡＢ ６５．５８±６．２７Ａｃ １０７．２６±６．２６Ａａ ９５．６１±２．６０Ａｂ
　注：不同小写字母表示相同处理不同青贮天数间差异显著（犘＜０．０５）；不同大写字母表示相同青贮天数不同处理间差异显著（犘＜０．０５），下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｉｔｔｌｅｌｅｔｔｅｒｓｓｈｏｗｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｅｎｓｉｌｉｎｇｄａｙｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（犘＜０．０５），ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｓｈｏｗｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｅｎｓｉｌｉｎｇｄａｙ（犘＜０．０５），ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
表３　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犱犱犻狀犵犮狅犲狀狕狔犿犲犪狀犱犾犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狅狀狏狅犾犪狋犻犾犲犳犪狋狋狔犪犮犻犱犮狅狀狋犲狀狋狊狅犳犿犻狓犲犱狊犻犾犪犵犲狊犱狌狉犻狀犵犲狀狊犻犾犻狀犵
测定项目
Ｉｔｅｍｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
青贮天数Ｅｎｓｉｌｉｎｇｄａｙｓ（ｄ）
７ ２４ ６０
乙酸Ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ １４．１７±０．９４Ａｂ １９．３３±０．５８Ｂａ １７．７５±１．０６Ｃａ
Ｅ １６．７３±２．４５Ａｂ ２２．２５±２．４８Ａａ ２３．６２±１．０２Ａａ
ＬＡＢ １０．２２±２．８３Ｂｂ １４．６０±０．８２Ｃａ １６．４７±０．６８Ｃａ
Ｅ＋ＬＡＢ １５．６９±１．４０Ａｂ １８．７５±０．５３Ｂａ ２０．７１±１．５８Ｂａ
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ ０．０１±０．０１Ａａ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ
Ｅ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ
ＬＡＢ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ
Ｅ＋ＬＡＢ ０．０１±０．０２Ａａ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ａａ
丁酸Ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ
（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ ０．１７±０．１７Ａｂ ０．１４±０．１４ＡＢｂ ０．８４±０．２４Ａａ
Ｅ ０．００±０．００Ｂａ ０．００±０．００Ｂａ ０．１４±０．１４Ｂａ
ＬＡＢ ０．００±０．００Ｂａ ０．００±０．００Ａａ ０．００±０．００Ｂａ
Ｅ＋ＬＡＢ ０．００±０．００Ｂａ ０．００±０．００Ｂａ ０．００±０．００Ｂａ
总挥发性脂肪酸
Ｔｏｔａｌｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙ
ａｃｉｄｓ（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ １４．５２±１．２９Ａｂ １９．６０±０．３１ＡＢａ １９．４３±１．５３Ｂａ
Ｅ １６．７３±２．４５Ａｂ ２２．２５±２．４８Ａａ ２２．８９±０．７４Ａａ
ＬＡＢ １０．２３±２．８３Ｂｂ １６．９８±１．５６Ｂａ １６．４７±０．６８Ｃａ
Ｅ＋ＬＡＢ １５．７１±１．３８Ａｂ １８．７５±０．５３Ｂａ ２０．７１±１．５８Ｂａ
８８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
２．３　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮氨态氮／总氮、乳酸／乙酸和水溶性碳水化合物含量的影响
随着青贮时间的延长，青贮过程中各组氨态氮／总氮均呈逐渐上升的趋势（表４），与对照相比，各添加剂处理
组均降低了氨态氮／总氮，其中青贮第２４和６０天Ｅ＋ＬＡＢ组氨态氮／总氮显著（犘＜０．０５）低于对照组。在整个
青贮过程中，ＬＡＢ处理组乳酸／乙酸显著（犘＜０．０５）高于其他各组。
青贮过程中各组水溶性碳水化合物均呈显著（犘＜０．０５）下降趋势，在青贮第７天，Ｅ＋ＬＡＢ组显著（犘＜
０．０５）高于对照和Ｅ组。第２４天，各添加剂处理组水溶性碳水化合物含量均显著（犘＜０．０５）高于对照，其中ＬＡＢ
组显著（犘＜０．０５）高于Ｅ组，Ｅ＋ＬＡＢ组水溶性碳水化合物含量最高（犘＜０．０５）。第６０天，Ｅ和Ｅ＋ＬＡＢ组水
溶性碳水化合物含量显著（犘＜０．０５）高于对照和ＬＡＢ组。
表４　添加酶和乳酸菌制剂对混合青贮过程中氨态氮／总氮、乳酸／乙酸和水溶性碳水化合物含量的影响
犜犪犫犾犲４　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犱犱犻狀犵犮狅犲狀狕狔犿犲犪狀犱犾犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狅狀犪犿犿狅狀犻犪狀犻狋狉狅犵犲狀／狋狅狋犪犾狀犻狋狉狅犵犲狀，犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱／犪犮犲狋犻犮犪犮犻犱
犪狀犱狑犪狋犲狉狊狅犾狌犫犾犲犮犪狉犫狅犺狔犱狉犪狋犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳犿犻狓犲犱狊犻犾犪犵犲狊犱狌狉犻狀犵犲狀狊犻犾犻狀犵
测定项目
Ｉｔｅｍｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
青贮天数Ｅｎｓｉｌｉｎｇｄａｙｓ（ｄ）
７ ２４ ６０
氨态氮／总氮 Ａｍｍｏｎｉａｎｉｔｒｏ
ｇｅｎ／ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ（ｇ／ｋｇＴＮ）
Ｃ ４５．９５±７．６１Ａａ ４８．４６±２．２２Ａａ ５１．３２±３．８５Ａａ
Ｅ ４１．３７±６．６５Ａａ ４３．６７±４．４５ＡＢａ ４５．３１±７．０８ＡＢａ
ＬＡＢ ４１．３６±２．７９Ａａ ４３．８４±６．３２ＡＢａ ４６．４４±５．６７ＡＢａ
Ｅ＋ＬＡＢ ３６．５２±４．１０Ａａ ３９．１３±４．６３Ｂａ ３９．３９±５．０７Ｂａ
乳酸／乙 酸 Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ
Ｃ ４．３０±０．０７ＡＢｂ ４．４０±０．１４Ｂｂ ４．７９±０．１０Ｂａ
Ｅ ３．７２±０．１７Ｂｂ ４．３８±０．４４Ｂａ ３．９７±０．１３Ｃａｂ
ＬＡＢ ６．３３±２．１６Ａａ ６．３８±０．５１Ａａ ５．３１±０．２０Ａａ
Ｅ＋ＬＡＢ ４．１８±０．２５Ｂｂ ５．７３±０．５０Ａａ ４．６３±０．２３Ｂｂ
水溶性碳水化合物 Ｗａｔｅｒｓｏｌ
ｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ（ｇ／ｋｇＤＭ）
Ｃ ５６．８５±０．０２Ｂａ ２２．２２±１．１９Ｄｂ １３．７５±１．５８Ｃｃ
Ｅ ５６．３５±０．１６Ｂａ ２７．６７±０．８３Ｃｂ ２３．２３±４．９０Ａｃ
ＬＡＢ ６３．４７±３．４６ＡＢａ ３１．２３±１．４１Ｂｂ １８．１１±１．３７Ｂｃ
Ｅ＋ＬＡＢ ７１．１４±７．７７Ａａ ４５．９７±１．６５Ａｂ ２３．９５±０．４６Ａｃ
３　结论与讨论
经过６０ｄ的青贮，结果显示包括对照组在内所有处理均具有较高的乳酸含量（８４．９８～９５．６１ｇ／ｋｇＤＭ），较
低的ｐＨ（４．２０～３．９４）和氨态氮／总氮（５１．３２～３９３．３９ｇ／ｋｇＴＮ），说明所有处理均具有良好的发酵品质，这可能
是由于７０％苇状羊茅和３０％箭薚豌豆混合后，青贮原料中含有较高的水溶性碳水化合物［１５，１６］，保证了乳酸菌发
酵所需的底物，这一点可以从对照组青贮结束后仍有少量的残留水溶性碳水化合物存在得到证实，也说明了
７０％苇状羊茅和３０％箭薚豌豆混合无任何添加剂处理的条件下也能达到较好的发酵品质，在生产实际中是可行
的。
酶制剂添加与对照组比较，青贮２４ｄ后尽管提高了乙酸含量，但显著（犘＜０．０５）提高了乳酸和水溶性碳水化
合物含量，显著（犘＜０．０５）降低了ｐＨ值，说明酶制剂添加一定程度上改善了混合青贮的发酵品质，这是由于酶
制剂中含有纤维素、半纤维素酶，能将青贮原料中结构性碳水化合物降解为水溶性碳水化合物，为乳酸菌提供更
多的发酵底物，促进乳酸发酵，提高了发酵品质，Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｏ等［１７］也得到了类似结果。而乙酸含量的增加是由于
青贮过程中水溶性碳水化合物含量较充足时，乳酸生成以异型乳酸发酵为主，而异型乳酸发酵在产生一分子乳酸
的同时，产生一分子乙酸。本试验中酶添加组，在酶的作用下，部分结构性碳水化合物降解为水溶性碳水化合物，
造成水溶性碳水化合物的短暂积累，从而导致异型乳酸发酵，因此酶添加组（单独和组合添加）乙酸含量较高。
乳酸菌制剂添加组干物质含量始终显著（犘＜０．０５）高于对照和酶添加组，这是由于添加了乳酸菌制剂使乳
９８１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
酸菌在青贮前期迅速占发酵主导地位，使整个青贮环境迅速酸化，从而抑制了其他有害微生物的活性，减少了干
物质的损失［１８］。与对照组相比，整个青贮过程中乳酸菌制剂添加组乳酸含量有高于对照组趋势但差异不显著
（犘＞０．０５），这可能是乳酸菌制剂添加虽然增加了乳酸菌数量，但青贮材料中水溶性碳水化合物含量有限，不能
为额外增加的乳酸菌提供足够的发酵底物所致，这与Ｓｅａｌｅ［１９］研究一致，Ｓｅａｌｅ［１９］曾报道，对含糖量不是十分充足
的青贮材料接种乳酸菌，并不能有效地改善青贮发酵品质。乳酸菌制剂添加组与其他各组相比，显示最低的乙酸
含量（犘＜０．０５）和最高的乳酸／乙酸，这是由于乳酸菌制剂微生物成分主要以同型乳酸菌为主，同型乳酸菌将一
分子六碳糖转化为两分子乳酸，没有乙酸产生，因此导致乳酸菌制剂添加组乙酸含量低于其他各组，而乳酸／乙酸
高于其他各组。
酶和乳酸菌制剂组合添加组显示最低的ｐＨ值、氨态氮／总氮和最高的乳酸及水溶性碳水化合物含量，未检
测到丁酸与丙酸含量，发酵品质好的青贮饲料一般丁酸含量小于１０ｇ／ｋｇＤＭ［２０］，氨态氮／总氮值低于１００ｇ／ｋｇ
ＴＮ［２１］，这说明酶和乳酸菌制剂组合添加最大地改善了混合青贮的发酵品质，这可能是由于酶和乳酸菌组合添
加，产生叠加效应所致［８］。一方面酶制剂可将结构性碳水化合物降解为可供乳酸菌利用的水溶性碳水化合物，为
乳酸菌提供额外的发酵底物，另一方面乳酸菌制剂的添加可增加同质乳酸菌的数量，使其在青贮过程中可以充分
利用酶制剂的水解产物，迅速生长繁殖产生大量乳酸，快速降低ｐＨ值，有效地抑制了青贮早期好氧微生物的活
性，减少了蛋白质和氨基酸的分解以及植物蛋白酶对蛋白质的降解。
综上所述，虽然各添加处理组不同程度地改善了混合青贮的发酵品质，但酶和乳酸菌组合添加效果最为显
著。
参考文献：
［１］　玉柱，贾玉山．牧草饲料加工与贮藏［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，２０１０．
［２］　ＭｃＤｏｎａｌｄＰ，ＨｅｎｄｅｒｓｏｎＡＲ，ＨｅｒｏｎＳＪＥ．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＳｉｌａｇｅ（２ｔｈｅｄ）［Ｍ］．Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ：ＣａｍｂｒｉａｎＰｒｉｎｔｅｒｓＬｔｄ，
１９９１．
［３］　ＸｉｎｇＬ，ＣｈｅｎＬＪ，ＨａｎＬＪ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆａｎｉｎｏｃｕｌａｎｔａｎｄｅｎｚｙｍｅｓｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｓｏｒｇｈｕｍｓｔｒａｗｓｉｌａ
ｇｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，１００（１）：４８８４９１．
［４］　ＦｉｌｙａＩ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉａｎｄｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｏｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｅｒｏｂｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｒｕｍｉｎａｌｄｅ
ｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙｏｆｌｏｗｄｒｙｍａｔｔｅｒｃｏｒｎａｎｄｓｏｒｇｈｕｍｓｉｌａｇｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２００３，８６（１１）：３５７５３５８１．
［５］　吕文龙，刁其玉，闫贵龙．布氏乳杆菌对青玉米秸青贮发酵品质和有氧稳定性的影响［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（４）：１４３１４８．
［６］　ＥｕｎＪＳ，ＢｅａｕｃｈｅｍｉｎＫＡ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｅｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｌｆａｌｆａｈａｙａｎｄｃｏｒｎｓｉｌａｇｅ［Ｊ］．
ＡｎｉｍａｌＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，１４５（１４）：５３６７．
［７］　贾燕霞，玉柱，邵涛，等．添加酶制剂对象草青贮发酵品质的影响［Ｊ］．草地学报，２００９，１７：１２１１２４．
［８］　ＣｈｅｎＪ，ＳｔｏｋｅｓＭＲ，ＷａｌａｃｅＣＲ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｉｎｏｃｕｌａｎｔｓｙｓｔｅｍｓｏｎｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｈａｙｃｒｏｐａｎｄ
ｃｏｒｎｓｉｌａｇｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９４，７７（２）：５０１５１２．
［９］　ＢａｒｋｅｒＳＢ，ＳｕｍｍｅｒｓｏｎＷ Ｈ．Ｔｈｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｔｅｒｉａｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９４１，１３８：５３５５５４．
［１０］　ＯｗｅｎｓＶＮ，ＡｌｂｒｅｃｈｔＫＡ，ＭｕｃｋＲＥ．Ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｕｎｗｉｌｔｅｄｒｅｄｃｌｏｖｅｒａｎｄａｌｆａｌｆａ
ｓｉｌａｇｅｈａｒｖｅｓｔｅｄａｔｖａｒｉｏｕｓｔｉｍｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄａｙ［Ｊ］．ＧｒａｓｓａｎｄＦｏｒａｇｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，５７（４）：３２９３４１．
［１１］　ＷｅａｔｈｅｒＭ Ｗ．Ｐｈｅｎｏｌｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｏｆａｍｍｏｎｉａ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６７，３９：９７１９７４．
［１２］　ＡＯＡＣ．ＯｆｆｉｃｉａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆＡｎａｌｙｓｉｓ（１４ｔｈｅｄ）［Ｍ］．Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ：ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＯｆｆｉｃｉａｌａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｓＡｒｌｉｎｇ
ｔｏｎ，１９８４．
［１３］　ＳｈａｏＴ，ＺｈａｎｇＺＸ，ＳｈｉｍｏｊｏＭ，犲狋犪犾．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｉｔａｌｉａｎｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
Ｌａｍ．）ａｎｄｇｕｉｎｅａｇｒａｓｓ（犘犪狀犻犮狌犿犿犪狓犻犿狌犿Ｊａｃｑ．）ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｅｎｓｉｌｉｎｇ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉ
ｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，１８（１２）：１７２７１７３４．
［１４］　ＳＡＳ．ＳＡＳ／ＳＴＡＴＵｓｅｒ’ｓＧｕｉｄｅ：Ｖｅｒｓｉｏｎ６．４ｔｈｅｄ．ｅｄ．［Ｍ］．Ｃａｒｙ，ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ：ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎｃ，１９８４．
［１５］　蒋慧，张玲，马春晖，等．枯黄期骆驼刺与稻草混贮对青贮饲料品质的影响［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（２）：１０９１１６．
０９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
［１６］　王林，孙启忠，张慧杰．苜蓿与玉米混贮质量研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（４）：２０２２０９．
［１７］　ＣｏｌｏｍｂａｔｔｏＤ，ＭｏｕｌｄＦＬ，ＢｈａｔＭＫ，犲狋犪犾．Ｉｎｖｉｔｒｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓａｓａｄｄｉｔｉｖｅｓｆｏｒｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊Ｌ．）
ｓｉｌａｇｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｓｉｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｅｓｏｕｒｃｅａｎｄａｄｄｉｔｉｏｎｌｅｖｅｌ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１１
（１４）：１１１１２８．
［１８］　ＳｈａｏＴ，ＺｈａｎｇＬ，ＳｈｉｍｏｊｏＭ，犲狋犪犾．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｉｔａｌｉａｎｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿 Ｌａｍ．）ｓｉｌａｇｅｓｔｒｅａｔｅｄ
ｗｉｔｈｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｓｏｒｂｉｃａｃｉｄａｎｄｐｒｅｆｅｒｍｅｎｔｅｄｊｕｉｃｅｓ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，
２００７，２０：１６９９１７０４．
［１９］　ＳｅａｌｅＤＲ．ＢａｃｔｅｒｉａａｎｄＥｎｚｙｍｅｓａｓＰｒｏｄｕｃｔｓｔｏＩｍｐｒｏｖｅＳｉｌａｇｅＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ［Ｍ］．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＳｉｌａｇｅＣｈａｌｃｏｍｂｅＰｕｂｌ．
ｍａｒｌｏｗ．ｐｐ．１９８７：１４７１７１．
［２０］　ＮｉｌｓｓｏｎＧ，ＮｉｌｓｓｏｎＰＥ．Ｓｉｌａｇｅｓｔｕｄｉｅｓ．ＩＶ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｓｏｍｅｆｏｄｄｅｒｐｌａｎｔｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｍａｔｕｒｉ
ｔｙ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５６，２４（４）：４１２４２２．
［２１］　ＳｈａｏＴ，ＯｈｂａＮ，ＳｈｉｍｏｊｏＭ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄｏｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｑｕａｌｉｔｙｏｆｇｕｉｎｅａｇｒａｓｓ
（犘犪狀犻犮狌犿犿犪狓犻犿狌犿ｊａｃｑ．）ｓｉｌａｇｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，４７（２）：３５１３５８．
犈犳犳犲犮狋狅犳犪犱犱犻狀犵犮狅犲狀狕狔犿犲犪狀犱犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪狅狀犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狇狌犪犾犻狋狔狅犳犿犻狓犲犱狊犻犾犪犵犲狊狅犳
狋犪犾犳犲狊犮狌犲（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）犪狀犱犮狅犿犿狅狀狏犲狋犮犺（犞犻犮犻犪狊犪狋犻狏犪）犻狀狋犻犫犲狋
ＷＡＮＧＱｉ１，ＹＵＣｈｅｎｇｑｕｎ２，ＬＩＺｈｉｈｕａ１，ＺＨＡＯＱｉｎｇｊｉｅ１，ＭａｓａｔａｋａＳｈｉｍｏｊｏ３，ＳＨＡＯＴａｏ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｓｉｌｉｎｇａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＧｒａｓｓ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｏｇｒａｐｈｉｃＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＮａｔｕｒａｌ
ＲｅｓｏｕｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
ＡｎｉｍａｌＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＭａｒｉｎｅ
ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＫｙｕｓｈｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｆｕｋｕｏｋａ８１２８５８１，Ｊａｐａｎ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｄｄｉｎｇｃｏｅｎｚｙｍｅ，ＬＡＢａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｎ
ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｉｅｓａｎｄｒｅｓｉｄｕａｌｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｏｆｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅｓｏｆｃｏｍｍｏｎｖｅｔｃｈａｎｄｔａｌ
ｆｅｓｃｕｅｄｕｒｉｎｇｅｎｓｉｌｉｎｇ．Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ），ｃｏｅｎｚｙｍｅ（Ｅ），ＬＡＢ，ｃｏｅｎｚｙｍｅ＋ＬＡＢ（Ｅ
＋ＬＡＢ），ｔｈｅｓｅｓｉｌｏｓｗｅｒｅｏｐｅｎｅｄｏｎ７，２４ａｎｄ６０ｄａｙｓａｆｔｅｒｅｎｓｉｌｉｎｇａｎｄｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ．
Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｉｌａｇｅ，ａｄｄｉｎｇｏｆＥａｎｄＬＡＢｗｅｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆ
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ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙ
１９１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
添加乳酸菌和菠萝皮对柱花草青贮品质的影响
申成利，陈明霞，李国栋，张建国
（华南农业大学农学院草业科学系，广东 广州５１０６４２）
摘要：柱花草是热带、亚热带的优质豆科牧草，蛋白含量高、营养品质好，为促进柱花草的加工利用，本试验研究了
添加不同乳酸菌和菠萝皮对其青贮发酵品质和有氧稳定性的影响。青贮处理为ＣＫ（对照）、ＬＱ（青贮宝）、ＬＦ（发酵
乳杆菌）、ＬＰ（植物乳杆菌）、ＬＳ（鼠李糖乳杆菌）、Ｂ（２０％菠萝皮）、ＢＬＱ（Ｂ＋ＬＱ）、ＢＬＦ（Ｂ＋ＬＦ）、ＢＬＰ（Ｂ＋ＬＰ）、ＢＬＳ
（Ｂ＋ＬＳ）。添加处理后青贮６０ｄ进行分析。结果表明，柱花草含有较少的可溶性碳水化合物和乳酸菌，自然青贮
其ｐＨ超过５．０，发酵品质差；所有添加物都显著降低ｐＨ、增加乳酸含量（犘＜０．０５），明显改善了柱花草青贮料的发
酵品质。单独添加菠萝皮的丁酸和ＮＨ３Ｎ含量显著高于所有单独添加乳酸菌（犘＜０．０５），ｐＨ与ＬＰ以外的其他３
种乳酸菌差异不显著（犘＞０．０５）。除ＬＰ的乙酸含量较高，丁酸含量较低外，４种乳酸菌对其他各个发酵指标的影
响没有显著差异（犘＞０．０５）。本试验所用４种乳酸菌与菠萝皮混合添加，都进一步改善了柱花草青贮料的发酵品
质，特别是ＢＬＰ的青贮效果最佳，其ｐＨ值、乙酸和ＮＨ３Ｎ含量低，乳酸含量及乳酸与乙酸比高。青贮袋开封后，
包括对照在内的所有青贮料的有氧稳定性均较佳。
关键词：乳酸菌；柱花草；菠萝皮；青贮；发酵品质
中图分类号：Ｓ８１６．５＋３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１９２０６
　　柱花草属（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊）牧草是世界上热带亚热带地区最重要的豆科牧草，广泛用于青饲料、草粉生产、放
牧、水土保持、果园覆盖和绿肥作物等［１］。柱花草属牧草约有５０个种，在世界热带豆科牧草生产中占有重要地
位。它的大部分品种原产南美洲、中美洲和加勒比海地区，喜热带潮湿气候，适合北纬２３℃以南、年均温１９～
２５℃、年降水量１０００ｍｍ左右的地区种植［２］。我国于１９６２年首次从马来西亚引种柱花草到海南岛，目前，柱花
草在海南、广东、广西、福建、云南、四川、贵州、重庆等省（区）推广种植面积已超过２０多万ｈｍ２，已成为我国南方
热带草业的当家草种，形成了“北有苜蓿草，南有柱花草”的草业发展新格局，促进了我国热带草业和畜牧业的发
展［３］。
柱花草是豆科柱花草属多年生草本植物，其茎叶繁茂，根系发达，生物产量大，营养丰富，每ｋｇ干物质含粗
蛋白１５６～２４３ｇ，是稻谷、玉米的２～３倍；每公顷产总能１０９．７５ＧＪ，比玉米、稻谷高６５％～６９％，是重要的蛋白
质和能量饲料来源［４，５］。在饲用柱花草的过程中，发现柱花草对动物的生长发育和繁殖等有明显的促进作用，很
多种畜禽场已把柱花草粉作为添加剂来使用，市场潜力巨大。但由于华南地区阴雨天多，给柱花草干草（粉）的加
工带来了不少的难度，造成有市无货局面。因此，应重视与当地气候特点相适应的加工贮藏方法，以解决“季节不
平衡”和“地区不平衡”矛盾，提高种草的经济效益［６］。柱花草因生长前期叶上的茸毛及叶尖对家畜口腔有刺激
性，青饲适口性较差，对其进行晒干处理，适口性虽有所提高，但营养物质损失增大，而且其大部分营养生长期处
于华南地区的雨季，将其加工成干草较难。有报道指出，加工草颗粒与草粉是柱花草的有效利用途径［７］，但成本
过高，不利推广；也有报道指出，青贮是华南地区柱花草利用的新途径［８］，但因柱花草的可溶性糖含量低，缓冲能
高，较难青贮。菠萝皮是菠萝罐头生产的下脚料（约占原果的６０％），长期以来，被认为是农产品废弃物而丢弃或
填埋，导致环境污染。菠萝皮的可溶性糖含量较高，但国内对菠萝皮的深加工及利用较少［９］，陈明霞和张建国［１０］
的研究结果表明添加菠萝皮对饲料稻发酵品质的改善有较好的效果。因此，本试验研究了添加乳酸菌和菠萝皮
（Ｂ）对柱花草青贮发酵品质和有氧稳定性的影响，为柱花草的青贮加工提供理论依据。
１９２－１９７
２０１２年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１１０７０６；改回日期：２０１１０９２６
基金项目：十二五国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ１８Ｂ０２）和现代农业产业技术体系建设专向资金资助。
作者简介：申成利（１９８６），女，河南新乡人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｅｎｃｈｅｎｇｌｉ２００６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｇ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　试验材料
２０１０年１０月１８日收割处于初花期的柱花草，距地面８～１０ｃｍ全株收割。收割后带回实验室，切短至１～２
ｃｍ，混合均匀，留０．５ｋｇ用于鲜样分析，剩余材料分别进行青贮处理。菠萝皮是从水果市场收集的新丢弃物，切
成小块备用。
乳酸菌添加剂为青贮宝（ＬＱ，宝来利来生物工程有限责任公司），乳酸菌ＬＦ（发酵乳杆菌）、乳酸菌ＬＰ（植物
乳杆菌）和乳酸菌ＬＳ（鼠李糖乳杆菌）。ＬＦ、ＬＰ和ＬＳ为华南农业大学农学院草产品加工实验室分离菌株。
１．２　青贮处理
本试验设菠萝皮和乳酸菌两因素。菠萝皮分为无添加和添加，乳酸菌为无添加、ＬＱ、ＬＦ、ＬＰ、ＬＳ，共１０个处
理，即：ＣＫ、ＬＱ、ＬＦ、ＬＰ、ＬＳ，Ｂ（２０％菠萝皮），ＢＬＱ（Ｂ＋ＬＱ）、ＢＬＦ（Ｂ＋ＬＦ）、ＢＬＰ（Ｂ＋ＬＰ）、ＢＬＳ（Ｂ＋ＬＳ）。每个
处理３个重复。
１．３　测定方法
１．３．１　青贮饲料的调制　各种乳酸菌的添加量为１０５ｃｆｕ／ｇＦＭ（鲜重），菠萝皮的添加量为２０％，每个处理３
袋，每袋约２００ｇ。处理后的材料装入３０ｃｍ×２０ｃｍ的聚乙烯青贮袋，用真空密封机（ＳＩＮＢＯＶａｃｕｕｍＳｅａｌｅｒ，
ＨｏｎｇＴａｉＨｏｍｅＥｌｅｃｔｒｉｃａｌＡｐｐｌｉａｎｃｅＣｏ．Ｌｔｄ．）抽气、密封，置于室温贮藏６０ｄ。
１．３．２　材料营养成分及微生物分析　干物质（ＤＭ）含量采用７０℃干燥法测定，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定
（定氮仪 ＫＤＮ１０３Ｆ，上海纤检仪器有限公司），粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量在范氏法（ＶａｎＳｏｅｓｔ）
的基础上使用改进的滤袋分析法（ＡＮＫＯＭＡ２００ｉ，北京）测定［１１］，粗脂肪含量采用残余法测定（ＳＬＦ０６，杭州托
普仪器有限公司），粗灰分含量采用灼烧法测定［１２］。可溶性碳水化合物（ｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ＷＳＣ）含量
采用蒽酮硫酸法测定［１３］，氨态氮（ＮＨ３Ｎ）含量用凯氏定氮仪直接蒸馏测定，缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法
测定［１４］，乳酸菌、细菌和酵母菌数量分别采用ＭＲＳ（ｄｅＭａｎＲｏｇｏｓａＳｈａｒｐｅ）琼脂培养基、营养琼脂培养基（ｎｕｔｒｉ
ｅｎｔａｇｅｒ，广东环凯微生物有限公司）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，广东环凯微生物有限公
司）计数［１５］。乳酸菌用厌氧箱（ＹＱＸⅡ型，上海新苗医疗器械制造有限公司），３７℃培养２～３ｄ；细菌和酵母菌用
生化培养箱３０℃培养２～４ｄ。
１．３．３　发酵品质分析　青贮袋开封后，取２０ｇ混匀的青贮料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入８０ｍＬ蒸馏水，在
４℃下浸泡１８ｈ后过滤，用ｐＨ计（ＰＨＳ３Ｂ，上海鹏顺科学仪器有限公司）测定浸提液ｐＨ值［１６］。有机酸含量采
用岛津ＬＣ２０ＡＴ型高效液相色谱仪测定［１７］，色谱条件：色谱柱（ＫＣ８１１），流动相为３ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＨＣｌＯ４ 液，流
速１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温６０℃，检测波长２１０ｎｍ。
１．３．４　有氧稳定性分析　青贮袋开封后，无菌操作混匀材料，然后取出一部分进行发酵品质分析，剩下的材料不
封口放置于室内，分别有氧放置２，４，６ｄ后，取袋中已混匀样品２０ｇ，测定ｐＨ值。ｐＨ值上升幅度越小，有氧稳
定性则越好，反之则较差。
１．４　统计方法
采用Ｅｘｃｅｌ和ＳＰＳＳ１０软件对试验数据进行统计分析。其中，乳酸菌与含糖物质的添加使用双因素方差分
析。有氧稳定性测定的数据采用Ｅｘｃｅｌ处理。
２　结果与分析
２．１　青贮前柱花草与菠萝皮特性
柱花草的乳酸菌少于１０５ｃｆｕ／ｇＦＭ，好气性细菌和酵母菌数较多，缓冲能（３４０ｍＥ／ｋｇＤＭ）较高，ＷＳＣ含量
（３．９１％ＤＭ）较低，这些都不利于青贮饲料的发酵。干物质含量为３４．１０％，水分含量适中（表１）。作为本试验
添加物之一的菠萝皮，其 ＷＳＣ含量较高（４２．８３％ＤＭ）（表１），可以弥补柱花草青贮材料 ＷＳＣ较低的缺陷，可为
乳酸菌提供充足的发酵底物。
２．２　添加物对青贮发酵品质的影响
单 独添加乳酸菌或菠萝皮对柱花草青贮料的ｐＨ、乳酸含量、ＮＨ３Ｎ含量和乳酸乙酸比都有显著影响
３９１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
（犘＜０．０５），乳酸菌和菠萝皮的互作对乙酸之外的指
标都达到了极显著 （犘＜０．０１）。乳酸菌或菠萝皮单独
添加对丙酸含量影响不显著，而它们互作显著（犘＜
０．０５）。乳酸菌添加显著降低丁酸含量 （犘＜０．０５），除
ＬＰ外，单独添加菌对乙酸含量影响不显著（犘＞
０．０５），菠萝皮则正好相反（表２）。与对照相比，单独
添加菌虽然显著降低了丁酸含量，但未能完全抑制丁
酸发酵，而乳酸菌与菠萝皮混合添加很少或无丁酸产
生。所有处理中，对照的ｐＨ值（５．２６）和ＮＨ３Ｎ含量
（１８．２１％）最高，乳酸含量最低（１．２６％），所有添加处
理都显著降低了ｐＨ值和ＮＨ３Ｎ含量，提高了乳酸含
量，特别是乳酸菌和菠萝皮的混合添加。除ＢＬＳ外，
混合添加的ｐＨ都显著低于乳酸菌或菠萝皮单独添加
（犘＜０．０５），而且低于４．２，达到了良好的青贮效果。
各种乳酸菌和菠萝皮单独添加的青贮料，它们的
乳酸含量、丙酸含量和乳酸乙酸比没有显著差异（犘＞
０．０５），但添加乳酸菌的丁酸含量和ＮＨ３Ｎ含量显著
低于Ｂ处理组。除ＬＰ外，单独添加乳酸菌的ｐＨ与Ｂ
添加没有显著差异。ＬＰ的乙酸含量显著高于ＬＦ、丁
酸含量显著低于ＬＱ和ＬＦ（犘＜０．０５）。结果表明，添
加乳酸菌和菠萝皮都可明显改善柱花草青贮料的发酵
品质，但乳酸菌，特别是ＬＰ的效果优于菠萝皮，而两
者结合效果更佳。
表１　青贮前柱花草和菠萝皮的特性
犜犪犫犾犲１　犆犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犪狀犱
狆犻狀犲犪狆狆犾犲狉犲狊犻犱狌犲犫犲犳狅狉犲犲狀狊犻犾犻狀犵
项目
Ｉｔｅｍ
柱花草
犛狋狔犾狅
狊犪狀狋犺犲狊
菠萝皮
Ｐｉｎｅａｐｐｌｅ
ｒｅｓｉｄｕｅ
干物质 Ｄｒｙｍａｔｔｅｒ（％ＦＭ） ３４．１０ １４．５０
粗蛋白Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ（％ ＤＭ） １１．３９ ６．４８
粗脂肪Ｅｔｈｅｒｅｘｔｒａｃｔ（％ ＤＭ） ２．７６ １．３０
粗纤维Ｃｒｕｄｅｆｉｂｅｒ（％ ＤＭ） ４５．４０ １２．１８
无氮浸出物 Ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔ（％ ＤＭ） ３６．００ ７６．４８
中性洗涤纤维 Ｎｅｕｔｒａｌｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ（％ ＤＭ） ７１．３４ ３７．７８
酸性洗涤纤维 Ａｃｉｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ（％ ＤＭ） ５８．８３ １８．１３
粗灰分Ｃｒｕｄｅａｓｈ（％ ＤＭ） ４．４４ ３．５７
可溶性碳水化合物 Ｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ
（％ ＤＭ）
３．９１ ４２．８３
ｐＨ ５．４６ ４．０４
氨态氮 ＮＨ３Ｎ（％ ＴＮ） １．６９ ４．６６
缓冲能Ｂｕｆｆｅｒｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ（ｍＥ／ｋｇＤＭ） ３４０ １５４５
乳酸菌Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ（Ｌｇｃｆｕ／ｇＦＭ） ４．５４ ４．６８
好气性细菌 Ａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉａ（Ｌｇｃｆｕ／ｇＦＭ） ６．７６ ５．１４
酵母菌 Ｙｅａｓｔｓ（Ｌｇｃｆｕ／ｇＦＭ） ５．３５ ４．６４
　ＴＮ：总氮含量 Ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＦＭ：鲜物质 Ｆｒｅｓｈｍａｔｔｅｒ；Ｌｇ：菌数取
以１０为底的对数Ｄｅｎａｒｙｌｏｇａｒｉｔｈｍｏｆｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ．
表２　添加物对柱花草青贮发酵品质的影响
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犪犱犱犻狋犻狏犲狊狅狀狋犺犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狇狌犪犾犻狋狔狅犳犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊狊犻犾犪犵犲
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｐＨ 乳酸Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ
（％ ＤＭ）
乙酸Ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ
（％ ＤＭ）
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ
（％ ＤＭ）
丁酸Ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ
（％ ＤＭ）
乳酸／乙酸
Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ
ＮＨ３Ｎ
（％ ＴＮ）
ＣＫ ５．２６ａ １．２６ｄ １．９９ｄｅ １．５５ａｂ １．１８ａ ０．６４ｆ １８．２１ａ
ＬＱ ４．５３ｂｃ ３．９３ｃ ２．４６ａｂｃｄ １．５１ａｂ ０．４１ｂ １．６２ｃｄｅ ８．４５ｃ
ＬＰ ４．４４ｃｄ ４．０１ｃ ２．８０ａｂｃ １．４２ａｂｃｄ ０．１１ｃｄ １．４３ｄｅ ７．３２ｃｄ
ＬＳ ４．５５ｂｃ ３．６０ｃ ２．１４ｃｄｅ １．４９ａｂｃ ０．３５ｂｃ １．６９ｃｄｅ ８．４５ｃ
ＬＦ ４．６６ｂｃ ２．８２ｃ １．９８ｄｅ １．６８ａ ０．４５ｂ １．５１ｄｅ ８．４５ｃ
Ｂ ４．７４ｂ ３．２５ｃ ３．１１ａ １．５８ａｂ １．２７ａ １．１０ｅ １３．１４ｂ
ＢＱ ３．９９ｅｆ ６．１６ａｂ １．７２ｅ １．０４ｅ ０．００ｄ ３．６０ｂ ６．２０ｃｄ
ＢＬＰ ３．９１ｆ ７．０２ａ １．６３ｅ １．１４ｃｄｅ ０．００ｄ ４．３３ａ ６．０１ｄ
ＢＬＳ ４．１９ｄｅ ５．３４ａｂ ２．３０ｂｃｄｅ １．２１ｃｄｅ ０．００ｄ ２．３２ｃ ６．７６ｄ
ＢＬＦ ４．１２ｅｆ ５．４７ａｂ ２．８５ａｂ １．３３ｃｄｅ ０．１７ｃｄ １．９３ｃｄ ６．７６ｃｄ
标准误ＳＥＭ ０．０８ ０．４１ ０．２１ ０．０９ ０．０７ ０．２２ ０．７０
ＬＡＢ   ＮＳ ＮＳ   
Ｂ    ＮＳ ＮＳ  
ＬＡＢ×Ｂ   ＮＳ    
　注：表中同列不同字母表示在犘＜０．０５水平差异显著。：０．０５水平作用显著；：０．０１水平作用显著；ＬＡＢ：乳酸菌；Ｂ：菠萝皮。
　Ｎｏｔｅ：Ｍｅａｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｔｈｅ０．０５ｌｅｖｅｌ．ａｎｄ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｔ犘＜０．０５ａｎｄ犘＜
０．０１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＬＡＢ：Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ；Ｂ：Ｐｉｎｅａｐｐｌｅｒｅｓｉｄｕｅ．
４９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４