全 文 ：林业科学研究摇 圆园员源袁圆苑渊圆冤院圆员怨 圆圆源云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员源冤园圆鄄园圆员怨鄄园远
淡紫拟青霉 栽鄄阅晕粤插入突变体的表型分析
马建伟袁 王曦茁鄢袁 汪来发袁 王摇 源袁 苟大平袁 王艳菊
渊中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所袁国家林业局森林保护学重点实验室 北京摇 员园园园怨员冤
收稿日期院 圆园员猿鄄员圆鄄圆苑
基金项目院 国家自然科学基金项目渊晕燥援 猿员员园园源苑苑冤
作者简介院 马建伟渊员怨愿苑要冤袁男袁在读硕士袁主要从事森林病理学及线虫生物防治的研究遥 耘鄄皂葬蚤造 院 皂葬躁蚤葬灶憎藻蚤枣造赠岳 员圆远援 糟燥皂
鄢 通讯作者院主要从事淡紫拟青霉以及线虫生物防治的研究遥 耘鄄皂葬蚤造 院 憎葬灶早曾扎岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶
摘要院研究淡紫拟青霉 栽鄄阅晕粤插入突变体袁鉴定突变体的表型特征袁为淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关的基因
克隆奠定基础遥 孕悦砸检测筛选的 员源 株 栽鄄阅晕粤插入突变体袁观察和测定菌落形态袁菌落生长速率袁产孢量袁孢子萌发
率和菌丝干质量等生物学性状袁并比较突变体致病力遥 结果表明突变体均含有 遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶 基因序列袁栽鄄阅晕粤 已整
合进入野生型菌株 圆园鄄苑 的基因组中遥 通过与野生型菌株对比袁发现突变体菌落形态发生了不同程度的改变遥 菌落
生长速率明显增大的菌株占全部菌株的 愿缘郾 苑员豫 袁只有 月晕鄄员员 菌株的菌落生长速率降低遥 产孢量显著变大的菌株
有 月晕鄄员员 和 月晕鄄员圆袁为菌株总数的 员源郾 圆怨豫 遥 孢子萌发率发生改变的菌株占 苑愿郾 缘苑豫 遥 菌丝干质量发生明显增大和
减少的菌株都占全部突变体的 圆员郾 源猿豫 遥 筛选获得了 员 株致病力增强的突变体 月晕鄄员员 和 员员 株致病力显著降低的突
变体遥
关键词院淡紫拟青霉曰插入突变曰生物学性状曰致病力
中图分类号院杂苑远怨 文献标识码院粤
孕澡藻灶燥贼赠责藻泽 粤灶葬造赠泽蚤泽 枣燥则 栽鄄阅晕粤 陨灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 酝怎贼葬灶贼泽 燥枣 孕葬藻糟蚤造燥皂赠糟藻泽 造蚤造葬糟蚤灶怎泽
酝粤 允蚤葬灶鄄憎藻蚤袁 宰粤晕郧 载蚤鄄扎澡怎燥袁 宰粤晕郧 蕴葬蚤鄄枣葬袁 宰粤晕郧 再怎葬灶袁 郧韵哉 阅葬鄄责蚤灶早 袁 宰粤晕郧 再葬灶鄄躁怎
渊砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼 耘糟燥造燥早赠袁 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼 葬灶凿 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠曰栽澡藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 云燥则藻泽贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁
杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽澡藻 栽鄄阅晕粤 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 皂怎贼葬灶贼泽 燥枣 孕葬藻糟蚤造燥皂赠糟藻泽 造蚤造葬糟蚤灶怎泽 憎藻则藻 泽贼怎凿蚤藻凿 葬灶凿 贼澡藻 责澡藻灶燥贼赠责藻泽 憎藻则藻 蚤凿藻灶贼蚤鄄
枣蚤藻凿援 陨贼 皂葬赠 糟燥灶贼则蚤遭怎贼藻 贼燥 怎灶凿藻则泽贼葬灶凿蚤灶早 贼澡藻 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 孕援 造蚤造葬糟蚤灶怎泽 葬灶凿 贼澡藻 糟造燥灶藻 早藻灶藻泽 则藻造葬贼藻凿 贼燥
责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠援 粤造造 燥枣 员源 皂怎贼葬灶贼泽 早藻灶藻则葬贼藻凿 遭赠 栽鄄阅晕粤 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 憎藻则藻 贼藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 孕悦砸 枣燥则 贼澡藻蚤则 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 泽藻择怎藻灶糟藻援
栽澡藻 皂燥则责澡燥造燥早赠袁 糟燥造燥灶赠 早则燥憎蚤灶早 则葬贼藻袁 泽责燥则藻 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁 糟燥灶蚤凿蚤葬 早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 则葬贼藻袁 凿则赠 憎藻蚤早澡贼 燥枣 皂赠糟藻造蚤怎皂 葬灶凿 责葬贼澡鄄
燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 葬早葬蚤灶泽贼 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥灶早灶蚤贼葬 燥枣 责澡藻灶燥贼赠责藻泽 燥枣 皂怎贼葬灶贼泽 憎藻则藻 葬灶葬造赠扎藻凿 遭赠 糟燥皂责葬则蚤灶早 憎蚤贼澡 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶
圆园鄄苑援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 早藻灶燥皂藻泽 燥枣 贼澡藻泽藻 皂怎贼葬灶贼泽 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶 早藻灶藻 葬灶凿
栽鄄阅晕粤 澡葬凿 遭藻藻灶 蚤灶贼藻早则葬贼藻凿 蚤灶贼燥 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 早藻灶燥皂藻 燥枣 孕援 造蚤造葬糟蚤灶怎泽援 悦燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶 圆园鄄苑袁 贼澡藻 皂燥则鄄
责澡燥造燥早蚤藻泽 燥枣 贼澡藻泽藻 糟燥造燥灶蚤藻泽 糟澡葬灶早藻凿 葬贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 凿藻早则藻藻泽援 栽澡藻 糟燥造燥灶赠 早则燥憎蚤灶早 则葬贼藻 燥枣 愿缘郾 苑员豫 泽贼则葬蚤灶泽 泽责藻藻凿藻凿 怎责
燥遭增蚤燥怎泽造赠袁 燥灶造赠 贼澡藻 泽贼则葬蚤灶 月晕鄄员员 泽造燥憎藻凿 凿燥憎灶 蚤贼泽 糟燥造燥灶赠 早则燥憎蚤灶早 则葬贼藻 凿蚤泽贼蚤灶糟贼造赠援 栽澡藻 泽贼则葬蚤灶 月晕鄄员员 葬灶凿 月晕鄄员圆袁
葬糟糟燥怎灶贼蚤灶早 枣燥则 员源郾 圆怨豫 燥枣 贼澡藻 贼燥贼葬造袁 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 贼澡藻 泽责燥则藻 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶援 苑愿郾 缘苑豫 皂怎贼葬灶贼泽 糟澡葬灶早藻凿 贼澡藻蚤则 糟燥灶蚤凿蚤葬 早藻则皂蚤鄄
灶葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠援 月燥贼澡 贼澡藻 则葬贼藻泽 燥枣 皂怎贼葬灶贼泽 贼澡葬贼 凿则赠 憎藻蚤早澡贼 燥枣 皂赠糟藻造蚤怎皂 则藻凿怎糟藻凿 葬灶凿 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 憎藻则藻
圆员郾 源猿豫 援 韵灶藻 皂怎贼葬灶贼 憎蚤贼澡 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 憎葬泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿袁 葬灶凿 贼澡藻 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 燥枣 员员 皂怎贼葬灶贼泽
凿藻糟则藻葬泽藻凿 藻灶燥则皂燥怎泽造赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院 孕葬藻糟蚤造燥皂赠糟藻泽 造蚤造葬糟蚤灶怎泽曰蚤灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 皂怎贼葬早藻灶藻泽蚤泽曰遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽曰责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
根结线虫病是植物中一类重要的病害袁给全世
界的农林业生产带来了极大的威胁咱员暂 遥 化学防治由
于毒性残留给人类健康造成危害袁迫切需要高效生
防制剂来防治根结线虫渊酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 泽责责援 冤遥 而淡
紫拟青霉渊孕葬藻糟蚤造燥皂赠糟藻泽 造蚤造葬糟蚤灶怎泽冤是一种典型的土壤
习居菌袁是对植物线虫能起到重要生防效果的真
菌咱圆 原 缘暂 遥 淡紫拟青霉可以寄生线虫的卵尧幼虫以及
成虫袁并且强烈杀死 圆 龄幼虫咱远暂 遥 目前袁从基因水平
研究其生物学特性及致病机制已成为研究趋势遥 研
究并进一步分离克隆致病相关基因的重要方法之一
就是插入突变构建插入突变体库咱苑暂 遥
作为一种用于基因功能研究的高效随机转化技
术袁农杆菌介导的遗传转化技术渊粤栽酝栽冤已被广泛
用于植物和真菌的转化袁在生防菌的研究中也得到
了一些应用袁例如生防菌盾壳霉 悦燥灶蚤燥贼澡赠则蚤怎皂 皂蚤灶蚤鄄
贼葬灶泽咱愿袁怨暂 尧绿僵菌 酝藻贼葬则澡蚤扎蚤怎皂 葬灶蚤泽燥责造蚤葬藻咱员园暂 尧深绿木霉
栽则蚤糟澡燥凿藻则皂葬 葬贼则燥增蚤则蚤凿藻咱员员暂和拟康氏木霉 栽则蚤糟澡燥凿藻则皂葬
责泽藻怎凿燥噪燥灶蚤灶早蚤蚤咱员圆暂等都已成功进行了转化遥
淡紫拟青霉作为植物线虫的生防真菌袁目前对
淡紫拟青霉基因特别是致病基因信息了解较少袁而
粤栽酝栽的方法是研究未知基因结构和功能的重要反
向遗传策略咱员猿暂 袁利用 粤栽酝栽方法建立的淡紫拟青霉
栽鄄阅晕粤插入突变体的策略将会推动淡紫拟青霉基因
功能的研究遥 本研究从本实验室前期建立的淡紫拟
青霉 栽鄄阅晕粤突变体库中选取 员源 株突变体袁研究这
些突变体表型变异袁为进一步从分子水平明确淡紫
拟青霉与植物线虫互作机制奠定基础遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 供试菌株
野生型淡紫拟青霉 圆园鄄苑袁随机选取的 员源 株 栽鄄
阅晕粤插入突变体袁均由本实验室保存提供遥
员援 圆摇 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基渊孕阅粤冤袁配制方
法院马铃薯 圆园园 早窑蕴 原员袁葡萄糖 圆园 早窑蕴 原员袁琼脂 圆园
早窑蕴 原员袁员圆员益灭菌 圆园 皂蚤灶遥 马铃薯葡萄糖液体培养
基渊孕阅冤袁配制方法院马铃薯 圆园园 早窑蕴 原员袁葡萄糖 圆园
早窑蕴 原员袁员圆员益灭菌 圆园 皂蚤灶遥
员援 猿摇 供试的南方根结线虫渊酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬冤
南方根结线虫接种在中国林业科学研究院温室
番茄苗根部遥 番茄为感性品种野美粉 圆 号冶遥 番茄苗
长出 圆 片真叶后袁将南方根结线虫卵悬液用移液器
吸取 员 皂蕴渊虫卵约 圆园园园 粒冤袁接种在距番茄苗根部 猿
缘 糟皂处袁埋土覆盖袁常规管理遥 番茄苗生长 圆 猿
个月后袁剪下茎部袁分离根部的南方根结线虫虫卵遥
员援 源摇 突变体菌株遗传稳定性分析
将随机选取的 员源 株突变体接种到 孕阅粤 培养基
上袁圆缘益黑暗培养 苑 凿袁并连续转接继代 缘 代袁观察突
变体的菌落形态和生长状况是否改变以确定其遗传
稳定性遥
员援 缘摇 突变体菌株 孕悦砸检测
突变体和野生型 圆园鄄苑 菌株分别在 孕阅粤 培养基
上 圆缘益黑暗培养 员园 凿 后袁刮取菌丝袁采用 悦栽粤月 法
提取基因组 阅晕粤遥 根据 栽鄄阅晕粤 上的抗性筛选标记
基因 遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶咱员源暂设计引物遥 片段长度为 缘远员 遭责遥
引物为 允陨粤晕悦耘鄄云院缘忆鄄栽悦栽栽栽悦悦悦栽悦悦悦粤粤郧粤郧粤悦悦悦鄄
猿忆和 允陨粤晕悦耘鄄砸院缘忆鄄粤栽悦郧栽悦郧粤郧粤悦悦郧郧栽栽郧栽栽郧鄄猿忆遥
孕悦砸以基因组 阅晕粤为模板袁允陨粤晕悦耘鄄云 辕 允陨粤晕悦耘鄄砸为
引物进行 孕悦砸扩增遥 反应体系为 圆缘 滋蕴袁其中 员园 伊
孕悦砸 月怎枣枣藻则 圆郾 缘 滋蕴尧凿晕栽孕 酝蚤曾贼怎则藻 圆 滋蕴尧栽葬择 酶 园郾 圆缘
滋蕴尧引物 允陨粤晕悦耘鄄云 辕 允陨粤晕悦耘鄄砸 各 员 滋蕴尧模板 阅晕粤 员
滋蕴袁最后 凿凿匀圆韵 补足至 圆缘 滋蕴遥 孕悦砸 反应程序为怨源益 猿 皂蚤灶袁然后进入循环 怨源益 源缘 泽袁缘怨益 猿园 泽袁苑圆益
员 皂蚤灶袁循环 猿缘 次袁最后 苑圆益延伸 员园 皂蚤灶袁源益保存遥
员豫的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照遥
员援 远摇 突变体菌株生物学特征
突变体和野生型 圆园鄄苑 分别接种到 孕阅粤 培养基
上袁圆缘益黑暗培养 员园 凿袁用于后期的形态学观察尧产
孢量比较尧生长速率测定尧孢子萌发率和菌丝干质量
比较等试验袁各指标均设 猿 次重复遥
员援 远援 员摇 菌落形态学观察及比较摇 在上述 员源 种菌株
菌落边缘用打孔器打取直径 缘 皂皂 的菌饼袁接种于
孕阅粤平板上袁圆缘 益黑暗培养袁野生型 圆园鄄苑 作为对照遥
员缘 凿后观察并拍照遥
员援 远援 圆摇 菌株生长速率测定 摇 菌株培养同上遥 员圆 凿
后测量菌落直径遥 计算生长速率遥
员援 远援 猿摇 菌株产孢量测定摇 将淡紫拟青霉突变体菌
株和野生型 圆园鄄苑 分别接种于 孕阅粤平板上袁圆缘益黑暗
培养 员缘 凿遥 在菌落中央到边缘的中点打取 猿 个直径
缘 皂皂菌饼袁放入装有 源 皂蕴 灭过菌的 员译吐温 原 愿园
溶液的 员园 皂蕴小试管中袁漩涡振荡器振荡袁使孢子脱
落袁摇匀袁血球计数板计数遥 计算单位面积渊糟皂圆冤产
孢量遥
员援 远援 源摇 菌株孢子萌发率测定摇 将 孕阅粤 平板上培养
苑 凿的分生孢子用 员译吐温 原愿园 溶液洗下袁调整孢子
浓度到 员 伊 员园猿 个窑皂蕴 原员袁分别吸取 员园园 滋蕴 涂于
园圆圆
第 圆 期 马建伟等院淡紫拟青霉 栽鄄阅晕粤插入突变体的表型分析
孕阅粤平板上渊培养皿直径 怨援 园 糟皂冤袁圆缘益培养 猿 凿 后
统计孢子萌发数袁计算萌发率遥
员援 远援 缘摇 菌株菌丝干质量测定摇 制备突变体菌株和
野生型 圆园鄄苑 菌株的孢子悬浮液袁调节浓度至 员 伊 员园远
个窑皂蕴 原员袁吸取 园郾 圆 皂蕴 到装有 员园园 皂蕴 无菌 孕阅 培
养液的锥形瓶中袁圆缘益恒温 员员园 则窑皂蚤灶 原员摇床培养遥
源 凿后 愿 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心收集菌体袁远园益烘干至恒
质量袁称量遥
员援 苑摇 菌株对南方根结线虫渊酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬冤虫卵的致
病力测定
获得南方根结线虫渊酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬冤虫卵按常规
方法进行咱员缘暂 遥 显微镜下调节虫卵浓度到 员 园园园 个窑
皂蕴 原员遥 在直径 远 糟皂 的培养皿中加入 员园园 滋蕴 卵悬
液袁并加入 猿 皂蕴的 员援 园 伊 员园远 个窑皂蕴 原员的突变体孢
子液袁野生型 圆园鄄苑 做对照遥 源 凿 后统计卵的寄生数
和未寄生数袁计算菌株孢子对南方根结线虫渊酝援 蚤灶鄄
糟燥早灶蚤贼葬冤虫卵的寄生率遥
员援 愿摇 数据统计分析
以上试验获得的数据均由 杂孕杂杂 员愿援 园 进行单因
素方差分析渊韵灶藻鄄宰葬赠 粤晕韵灾粤冤袁应用 阅怎灶糟葬灶 法对
不同菌株多重比较渊孕 越 园郾 园缘冤袁实验数据采用平均
值加减标准差渊皂藻葬灶 依 杂阅袁灶 越猿冤的形式表示遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 突变体菌株遗传稳定性
随机选取的 员源 株突变体经过连续转接继代 缘
代后袁突变体菌落形态和生长状况并未发生改变遥
表明所选取的 员源 株突变体能够稳定遗传遥
圆援 圆摇 突变体菌株 孕悦砸检测
孕悦砸检测随机挑选的 员源 株突变体袁结果图 员 显
示袁利用外源基因即抗性筛选标记基因 遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶
基因设计的引物 允陨粤晕悦耘鄄云 辕 允陨粤晕悦耘鄄砸 扩增出了预
期大小为 缘远员 遭责的片段袁而野生型菌株 圆园鄄苑 并未有
片段扩出袁扩增出的 员源 个片段测序后与 遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶
基因经过比对袁发现序列完全一致遥 说明外源基因
遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶基因已整合进入淡紫拟青霉基因组中袁
并且能够遗传表达遥
酝院阅晕粤 酝葬则噪藻则 芋曰员院野生型菌株 圆园鄄苑曰圆鄄员缘院突变体 月晕鄄员曰月晕鄄猿曰月晕鄄远曰月晕鄄苑曰月晕鄄员园曰
月晕鄄员员曰月晕鄄员圆曰月晕鄄员猿曰月晕鄄员缘曰 月晕鄄员远曰月晕鄄员愿曰月晕鄄圆园曰月晕鄄圆员曰月晕鄄圆苑援
图 员摇 淡紫拟青霉 栽鄄阅晕粤突变体的 孕悦砸检测结果
圆援 猿摇 突变体菌株生物学特征
圆援 猿援 员摇 菌株形态学观察及比较摇 与原始菌株 圆园鄄苑
对比发现袁部分突变体的菌落颜色和菌落形态例如
隆起状况尧同心圆尧厚度尧放射状沟纹等方面发生了
变化遥 其中突变体 月晕鄄员尧月晕鄄员圆尧月晕鄄员猿 菌落中心呈
现少量淡紫色袁大部分为白色袁突变体 月晕鄄苑 为浅白
色的菌落颜色袁其它菌株菌落颜色与 圆园鄄苑 相比并无
明显区别遥 同时菌落背面颜色也发生了不同程度的
变化袁野生型 圆园鄄苑 的背面颜色为浅黄色袁而突变体
月晕鄄员尧月晕鄄员园尧月晕鄄员员尧月晕鄄员圆尧月晕鄄员猿尧月晕鄄员愿尧月晕鄄圆苑 的
背面颜色加深袁月晕鄄苑 中心却出现了白色袁边缘呈现
浅黄色遥 在隆起状况方面袁月晕鄄员尧月晕鄄苑尧月晕鄄员员尧月晕鄄
员愿 和 月晕鄄圆苑 菌落隆起袁尤其 月晕鄄苑 出现了大量的气
生菌丝袁月晕鄄远尧月晕鄄员圆 和 月晕鄄员猿 菌落凹陷袁其他突变
体均为扁平菌落袁与野生型 圆园鄄苑 菌落一致遥 月晕鄄员尧
月晕鄄远尧月晕鄄员园尧月晕鄄员圆尧月晕鄄员愿 和 月晕鄄圆苑 菌株的菌落出
现了同心圆袁月晕鄄员尧月晕鄄远尧月晕鄄苑尧月晕鄄员园尧月晕鄄员员尧月晕鄄
员圆尧月晕鄄员猿尧月晕鄄员愿 和 月晕鄄圆苑 菌落厚度较厚袁菌株 月晕鄄
员尧月晕鄄员园尧月晕鄄员猿尧月晕鄄员愿 和 月晕鄄圆苑 的菌落背面出现了
放射状沟纹遥 员源 株突变体的菌落特征见表 员袁图 圆
和图 猿遥 这些形态学特征变化表明 栽鄄阅晕粤插入影响
了菌落颜色和色素积累等遥
员圆圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
表 员摇 淡紫拟青霉突变体的形态学特征
菌株编号 菌落正面颜色 菌落背面颜色 隆起状况 同心圆 厚度 放射状沟纹
圆园鄄苑 淡紫色 浅黄色 扁平 原 薄 原
月晕鄄员 少量淡紫色袁大部分呈现白色 深黄色 隆起 垣 厚 垣
月晕鄄猿 淡紫色 浅黄色 扁平 原 薄 原
月晕鄄远 淡紫色 浅黄色 凹陷 垣 稍厚 原
月晕鄄苑 浅白色 白色到浅黄色 隆起 原 厚 原
月晕鄄员园 淡紫色 深黄色 扁平 垣 稍薄 垣
月晕鄄员员 深紫色 深黄色 隆起 原 稍厚 原
月晕鄄员圆 少量淡紫色袁大部分呈现白色 深黄色 凹陷 垣 厚 原
月晕鄄员猿 少量淡紫色袁大部分呈现白色 深黄色 凹陷 原 厚 垣
月晕鄄员缘 淡紫色 浅黄色 扁平 原 薄 原
月晕鄄员远 淡紫色 浅黄色 扁平 原 稍薄 原
月晕鄄员愿 淡紫色 深黄色 隆起 垣 厚 垣
月晕鄄圆园 淡紫色 浅黄色 扁平 原 薄 原
月晕鄄圆员 淡紫色 浅黄色 扁平 原 薄 原
月晕鄄圆苑 淡紫色 深黄色 隆起 垣 稍厚 垣
摇 摇 垣注院 垣代表有袁 原代表无
粤院野生型 圆园鄄苑曰月 韵院突变体 月晕鄄员曰月晕鄄猿曰月晕鄄远曰月晕鄄苑曰月晕鄄员园曰月晕鄄员员曰月晕鄄员圆曰月晕鄄员猿曰月晕鄄员缘曰月晕鄄员远曰月晕鄄员愿曰月晕鄄圆园曰月晕鄄圆员曰月晕鄄圆苑援
图 圆摇 淡紫拟青霉突变体的正面菌落形态
粤院野生型 圆园鄄苑曰月 韵院突变体 月晕鄄员曰月晕鄄猿曰月晕鄄远曰月晕鄄苑曰月晕鄄员园曰月晕鄄员员曰月晕鄄员圆曰月晕鄄员猿曰月晕鄄员缘曰月晕鄄员远曰月晕鄄员愿曰月晕鄄圆园曰月晕鄄圆员曰月晕鄄圆苑援
图 猿摇 淡紫拟青霉突变体的背面菌落形态
圆圆圆
第 圆 期 马建伟等院淡紫拟青霉 栽鄄阅晕粤插入突变体的表型分析
圆援 猿援 圆 摇 突变体菌株生长速率尧产孢量尧孢子萌发率
和菌丝干质量的测定摇 与 圆园鄄苑 对比发现袁只有 月晕鄄苑
的菌落生长速率无明显变化 渊显著性水平 孕 越
园郾 园缘冤袁月晕鄄员员 菌落生长速率降低袁是野生型菌株的
园郾 怨缘 倍袁其余 员圆 个突变体菌株菌落生长速率明显
变大袁具有显著性差异袁占全部菌株的 愿缘援 苑员豫 渊表
圆冤遥 产孢量测定结果表明袁 月晕鄄员员袁月晕鄄员圆 产孢量显
著增强袁为 员源 株突变体菌株的 员源援 圆怨豫 袁其余菌株产
孢量显著性降低遥 孢子萌发率发生改变的菌株占
苑愿援 缘苑豫 袁其中 月晕鄄员袁月晕鄄猿袁月晕鄄员愿袁月晕鄄圆园袁月晕鄄圆苑 孢
子萌发率增大袁而 月晕鄄远袁 月晕鄄苑袁月晕鄄员园袁 月晕鄄员员袁 月晕鄄
员缘袁月晕鄄圆员 孢子萌发率降低遥 在菌丝干质量方面袁
月晕鄄远袁月晕鄄员愿袁月晕鄄圆园 的菌丝干质量有显著增加袁月晕鄄
苑袁月晕鄄员园袁月晕鄄圆苑 的菌丝干质量显著下降袁 各占全部
突变体的 圆员援 源猿豫 袁其余 愿 株菌株菌丝干质量并无明
显变化遥 结果如表 圆 所示遥
表 圆摇 淡紫拟青霉突变体的菌落生长速率尧产孢量尧孢子萌发率和菌丝干质量
菌株编号 菌落生长速率 辕 渊皂皂窑凿 原员 冤 每 糟皂圆 产孢量 辕 渊员园远窑皂蕴 原员 冤 孢子萌发率 辕 豫 菌丝干质量 辕 早
圆园鄄苑 缘援 远怨 依 园郾 园缘 员圆援 源远 依 员援 员缘 远圆援 园园 依 缘援 圆怨 园郾 远远员 苑 依 园郾 园猿缘 圆
月晕鄄员 远援 猿怨 依 园郾 员园鄢 源援 愿源 依 园援 员苑鄢 苑圆援 远苑 依 远援 猿缘鄢 园郾 缘苑园 缘 依 园郾 园怨愿 愿
月晕鄄猿 缘援 怨圆 依 园郾 园愿鄢 圆援 远猿 依 园援 远源鄢 愿猿援 远苑 依 缘援 愿远鄢 园郾 远圆园 猿 依 园郾 园园苑 缘
月晕鄄远 远援 园愿 依 园郾 园愿鄢 圆援 怨苑 依 园援 圆圆鄢 猿缘援 猿猿 依 远援 远远鄢 员援 园缘怨 怨 依 园郾 园苑园 远鄢
月晕鄄苑 缘援 缘愿 依 园郾 园愿 员援 缘远 依 园援 远缘鄢 源员援 园园 依 圆援 园园鄢 园郾 源远源 源 依 园郾 园员怨 园鄢
月晕鄄员园 远援 猿员 依 园郾 园缘鄢 缘援 苑圆 依 员援 缘园鄢 猿怨援 远苑 依 愿援 园愿鄢 园郾 源愿怨 缘 依 园郾 园源缘 苑鄢
月晕鄄员员 缘援 源圆 依 园郾 园园鄢 员愿援 员苑 依 源援 苑园鄢 源愿援 猿猿 依 源援 园源鄢 园郾 缘苑远 远 依 园郾 员园缘 员
月晕鄄员圆 远援 员员 依 园郾 园缘鄢 圆员援 圆园 依 源援 苑源鄢 缘圆援 远苑 依 圆援 愿怨 园郾 缘怨愿 怨 依 园郾 园远源 愿
月晕鄄员猿 远援 猿远 依 园郾 园缘鄢 源援 圆苑 依 园援 源猿鄢 远缘援 猿猿 依 圆援 猿员 园郾 远远员 源 依 园郾 员猿愿 源
月晕鄄员缘 远援 员苑 依 园郾 园愿鄢 缘援 怨苑 依 园援 苑怨鄢 猿猿援 猿猿 依 缘援 缘员鄢 园郾 苑缘员 源 依 园郾 员源猿 员
月晕鄄员远 远援 员源 依 园郾 园缘鄢 圆援 缘圆 依 园援 缘圆鄢 远苑援 猿猿 依 苑援 苑苑 园郾 远猿园 猿 依 园郾 圆缘园 源
月晕鄄员愿 远援 圆圆 依 园郾 员猿鄢 源援 怨愿 依 员援 圆怨鄢 愿猿援 远苑 依 源援 怨猿鄢 园郾 怨员缘 愿 依 园郾 园源苑 猿鄢
月晕鄄圆园 远援 猿猿 依 园郾 园园鄢 猿援 苑源 依 员援 园猿鄢 苑源援 园园 依 远援 园愿鄢 园郾 愿远苑 源 依 园郾 园源员 圆鄢
月晕鄄圆员 远援 园猿 依 园郾 员园鄢 猿援 园远 依 园援 怨愿鄢 源远援 远苑 依 员援 缘猿鄢 园郾 缘怨愿 源 依 园郾 园怨怨 苑
月晕鄄圆苑 远援 员怨 依 园郾 园缘鄢 源援 怨园 依 圆援 圆缘鄢 苑圆援 远苑 依 猿援 圆圆鄢 园郾 源远猿 园 依 园郾 园猿缘 怨鄢
摇 摇 注院鄢表示与 圆园鄄苑 相比有显著性差异渊孕 越 园郾 园缘冤
圆援 猿援 猿摇 突变体对南方根结线虫致病力的变化摇 致
病力测定结果如图 源 显示渊孕 越 园郾 园缘冤院菌株 月晕鄄猿袁
月晕鄄员猿 的致病力与 圆园鄄苑 相比并无显著性差异袁显著
增大的只有 月晕鄄员员袁致病力为 愿远援 远苑豫 袁比野生型菌
株 圆园鄄苑 的致病力 远苑援 远源豫提高了 员怨援 园猿豫 曰而大部分
突变体侵染卵的效果明显下降袁月晕鄄苑 的致病率为
圆园郾 员圆豫 袁下降了 源苑援 缘圆豫 袁结果最为显著遥 突变体菌
株的致病力的变化说明 栽鄄阅晕粤 的插入可能影响淡
紫拟青霉致病的相关基因功能遥
图 源摇 淡紫拟青霉突变体的致病力
猿摇 结论与讨论
农杆菌介导的遗传转化体系因为具有简单尧高
效和随机整合的特点袁目前已被广泛应用于真菌的
转化咱员远 原 员苑暂 遥 本研究从利用这一技术成功转化的淡
紫拟青霉突变体库中袁成功筛选到了生物学特性和
致病力发生变化的突变体遥 突变体经过遗传稳定性
和 孕悦砸检测袁确定了突变体性状的改变确实是由于
栽鄄阅晕粤的插入所引起的遥 栽鄄阅晕粤 进入淡紫拟青霉
基因组后会阻断不同调控途径或代谢途径袁使某些
基因的表达受到影响袁进而性状会发生改变袁表型的
突变一般会和功能作用联系起来袁例如色素积累尧致
病力等遥 淡紫拟青霉侵染线虫卵并致死是一个复杂
的过程袁需要一系列基因的控制遥 在本研究中袁筛选
的性状包括菌落生长速率尧产孢量尧孢子萌发率和菌
丝干质量等袁这些性状与野生型菌株相比有所不同袁
突变基因的差异会造成相同性状或不同性状之间出
现反差及不一致的情况遥 随机挑选的这 员源 种菌株
主要是用来从中筛选致病力弱产孢量少的菌株袁并
且由于本技术是利用的反向遗传策略袁从而可以为
后续基因层面分析其致病机理打下基础遥 致病力增
猿圆圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
强产孢量高的菌株也可以直接应用于生产遥 分生孢
子通常作为商用产品的配方制剂袁其产量直接影响
生产袁并且分生孢子的萌发在病原真菌定植初期阶
段会起到一定作用咱员愿暂 遥 分生孢子作为多种真菌的
繁殖体袁其存在是真菌致病的前提条件咱员怨暂 袁研究孢
子产生的分子机制对明确淡紫拟青霉在生防中的作
用有指导意义遥 在研究中发现袁月晕鄄员员袁月晕鄄员圆 的产
孢量增大袁其余产孢量减少袁这说明 栽鄄阅晕粤 的插入
可能影响了控制孢子产生的基因袁这与学者在研究
灰葡萄孢中得出的同一条信号途径中不同成员基因
的突变对分生孢子产生情况影响不同这一结论相一
致咱圆园暂 遥 由于 栽鄄阅晕粤 插入是一个随机的过程袁不同
基因的改变袁致使筛选得到的 月晕鄄员员袁月晕鄄员圆 这两个
菌株的致病力向两个极端发展袁月晕鄄员员 致病力提高袁
月晕鄄员圆 则显著下降遥 本课题插入突变获得的 月晕鄄员员
突变体致病力提高袁由于淡紫拟青霉对线虫的致病
作用是一个复杂的过程袁致病力受多种因素影响袁而
且商用菌剂主要是产孢量高致病力强的菌株袁月晕鄄员员
可以作为优良突变菌株用于实际生产袁并且其带有
遭藻贼葬鄄贼怎遭怎造蚤灶基因袁对杀菌剂苯菌灵具有抗性袁为淡紫
拟青霉的推广与生产应用可能提供更广阔的空间袁
对于提高农作物产量袁减少线虫带来的经济损失具
有巨大的现实意义遥 由于农杆菌介导的遗传转化多
为 栽鄄阅晕粤单拷贝整合咱圆员 原 圆圆暂 袁对于那些致病力弱的菌
株可以作为反向遗传策略的材料袁研究突变基因袁为
突变体的基因功能分析提供便利袁而利用 澡蚤栽粤陨蕴鄄孕悦砸
可以扩增 栽鄄阅晕粤的侧翼序列咱圆猿暂 袁从而确定被破坏的
基因袁为进一步研究控制淡紫拟青霉的形态分化袁孢
子产生以及致病力方面的基因提供重要基础遥
参考文献院
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咱员圆暂 赵培宝袁任爱芝袁胡明江袁等援 农杆菌介导的拟康氏木霉遗传转
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咱员缘暂 汪来发袁杨宝君袁李传道援 寄生真菌对根结线虫的致病力评价
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