全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４４６６ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
潘龙其，张丽，杨成德，袁庆华，王瑜，苗丽宏．紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究．草业学报，２０１５，２４（１０）：８８９８．
ＰＡＮＬｏｎｇＱｉ，ＺＨＡＮＧＬｉ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ，ＹＵＡＮ ＱｉｎｇＨｕａ，ＷＡＮＧ Ｙｕ，ＭＩＡＯＬｉＨｏｎｇ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ
犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｒｏｏｔ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１０）：８８９８．
紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的
鉴定及其生物学特性研究
潘龙其１，张丽１，杨成德１，袁庆华２，王瑜２，苗丽宏２
（１．甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中－美草地畜牧业
可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０；２．中国农业科学研北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：本文对从内蒙古赤峰巴雅尔草业基地紫花苜蓿根部分离到的菌株ＢＹＥ２７２５进行了致病性测定、形态学和
ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析鉴定及生物学特性测定。结果表明，该菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的最适温度分别为２５，３０
和２８℃；ｐＨ值５．０～１１．０均宜于菌丝生长，产孢最适ｐＨ８．０，孢子萌发最适ｐＨ７．０；光暗交替利于菌丝生长，光
照利于产孢和孢子的萌发；孢子在相对湿度低于７５％不萌发，高于９５％萌发较快；葡萄糖蛋白胨培养基利于菌丝
生长和孢子萌发，马铃薯蔗糖琼脂培养基利于产孢；碳源中葡萄糖利于菌丝生长和孢子萌发，蔗糖利于产孢；氮源
中蛋白胨利于菌丝生长，酵母膏利于产孢和孢子萌发；菌丝致死温度为５４℃（１０ｍｉｎ），分生孢子的致死温度为４８℃
（１０ｍｉｎ）；根据其形态特征和ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析结果，鉴定其为拟枝孢镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲）。
关键词：紫花苜蓿；拟枝孢镰刀菌；病原鉴定；生物学特性
犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲犻狊狅犾犪狋犲犱
犳狉狅犿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪狉狅狅狋
ＰＡＮＬｏｎｇＱｉ１，ＺＨＡＮＧＬｉ１，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ１，ＹＵＡＮＱｉｎｇＨｕａ２，ＷＡＮＧＹｕ２，ＭＩＡＯＬｉＨｏｎｇ２
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪狋犻狅狀，犘狉犪狋
犪犮狌犾狋狌狉犪犾犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲，犛犻狀狅犝．犛犆犲狀狋犲狉犳狅狉犌狉犪狕犻狀犵犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿 犛狌狊狋犪犻狀犪犫犻犾犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌
７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊狅犳犆犃犃犛，犅犲犻犼犻狀犵１００１９３，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｓｔｒａｉｎＢＹＥ２７２５ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）ｗｉｔｈｒｏｏｔｒｏｔｉｎｎｏｒｔｈＣｈｉｎａｗａｓｃｏｍ
ｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙａｎａｌｙｓｅｓｏｆｉｔｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｎｄＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｏｐｔｉ
ｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｆｏｒｍｙｃｅｌｉｕｍｇｒｏｗｔｈ，ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅ２５℃，３０℃，ａｎｄ２８℃，ｒｅ
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓａｂｌｅｔｏｇｒｏｗｉｎａｐＨｒａｎｇｅｏｆ５．０－１１．０ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐＨｆｏｒｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎａｎｄ
ｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅ８．０ａｎｄ７．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍａｌｆｏｒｍｙｃｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈｗｈｅｒｅａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｉｇｈｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍａｌｆｏｒｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎａｎｄｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｓｐｏｒｅｓｇｅｒｍｉｎａ
ｔｅｄｍｏｓｔｒａｐｉｄｌｙａｔ９５％ｒｅｌａｔｉｖｅｈｕｍｉｄｉｔｙｏｒｉｎｗａｔｅｒｄｒｏｐｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄｆａｉｌｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｅａｔｒｅｌａｔｉｖｅｈｕｍｉｄｉｔｙ
ｌｅｖｅｌｓｂｅｌｏｗ７５％．Ｄｅｘｔｒｏｓｅｐｅｐｔｏｎｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｍｅｄｉｕｍｆｏｒｍｙｃｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｂｅｓｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｆｏｒｍｙｃｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗａｓｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｔｈａｔｆｏｒｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｒｏｓｅ．Ｔｈｅｂｅｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｆｏｒｍｙｃｅｌｉｕｍ
第２４卷 第１０期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１０
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１０月
Ｏｃｔ，２０１５
收稿日期：２０１４１１１３；改回日期：２０１５０１１４
基金项目：公益性行业（农业）科研专项项目（２０１３０３０５７）和国家科技支撑项目“优质多抗牧草新品种选育与良种繁育关键技术研究与示范”
（２０１１ＢＡＮ１７Ｂ０１）资助。
作者简介：潘龙其（１９８８），男，甘肃天水人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｇｓａｕｐａｎｌｏｎｇｑｉ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｃｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｙｕａｎｑｉｎｇｈｕａ＠ｉａｓｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
ｇｒｏｗｔｈｗａｓｐｅｐｔｏｎｅａｎｄｔｈａｔｆｏｒｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｗａｓｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ．Ｔｈｅｌｅｔｈａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｆｏｒｍｙｃｅｌｉａｗａｓ５４℃ （１０ｍｉｎ）ａｎｄｔｈａｔｆｏｒｓｐｏｒｅｓｗａｓ４８℃ （１０ｍｉｎ）．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｎＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａ；犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界上最早栽培、分布面积最广的优质牧草，素有“牧草之王”的美誉，也是我国当
前生态建设工程中应用最为广泛的草种［１］。与粮食、经济作物相比，有较强的耐盐碱性，是良好的水土保持植
物［２］。苜蓿根腐病是一种主要发生在根部的世界性病害，尤其在美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚、俄罗斯和日本
等国家发生严重［３］，我国自１９９１年发现该病以来，先后在新疆、甘肃、青海、四川［４５］等地陆续报道，王雪薇等［６］、
陈耀等［７］发现新疆苜蓿根腐病使苜蓿死亡率达６０．０８％～７３．４５％。据估计，全世界每年由该病造成２０％ 左右
的产量损失，严重的甚至高达４０％。一般来说，不同地区的根腐病症状因病原物的不同而异。总之，被侵染植株
生长缓慢，枝条枯萎，叶片变黄，根部维管束呈深褐色，根茎和中部变空，大量侧根腐烂死亡，整株枯萎或整根腐烂
则需几周至１个月以上［８］。国内外学者对于该病的病原进行了大量的研究，均认为该病病原较为复杂，但多与镰
刀菌有关。尽管ＲｏｂｅｔＦＮ发现细菌也可以造成根腐病，但真菌的侵染是导致该病的主要原因［９］。我国先后报
道的病原达２８种，其中镰刀菌１３种，分别为尖孢镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿）、茄腐皮镰刀菌（犉．狊狅犾犪狀犻）、燕
麦镰刀菌（犉．犪狏犲狀犪犮犲狌犿）、锐顶镰刀菌（犉．犪犮狌犿犻狀犪狋狌犿）、接骨木镰刀菌（犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿）、三线镰刀菌（犉．
狋狉犻犮犻狀犮狋狌犿）、半裸镰刀菌（犉．狊犲犿犻狋犲犮狋狌犿）、木贼镰刀菌（犉．犲狇狌犻狊犲狋犻）、串珠镰刀菌（犉．犿狅狀犻犾犻犳狅狉犿犲）、大刀镰刀菌
（犉．犮狌犾犿狅狉狌犿）、链状镰刀菌（犉．犳狌狊犪狉犻狅犻犱犲狊）和梨孢镰刀菌（犉．狆狅犪犲）等。其他病原真菌１２种，细菌２种，线虫
１种［１０］。此外，疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪）、立枯丝核菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪）、根腐丝囊霉（犃狆犺犪狀狅犿狔犮犲狊）、腐霉（犘狔狋犺犻
狌犿）、壳多隔孢菌（犛狋犪犵狀狅狊狆狅狉犪犿犲犾犻犾狅狋犻）、壳满孢菌（犘犾犲狀狅犱狅犿狌狊犿犲犾犻犾狅狋犻）、柱枝双孢霉（犆狔犾犻狀犱狉狅犮犾犪犱犻狌犿犮狉狅
狋犪犾犪狉犻犪犲）、柱胞菌（犆狔犾犻狀犱狉狅犮犪狉狆狅狀犲犺狉犲狀犫犲犻犵犻犻）、皮伞菌（犕犪狉犪狊犿犻狌狊ｓｐｐ．）、核盘菌（犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪ｓｐ．）、黑粘座孢
霉（犕狔狉狅狋犺犲犮犻狌犿狉狅狉犻犱狌犿）和多主瘤梗单胞霉（犘犺狔犿犪狋狅狋狉犻犮犺狌犿狅犿狀犻狏狅狉狌犿）等也是引起苜蓿根腐病的主要真
菌，也能导致苜蓿根腐病的发生［１１］。目前，内蒙古地区苜蓿种植面积达８０万ｈｍ２，占全国种植总面积的１／５，其
也是我国苜蓿种子和苜蓿草产品的主产区之一。紫花苜蓿根腐病导致苜蓿固氮能力降低，利用年限和生长寿命
缩短、苜蓿产量和品质下降、甚至引起苜蓿草地的提早衰败（２～３年内大面积死亡）和苜蓿加工利用价值的丧
失［１２］。近年来随着紫花苜蓿种植面积的增加和种植年限的延长，病害问题越发严重，已成为主要的制约因素之
一。苜蓿根腐病的研究在苜蓿产业化开发和生态环境建设方面具有重大意义。因此，本试验在国内首次对内蒙
赤峰巴雅尔草业基地紫花苜蓿根腐病菌———拟枝孢镰刀菌进行了系统研究，以期为苜蓿根腐病的诊断和防治提
供依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试病原菌
供试病原菌为本实验室２０１３年从巴雅尔草业基地（内蒙古赤峰）紫花苜蓿（皇后）根腐病发病部位采用方中
达［１３］的组织分离法分离，再经过单孢分离［１４］获得的单孢菌株。
１．２ 症状描述
根据紫花苜蓿根腐病田间危害症状的特点进行描述、记载并拍照。
１．３ 致病性测定
采用灌根法和米粒接种法接种。在室温条件下将１×１０６ 个／ｍＬ的孢子悬浮液浇灌于盆栽的中苜一号６０ｄ
幼苗根围，后覆无菌土５ｍｍ，３次重复，以无菌水为对照；米粒接种法为将１×１０６ 个／ｍＬ的孢子悬浮液制成米粒
接种体均匀的分散在幼苗根围（１０粒／株），覆无菌土５ｍｍ，３次重复，以无菌水制成的米粒接种体为对照。３ｄ
后连续每天观察苜蓿的发病情况至形成典型症状，从发病部位再次分离病原菌。
１．４ 病原菌鉴定
１．４．１ 形态特征观察 将单孢菌株纯化后转接于马铃薯蔗糖琼脂（ＰＳＡ）平板，２５℃黑暗培养，观察菌落颜色、
９８第１０期 潘龙其 等：紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究
形状以及菌丝疏密程度。产孢后，在显微镜下观察大、小分生孢子和厚垣孢子的形态、拍照并测量孢子的大小
（１００个）。根据病原菌形态特征，结合Ｂｏｏｔｈ《镰刀菌属》［１５］等相关资料进行形态学鉴定。
１．４．２ 病原菌ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析 采用镰刀菌属特异性引物Ｆｕ３（５′ＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡＡＡ３′）
和Ｆｕ４（５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′）［１６］对病原菌ｒＤＮＡ的ＩＴＳ片段按刘志恒等［１７］的方法进行分析。
１．５ 病原菌生物学特性测定
１．５．１ 不同条件对菌丝生长和产孢量的影响 （１）温度对菌丝生长和产孢量的影响，菌株２５℃黑暗培养５ｄ，
用无菌打孔器在其菌落边缘打取直径０．５ｃｍ的菌饼，接种于ＰＳＡ平板中央，３次重复，分别置于０～４５℃（间隔
５℃）恒温箱黑暗培养，５ｄ后用十字交叉法测量菌落直径。７ｄ后每皿取４块直径１．０ｃｍ的菌饼，用１ｍＬ无菌
水洗脱孢子，血球计数板计产孢量，３次重复。
（２）ｐＨ值对菌丝生长和产孢量的影响，用ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）和ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）将ＰＳＡ培养基ｐＨ分别调至
２．０～１２．０（间隔１．０），３次重复，２５℃恒温箱黑暗培养；接种、菌丝生长和产孢量测量方法同１．５．１（１）。
（３）光照对菌丝生长和产孢量的影响，将直径０．５ｃｍ的菌饼接种于ＰＳＡ培养基平板中央，分别置于２４ｈ／ｄ
光照、２４ｈ／ｄ黑暗和（１２ｈ光照与１２ｈ黑暗）／ｄ光暗交替条件下２５℃恒温培养，３次重复，其他方法同１．５．１（１）。
（４）培养基对菌丝生长和产孢量的影响，供试培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基ＰＤＡ、马铃薯蔗糖琼脂培养
基ＰＳＡ、水琼脂培养基 ＷＡ、ＶＢＣ、查贝克氏培养基ＣＺ、蔗糖培养基ＰＳ、玉米粉培养基ＣＭＡ、燕麦培养基ＯＭＡ、
Ｖ８碳酸钙琼脂培养基、葡萄糖蛋白胨、淀粉琼脂、Ｂｉｌａｉ’ｓ、苜蓿煎汁、胡萝卜和真菌生理培养基。２５℃恒温箱培
养，３次重复；其他方法同１．５．１（１）。
（５）碳、氮源对菌丝生长和产孢量的影响，以真菌生理培养基为基础培养基，以ＫＮＯ３ 为氮源，以葡萄糖、果
糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇和淀粉作为碳源，以无碳源培养基为对照；以葡萄糖为碳源，以 ＫＮＯ３、
（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、尿素、蛋白胨、牛肉膏和酵母膏作为氮源，以无氮源培养基为对照。２５℃恒温箱培养，３次重
复；其他方法同１．５．１（１）。
（６）菌丝致死温度测定，将直径０．５ｃｍ的菌饼置于装有５ｍＬ无菌水的试管中，将试管置于４０～７０℃（间隔
５℃）恒温水浴锅中处理１０ｍｉｎ，测得致死温度范围，设置间隔１℃梯度，重复上述操作，确定致死温度，３次重复。
１．５．２ 不同条件对分生孢子萌发的影响 （１）分生孢子萌发时间的测定，将分生孢子配制成浓度为１０～２０个
孢子／视野（１０×４０倍）悬浮液，采用凹载片萌发法，２５℃保湿培养，分别于４～２４ｈ（间隔２ｈ）后检查３００个孢子
萌发情况，确定最佳萌发时间。
（２）温度对分生孢子萌发的影响，采用凹载片萌发法，将分生孢子悬浮液置于５～４５℃（间隔５℃）不同温度保
湿培养，５次重复，１２ｈ（由预实验得）后测定孢子萌发率，每次随机测定３００个孢子。
（３）ｐＨ 对分生孢子萌发的影响，ＰＳＡ 培养液和孢子悬浮液等体积混合，用 ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）和 ＮａＯＨ（１
ｍｏｌ／Ｌ）调节其ｐＨ至２．０～１２．０（间隔１．０），２５℃保湿培养，其他同１．５．２（２）。
（４）光照对分生孢子萌发的影响，将孢子悬浮液分别置于２４ｈ／ｄ光照、２４ｈ／ｄ黑暗和（１２ｈ光照与１２ｈ黑
暗）／ｄ光暗交替光照条件下２５℃保湿培养，其他方法同１．５．２（２）。
（５）湿度对分生孢子萌发影响测定，将孢子悬浮液滴于凹载片上，风干后置于用不同盐类饱和溶液控制的湿
度为６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９７％，１００％以及水滴等不同湿度的密闭容器中。其他同方法
１．５．２（２）。
（６）培养液对分生孢子萌发的影响，供试培养液有苜蓿煎汁、胡萝卜煎汁、ＰＤＡ、ＰＳＡ、ＶＢＣ、ＣＺ、ＰＳ、ＣＭＡ、
ＯＭＡ、葡萄糖蛋白胨、淀粉琼脂、Ｂｉｌａｉ’ｓ、Ｖ８和真菌生理培养液，无菌水孢子悬浮液为对照。将分生孢子悬浮液
与上述１４种培养液等体积混合，采用凹载片萌发法，２５℃保湿培养８ｈ，其他方法同１．５．２（２）。
（７）碳、氮源对分生孢子萌发的影响，碳源培养液有葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、淀粉和无碳
源对照８种；氮源培养液有ＫＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和无氮源对照８种，培养液
分别与分生孢子悬浮液等体积混合，采用凹载片萌发法，２５℃保湿培养，其他方法同１．５．２（６）。
（８）分生孢子致死温度的测定，将装有５ｍＬ孢子悬浮液的试管置于４０～６０℃（间隔５℃）恒温水浴锅中处理
０９ 草 业 学 报 第２４卷
１０ｍｉｎ，采用凹载片萌发法，２５℃保湿培养，１２ｈ后测定孢子萌发率，测得致死温度范围，设置间隔１℃梯度，重复
上述操作，确定致死温度，５次重复。
１．６ 统计分析方法
运用ＤＰＳ６．５５对试验数据进行处理、分析。
２ 结果与分析
２．１ 病害症状描述
紫花苜蓿根腐病在各调查区均有发生（发病率１２％～４２％）。轻病田，个别植株萎蔫枯死（图１ａ）；重病田，全
田枯死（图１ｂ）。该病原菌主要侵染根部和根茎部，发病初期地上部分叶片发黄，个别枝条萎蔫枯死（图１ｃ）；根基
部逐渐扩展成褐色腐烂，根部产生水渍状坏死斑，主根导管呈棕褐色（图１ｄ）；发病后期地上部分叶片变黄枯萎，
全株枯死（图１ｅ）；整根全部腐烂（图１ｆ）。
图１ 紫花苜蓿根腐病田间自然发病症状
犉犻犵．１ 犛狔犿狆狋狅犿狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狉狅狅狋狉狅狋犻狀犳犻犲犾犱
ａ：轻病田；ｂ：重病田；ｃ：发病初期地上部分；ｄ：发病后期地上部分；ｅ：发病初期根部；ｆ：发病后期根部。ａ：Ｌｉｔｔｌｅｉｎｆｅｃｔｅｄｆｉｅｌｄ；ｂ：Ｈｅａｖｉｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｆｉｅｌｄ；ｃ：Ｌｅａｆｏｆｓｉｃｋｐｌａｎｔｉｎｅａｒｌｙｐｅｒｉｏｄ；ｄ：Ｌｅａｆｏｆｓｉｃｋｐｌａｎｔｉｎｌａｔｅｒｐｅｒｉｏｄ；ｅ：Ｒｏｏｔｏｆｓｉｃｋｐｌａｎｔｉｎｅａｒｌｙｐｅｒｉｏｄ；ｆ：Ｒｏｏｔｏｆｓｉｃｋｐｌａｎｔｉｎｌａｔｅｒｐｅｒｉｏｄ．
２．２ 病原菌的分离与致病性测定
采用常规组织分离法，对多个发病植株根部进行分离、单孢纯化，得到的多个真菌单孢分离物，将培养性状、
菌丝形态、孢子形态一致的分离物，合并编号为ＢＹＥ２７２５。
将分离物接种７～１５ｄ后，中苜一号全部发病，对照均不发病。其中米粒接种体接种比分生孢子悬浮液灌根
发病快５～８ｄ。米粒接种体接种的中苜一号发病后，植株萎蔫枯死（图２ａ），根部出现腐烂（图２ｃ），发病症状与田
间相似，对照不发病（图２ｂ，ｄ）。再次分离，从发病部位获得了与原接种分离物相同的病原菌。根据柯赫氏法则，
菌株ＢＹＥ２７２５为紫花苜蓿根腐病的病原菌。
２．３ 病原菌的鉴定
２．３．１ 形态特征观察 其在ＰＳＡ培养基上生长较快，５ｄ可长满全皿，菌落圆形，边缘整齐，正面初为橙色，后
渐变为白色，气生菌丝发达，呈絮状（图３ａ）；背面初为粉红色，后渐变成红褐色（图３ｂ）；分生孢子大、小两型，小型
分生孢子２～３ｄ可产生，无色单孢，０～１个分隔，卵形或棍棒形（图３ｃ），大小１．５７μｍ×２．２５μｍ～４．７５μｍ×
２０．４５μｍ；大型分生孢子５～７ｄ产生，镰刀状（图３ｄ），３～５个分隔，多为３个分隔，大小２．５４μｍ×５．２７μｍ～
１９第１０期 潘龙其 等：紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究
３８．３５μｍ×５３．５５μｍ；ＷＡ上培养１０ｄ产生厚垣孢子，圆形或卵圆形串珠状（图３ｅ）；分生孢子梗无隔，细长或单
瓶梗，产孢多为芽生殖（图３ｆ）。
根据病原菌的培养形状、两型分生孢子和厚垣孢子的形态特征，结合相关资料［１８２０］，初步确定ＢＹＥ２７２５为
拟枝孢镰刀菌 （犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狅狉狅狋狉犻犮犺犻狅犻犱犲ｓ）。
图２ 接种与不接种犅犢犈２７２５紫花苜蓿根腐病症状
犉犻犵．２ 犛狔犿狆狋狅犿狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狉狅狅狋狉狅狋犻狀狅犮狌犾犪狋犲犱狑犻狋犺犅犢犈２７２５
ａ：接种发病地上部分；ｂ：ＣＫ；ｃ：接种发病地下部分；ｄ：ＣＫ。ａ：Ｌｅａｆｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｐｌａｎｔ；ｂ：ＣＫ；ｃ：Ｒｏｏｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｐｌａｎｔ；ｄ：ＣＫ．
图３ 病原物菌落、分生孢子和厚垣孢子形态
犉犻犵．３ 犜犺犲犮狅犾狅狀狔，犮狅狀犻犱犻狌犿，犮犺犪犿狔犱狅狊狆狅狉犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲犱狆犪狋犺狅犵犲狀
ａ：菌落正面；ｂ：菌落背面；ｃ：小型分生孢子；ｄ：大型分生孢子；ｅ：厚垣孢子；ｆ：产孢结构。ａ：Ｕｐｐｅｒｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｃｏｌｏｎｙ；ｂ：Ｌｏｗｅｒｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅ
ｃｏｌｏｎｙ；ｃ：Ｃｏｎｉｄｉｕｍ；ｄ：Ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ；ｅ：Ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ；ｆ：Ｆｒｕｉｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．
２．３．２ 病原菌ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析 利用引物Ｆｕ３／Ｆｕ４对菌株进行ＰＣＲ扩增，在约５００ｂｐ处有一特异性片
段（图４）。将扩增产物测序，所测序列经ＢＬＡＳＴ对比分析，选取相似性较高的ｒＤＮＡＩＴＳ序列，并用ＣｌｕｓｔａｌＸ
进行多重序列比较，再通过 ＭＥＧＡ构建系统发育树，该病原菌与拟枝孢镰刀菌（ＫＣ２５４０５４）聚在一起（图５），结
合形态学特征，确定该病原菌为拟枝孢镰刀菌。
２．４ 不同条件对病原菌菌丝生长及产孢的影响
２．４．１ 温度对菌丝生长及产孢的影响 菌丝生长和产孢的温度范围均为５～３５℃，菌丝生长最适温度为
２５℃，５ｄ菌落直径为７．４４ｃｍ，最适产孢温度为３０℃，７ｄ产孢量为５．９３×１０５ 个／ｍＬ，低于５℃或高于３５℃菌丝
不生长也不产孢（图６）。
２．４．２ ｐＨ值对菌丝生长和产孢的影响 菌丝生长的ｐＨ值范围为３．０～１２．０，菌丝生长最适ｐＨ值为５．０～
２９ 草 业 学 报 第２４卷
１１．０，ｐＨ低于３．０菌丝停止生长。产孢量曲线呈单峰型，ｐＨ在３．０～８．０范围内，随着ｐＨ值增高产孢量逐渐增
大，之后随着ｐＨ值增高产孢量逐渐减小，最适产孢ｐＨ值为８，７ｄ产孢量为７．６０×１０５ 个／ｍＬ；ｐＨ低于３．０不
产孢（图７）。
２．４．３ 光照对菌丝生长和产孢的影响 光照处理对菌株菌丝生长和产孢无显著影响。黑暗和光照下，菌丝的
生长和产孢的差异不明显，但光暗交替更利于菌丝的生长，５ｄ菌落直径为７．１５ｃｍ，但不宜产孢（图８）。
图４ 狉犇犖犃犐犜犛序列的扩增
犉犻犵．４ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狅犳狉犇犖犃犐犜犛
图５ 病原菌的系统发育树
犉犻犵．５ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犅犢犈２７２５
图６ 温度对病原菌菌丝生长和产孢的影响
犉犻犵．６ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀犿狔犮犲犾犻狌犿犵狉狅狑狋犺犪狀犱狊狆狅狉狌犾犪狋犻狅狀
图７ 狆犎值对病原菌菌丝生长和产孢的影响
犉犻犵．７ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狆犎狅狀犿狔犮犲犾犻狌犿犵狉狅狑狋犺犪狀犱狊狆狅狉狌犾犪狋犻狅狀
不同小写字母表示在０．０５水平上差异显著，下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
图８ 光照对病原菌菌丝生长和产孢的影响
犉犻犵．８ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犻犾狌犿犻狀犪狋犻狅狀狅狀犿狔犮犲犾犻狌犿犵狉狅狑狋犺犪狀犱狊狆狅狉狌犾犪狋犻狅狀
图９ 菌丝致死温度
犉犻犵．９ 犉犪狋犪犾狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅犳犿狔犮犲犾犻狌犿
３９第１０期 潘龙其 等：紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究
２．４．４ 培养基对菌丝生长和产孢的影响 病原菌菌丝在１５种培养基上生长和产孢量差异显著，在葡萄糖蛋
白胨培养基菌丝生长最快，５ｄ菌落直径为７．５０ｃｍ，其次为ＰＤＡ和ＣＺ，产孢量最大的是ＰＳＡ，７ｄ产孢量为
１１．１３×１０５ 个／ｍＬ，其次为马铃薯淀粉培养基（犘＜０．０５）；Ｂｉｌａｉ’ｓ上菌丝生长最慢，５ｄ菌落直径为４．０８ｃｍ，ＰＳ
不宜产孢（犘＜０．０１）（表１）。
表１ 培养基对病原菌菌丝生长和产孢的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿犲犱犻狌犿狅狀犿狔犮犲犾犻狌犿犵狉狅狑狋犺犪狀犱狊狆狅狉狌犾犪狋犻狅狀
培养基 Ｍｅｄｉｕｍ 菌落直径Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ（ｃｍ） 产孢量Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ（×１０５Ｎｏ．／ｍＬ）
马铃薯葡萄糖培养基Ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅｍｅｄｉｕｍ，ＰＤＡ ６．９３±０．１５ＡＢａｂ ６．００±２．２１ＢＣＤｂｃ
查贝克氏培养基Ｃｚａｐｅｋ’ｓｍｅｄｉｕｍ，ＣＺ ６．６３±０．１０ＡＢＣｂｃ ２．５３±０．０７ＤＥＦＧｄｅｆ
燕麦琼脂培养基Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，ＯＭＡ ６．８７±０．０９ＡＢａｂｃ １．３３±０．０７ＥＦＧｅｆ
蔗糖培养基ｓｕｃｒｏｓｅｍｅｄｉｕｍ，ＰＳ ５．１８±０．１４ＤＥｅｆ ０．００±０．００Ｇｆ
水琼脂培养基 Ｗａｔｅｒａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，ＷＡ ４．６７±０．１６ＥＦｆｇ ０．８０±０．３１ＦＧｆ
玉米粉培养基Ｃｏｒｎｍｅａｌａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，ＣＭＡ ６．１８±０．１１ＢＣｃｄ １．６０±０．１２ＥＦＧｅｆ
马铃薯蔗糖培养基Ｐｏｔａｔｏｓｕｃｒｏｓｅａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，ＰＳＡ ６．６８±０．０７ＡＢＣｂｃ １１．１３±１．８４Ａａ
Ｖ８碳酸钙琼脂培养基Ｖ８ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，Ｖ８ ６．９７±０．１６ＡＢａｂ ２．８０±０．２３ＣＤＥＦＧｄｅｆ
胡萝卜培养基Ｃａｒｒｏｔａｇａｒｍｅｄｉｕｍ，ＣＡ ５．７８±０．０６ＣＤｄｅ １．５３±０．１８ＥＦＧｅｆ
Ｂｉｌａｙ培养基Ｂｉｌａｙｍｅｄｉｕｍ，Ｂｉｌａｉ’ｓ ４．０８±０．４７Ｆｇ １．５３±０．１８ＥＦＧｅｆ
复合维生素培养基Ｖｉｔａｍｉｎｂａｎｄｃｍｅｄｉｕｍ，ＶＢＣ ４．１０±０．５１Ｆｇ ５．２０±０．８１ＢＣＤＥｂｃｄ
葡萄糖蛋白胨培养基 Ｄｅｘｔｒｏｓｅｐｅｐｔｏｎｅｍｅｄｉｕｍ ７．５０±０．１３Ａａ １．４０±０．１２ＥＦＧｅｆ
真菌生理培养基Ｆｕｎｇｕｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｄｉｕｍ ６．４０±０．１２ＢＣｂｃｄ ４．０７±０．４４ＢＣＤＥＦｃｄｅ
苜蓿煎汁培养基Ａｌｆａｌｆａｌｅａｆｊｕｉｃｅｍｅｄｉｕｍ ６．４８±０．０９ＡＢＣｂｃ ６．５３±１．４１ＢＣｂｃ
马铃薯淀粉培养基Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈｍｅｄｉｕｍ ６．４０±０．１８ＢＣｂｃｄ ７．２７±０．７７Ｂｂ
注：大、小写字母分别表示同一列在０．０１与０．０５水平上差异显著，下同。
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌａｎｄｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ０．０１ａｎｄ０．０５ｌｅｖｅｌｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．４．５ 碳源、氮源对菌丝生长和产孢的影响 供试碳源以葡萄糖和可溶性淀粉较为适宜菌丝生长，蔗糖较适
宜产孢（犘＜０．０５）；半乳糖和麦芽糖不利于菌丝生长，葡萄糖不利于产孢（犘＜０．０１）；供试氮源以蛋白胨较适宜菌
丝生长，酵母膏和（ＮＨ４）２ＳＯ４ 较宜于产孢（犘＜０．０５）；ＫＮＯ３ 不利于菌丝生长，牛肉膏不利于产孢（犘＜０．０１）。
该结果表明，碳源和氮源的有无对菌丝的生长和产孢差异极显著，各碳源间或氮源间有差异（表２）。
表２ 碳源、氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犮犪狉犫狅狀狊狅狌狉犮犲，狀犻狋狉狅犵犲狀狊狅狌狉犮犲狅狀犿狔犮犲犾犻狌犿犵狉狅狑狋犺犪狀犱狊狆狅狉狌犾犪狋犻狅狀
碳源
Ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ
菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
（ｃｍ）
产孢量
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ
（×１０５Ｎｏ．／ｍＬ）
氮源
Ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ
菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
（ｃｍ）
产孢量
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ
（×１０５Ｎｏ．／ｍＬ）
葡萄糖Ｇｌｕｃｏｓｅ ６．６７±０．０６Ａａ ２．００±０．００ＣＤｄ 蛋白胨Ｐｅｐｔｏｎｅ ６．６８±０．１２Ａａ ３．５３±０．４７Ａａｂ
果糖Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ６．０７±０．０４ＣＤｃ ２．０７±０．３５ＣＤｄ 牛肉膏 Ｍｅａｔｅｘｔ ６．５２±０．０７Ａａｂ １．８０±０．３１Ａａｂ
半乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ ５．９７±０．０７Ｄｃ ３．００±０．８１ＣＤｃｄ 酵母膏Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ６．４２±０．０４ＡＢｂ ５．１３±０．１８Ａａ
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ ６．０７±０．０９ＣＤｃ ３．４０±０．３５ＣＤｃｄ 尿素Ｃａｒｂａｍｉｄｅ ６．０５±０．０６Ｃｃ ４．１３±０．６４Ａａｂ
麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ ５．９８±０．０３Ｄｃ ５．２０±０．１２ＢＣｂｃ 硝酸钾ＫＮＯ３ ６．０２±０．０４ＣＤｃ ２．６７±０．３３Ａａｂ
蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ ６．３０±０．０５ＢＣｂ １０．６７±２．２５Ａａ 氯化铵ＮＨ４Ｃｌ ６．１７±０．０４ＢＣｃ ３．０７±０．２７Ａａｂ
可溶性淀粉Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ ６．５２±０．０９ＡＢａ ７．５３±０．２４ＡＢｂ 硫酸铵（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６．１８±０．０７ＢＣｃ ５．００±２．８１Ａａ
ＣＫ ５．９３±０．０８Ｄｃ １．０７±０．０６Ｄｄ ＣＫ ５．７５±０．０６Ｄｄ ０．９３±０．１３Ａｂ
４９ 草 业 学 报 第２４卷
２．４．６ 菌丝致死温度 当处理温度≥５４℃时，菌饼在培养基上不能生长，即病原菌菌丝致死温度是５４℃，１０
ｍｉｎ（图９）。
２．５ 不同条件对分生孢子萌发的影响
２．５．１ 分生孢子萌发时间测定 ４ｈ后孢子开始萌发，１２ｈ后孢子萌发达到峰值并趋于稳定，以下孢子萌发
试验均以此为基础（图１０）。
２．５．２ 温度对分生孢子萌发的影响 孢子萌发的温度范围为１０～３５℃，最适温度为２８℃，１２ｈ后孢子萌发率
为９３．８０％，在５～２８℃之间，孢子萌发率随着温度的升高而增高，在２８～４０℃之间，孢子萌发率随着温度的升高
而降低（图１１）。
图１０ 孢子萌发时间
犉犻犵．１０ 犜犺犲狋犻犿犲狅犳狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
图１１ 温度对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
２．５．３ ｐＨ对分生孢子萌发的影响 在ｐＨ为３．０～１２．０范围内孢子均可萌发，最适ｐＨ为７．０，１２ｈ后孢子
萌发率为９２．５６％，不同ｐＨ值对孢子萌发的影响差异显著（图１２）。
２．５．４ 光照对分生孢子萌发的影响 光照对孢子萌发的影响差异不明显，２４ｈ全光照条件下，萌发率略高于
其他两条件，孢子萌发率为９３．０８％，光照条件宜于孢子萌发（图１３）。
图１２ 狆犎值对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狏犪犾狌犲狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
图１３ 光照对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犻犾狌犿犻狀犪狋犻狅狀狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
２．５．５ 湿度对分生孢子萌发的影响 分生孢子在相对湿度６５％～７５％的条件下均不能萌发，在相对湿度为
７５％～１００％的条件下，湿度越大萌发率越高，相对湿度１００％条件下萌发率最高，孢子萌发率为９３．８２％
（图１４）。
２．５．６ 培养液对分生孢子萌发的影响 １４种不同培养液对分生孢子萌发都有一定的促进作用，其中葡萄糖
蛋白胨培养液、ＣＡ、真菌生理培养液能有效地促进孢子萌发，葡萄糖蛋白胨培养液中孢子萌发率为９３．９９％，ＣＫ
５９第１０期 潘龙其 等：紫花苜蓿根腐病原菌———拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究
为７５．７６％（图１５）。
图１４ 湿度对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１４ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犺狌犿犻犱犻狋狔狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
２．５．７ 碳、氮源对分生孢子萌发的影响 葡萄糖和
果糖的效果最好，萌发率分别为９５．３５％和９３．２８％，
淀粉的效果最差，萌发率为８４．８８％。除尿素外，其他
氮源对孢子的萌发促进作用差异不显著，酵母膏和牛
肉膏 的 效 果 最 明 显，萌 发 率 分 别 为 ９７．１０％ 和
９５．５６％，尿素对病原菌分生孢子的萌发有抑制作用，
萌发率仅为４９．０９％（图１６）。
２．５．８ 分生孢子致死温度的测定 当处理温度
≥４８℃时，该菌分生孢子不能萌发，即病原菌分生孢子
致死温度是４８℃，１０ｍｉｎ（图１７）。
图１５ 培养基对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１５ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿犲犱犻狌犿狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
１：ＰＤＡ；２：葡萄糖蛋白胨培养液；３：ＣＺ；４：ＯＭＡ；５：ＰＳ；６：ＣＭＡ；７：
ＰＳＡ；８：Ｖ８；９：ＣＡ；１０：真菌生理培养液；１１：苜蓿汁液培养液；１２：马铃
薯淀粉培养液；１３：Ｂｉｌａｉ’ｓ；１４：ＶＢＣ；１５：ＣＫ。１：ＰＤＡ；２：Ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ｐｅｐｔｏｎｅｍｅｄｉｕｍ；３：ＣＺ；４：ＯＭＡ；５：ＰＳ；６：ＣＭＡ；７：ＰＳＡ；８：Ｖ８；
９：ＣＡ；１０：Ｆｕｎｇｕｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｄｉｕｍ；１１：Ａｌｆａｌｆａｌｅａｆｊｕｉｃｅｍｅｄｉ
ｕｍ；１２：Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈｍｅｄｉｕｍ；１３：Ｂｉｌａｉ’ｓ；１４：ＶＢＣ；１５：ＣＫ．
图１６ 碳源／氮源对分生孢子萌发的影响
犉犻犵．１６ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犮犪狉犫狅狀狊狅狌狉犮犲／狀犻狋狉狅犵犲狀狊狅狌狉犮犲
狅狀狊狆狅狉犲犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀
１：葡萄糖／蛋白胨；２：果糖／牛肉膏；３：半乳糖／酵母膏；４：甘露醇／尿
素；５：麦芽糖／ＫＮＯ３；６：蔗糖／ＮＨ４Ｃｌ；７：淀粉／硫酸铵；８：ＣＫ（碳源）／
ＣＫ（氮源）。１：Ｇｌｕｃｏｓｅ／ｐｅｐｔｏｎｅ；２：Ｆｒｕｃｔｏｓｅ／ｍｅａｔｅｘｔ；３：Ｌａｃｔｏｓｅ／ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ；４：Ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｃａｒｂａｍｉｄｅ；５：Ｍａｌｔｏｓｅ／ＫＮＯ３；６：Ｓｕｃｒｏｓｅ／ＮＨ４Ｃｌ；
７：Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ／（ＮＨ４）２ＳＯ４；８：ＣＫ（ｃａｒｂｏｎ）／ＣＫ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）．
３ 结论与讨论
图１７ 分生孢子致死温度
犉犻犵．１７ 犉犪狋犪犾狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅犳狊狆狅狉犲
至今，引起苜蓿根腐病的病原菌各说不一，究其
原因，一是苜蓿根腐病的病原因不同生态条件的调查
采样而异，但大多数与镰刀菌有关，国内外报道的镰刀
菌病原总计１３种之多［１１］；二是病原的侵染具有复杂
性，由镰刀菌一个种或多个种混合侵染造成［２１］。虽然
对不同分离物复合接菌有共同的认知，但系统的研究
鲜有报道，侧面说明多病原菌的复合侵染引发苜蓿根
腐病的研究有待进一步深入。
本研究结合形态学鉴定和ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析，
鉴定内蒙古赤峰巴雅尔草业基地的紫花苜蓿根腐病的
致病菌为拟枝孢镰刀菌，从该菌生长的ｐＨ 范围和温
度范围看出，该菌是一种具较强适应性、耐热性的强抗
６９ 草 业 学 报 第２４卷
逆性致病菌，能够利用多种培养基、碳氮源进行生长和繁殖，加之孢子萌发快等特点，该致病菌对苜蓿的危害性更
大［２２］；从致病性测定中人工接种拟枝孢镰刀菌的中苜一号紫花苜蓿发病率（５ｄ）和死亡率（１０ｄ）分别为９６．３％
和９７．５％，可见其具有较强的致病性；另外苜蓿根腐病是土传病害，根部发病造成大量植株迅速枯死。综上，安
全高效的预防措施今后也需进一步加强研究。
本文所研究的拟枝孢镰刀菌系内蒙古自治区苜蓿种植区首次报道该种可以侵染苜蓿，并在国内首次详细研
究该病原菌的生物学特性。本研究明确了拟枝孢镰刀菌引起的苜蓿根病的症状及其生物学特性，为生产中诊断
和防治苜蓿根腐病提供了理论依据，但有关品种抗病性鉴定及大田防治方法等还需进一步研究。
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檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵
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学引文数据库来源期刊和全国优秀农业期刊，并被《中国核心期刊（遴选）数据库》、《万方数据－数字化期刊群》、《中文电子期刊资
料服务库》、《中国科技论文与引文数据库》、《中国学术期刊综合评价数据库》、《中国期刊全文数据库》、《中国学术期刊（光盘版）》、
《中国期刊网》、《中国知网》、《中国生物学文献数据库》和《中国生物学文摘》等多种数据库及二次文献收录。２００８年影响因子已达
１．０００以上，在２０１１年公布的１９９８种中国科技核心期刊中综合排名为３７０位，其中影响因子排第９４位；２０１３年在中国科技期刊
ＣＳＣＤ影响因子３００名排行表中位居第１００位。双月刊，大１６开Ａ４版本，１２０页，国内外公开发行，每册定价１５．００元，全年共９０．
００元。国内统一刊号ＣＮ１５１３４４／Ｓ，国内邮发代号１６３２，全国各地邮局（所）均可订阅，错过订期可直接向本刊编辑部补订。
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