全 文 ：书多年生黑麦草犘５犆犛基因的定点突变
及其在拟南芥中的转化
曹丽１，２，义鸣放１，孙振元２，韩蕾２，巨关升２，马欣荣３
（１．中国农业大学观赏园艺与园林系，北京１００１９３；２．中国林业科学研究院林业研究所／国家林业局林木培育
重点实验室，北京１０００９１；３．中国科学院成都生物研究所，四川 成都６１００４１）
摘要：在前期克隆获得犔狆犘５犆犛基因的全长ｃＤＮＡ序列基础上，采用ＰＣＲ扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶
基因犘５犆犛的定点突变体系进行了探讨，并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点
序列设计一对引物，使用Ｐｆｕ高保真ＤＮＡ聚合酶和超级感受态细胞ＤＭＴ，通过ＰＣＲ扩增，获得含有所要突变位
点的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ，定向克隆入真核表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００中，转化拟南芥验证基因功能。结果表明，预期位
点上发生了突变，犔狆犘５犆犛编码的第１２８位密码子已由苯丙氨酸残基（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，简称Ｐｈｅ或Ｆ）变为丙氨酸残
基（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａｌａ），证明用ＰＣＲ技术已成功地使犔狆犘５犆犛基因发生定点突变。转基因拟南芥Ｔ１ 代植株进行ＰＣＲ
和ＲＴ－ＰＣＲ检测，获得４个转基因阳性株系。拟南芥Ｔ２ 代植株经１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理７ｄ后，转基因株系脯
氨酸含量分别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ，显著高于野生型株系的２５８１μｇ／ｇＦＷ。说明转基因株系能积累更多地
脯氨酸。
关键词：多年生黑麦草；定点突变技术；脯氨酸合成酶基因；农杆菌转化
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０３．５３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０２４２０６
△１吡咯啉５羧酸合成酶（Ｐ５ＣＳ）是双功能酶，催化植物中经谷氨酸合成脯氨酸的前２步反应，胁迫条件下
脯氨酸的合成不仅受Ｐ５ＣＳ转录激活的调节，也受到该途径终产物脯氨酸的反馈抑制［１］。Ｈｏｎｇ等［２］研究表明，
ＶａＰ５ＣＳ上的１２９位的苯丙氨酸（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，简称Ｐｈｅ或Ｆ）突变为丙氨酸（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａｌａ）后ＶａＰ５ＣＳ的反馈
抑制被消除，脯氨酸对 Ｐ５ＣＳ活性５０％ 的抑制量从野生型６ｍｍｏｌ／Ｌ 提高到突变型 Ｐ５ＣＳＦ１２９Ａ 的９６０
ｍｍｏｌ／Ｌ，转突变Ｐ５ＣＳ基因的烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）个体脯氨酸含量是转野生型Ｐ５ＣＳ基因的２倍还多［３］，
在干旱和盐胁迫条件下，根的生长量增加并促进了花的发育。证明Ｐ５ＣＳ的反馈调节在控制植物脯氨酸水平上
扮演着重要的角色［４］。
中国林业科学研究院林业研究所生理生化实验室将犔狆犘５犆犛与其他植物的同源基因进行比对和分析后，推
测ＬｐＰ５ＣＳ蛋白上１２８位的Ｐｈｅ是这个基因的反馈抑制位点。基于此，笔者以先前克隆的犔狆犘５犆犛基因为靶基
因，将多年生黑麦草Ｐ５ＣＳ蛋白上１２８位的Ｐｈｅ定点突变为Ａｌａ，采用双酶切方法构建了多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿
狆犲狉犲狀狀犲）犘５犆犛犉１２８Ａ基因真核表达载体，并通过农杆菌ＧＶ３１０１介导，将犔狆犘５犆犛犉１２８Ａ基因转入拟南芥（犃狉
犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中，并对其进行初步的功能鉴定，为采用遗传工程手段创制抗逆性草坪草品种提供参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本实验于２００９－２０１０年在北京进行，野生拟南芥 （Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００质粒、根癌农杆菌
菌株ＧＶ３１０１由中国农业大学辛海波博士惠赠；重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ犔狆犘５犆犛为中国林业科学研究院林业研究
所生理生化实验室克隆并保存。
１．２ 方法
１．２．１ 引物设计及突变基因的获得 引物设计采用ＥａｓｙＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ试剂盒说明并略有改动。设计引
２４２－２４７
２０１１年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１００２０４；改回日期：２０１００３２９
基金项目：国家十一五科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９２）和国家“８６３”项目（２００６ＡＡ１００１０９）资助。
作者简介：曹丽（１９７４），女，吉林长春人，讲师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｃａｏｌｉ１９７４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｍｆａｎｇ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；ｓｕｎｚｙ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
物对ＰＦ１２８／ＰＲ１２８，以ｐＭＤ１９Ｔ犔狆犘５犆犛质粒ＤＮＡ（１０ｎｇ／Ｌ）为模板，进行ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）定
点突变反应。取扩增ＰＣＲ产物连接转化到感受态细胞ＤＭＴ，挑取单斑进行菌落ＰＣＲ鉴定并测序验证。
１．２．２ 多年生黑麦草Ｐ５ＣＳＦ１２８Ａ表达载体的构建及鉴定 通过ＰＣＲ扩增以及测序鉴定，筛选出正向插入的
阳性克隆ｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛犉１２８Ａ。用犛犿犪犾Ⅰ和犛犪犾Ⅰ限制性内切酶分别对ｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ和ｐＣＡＭ
ＢＩＡ１３００进行酶切反应。回收纯化后，１６℃连接反应过夜，转化大肠杆菌，筛选抗性质粒［５，６］，用犛犪犾Ⅰ／犛犿犪犾Ⅰ进
行双酶切鉴定，将含有目的片段的克隆测序。将重组子ｐＣＡＭＢＩＡ１３００犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ 导入农杆菌感受态
ＧＶ３１０１。
１．２．３ 拟南芥的转化及抗性筛选 将拟南芥的花序浸入侵染液中３０ｓ，避光保湿２４ｈ后置于正常光照条件下
生长，直到开花结荚收集种子。将不同株系的转基因拟南芥连续自交，用Ｔ２ 代植株作表型和功能分析。
１．２．４ 转基因拟南芥的分子生物学鉴定 在得到的５个Ｔ１ 株系中，设计引物ＯＥＡ：５′ＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＣ
ＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＴ３′和ＯＥＦ：５′ＴＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴ３′进行ＰＣＲ反应检测，预期片段
为２１５１ｂｐ。以ｃＤＮＡ作为模板，以β犃犮狋犻狀基因作为内参（引物序列ＡｃｔＦ：５′ＣＴＡＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＴＧＧＡＣＴ
ＴＧＧＣＡ３′和 ＡｃｔＦ：５′ＡＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＡＣＧ３′）。设计引物 ＨＰ１（５′ＧＣＴＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣ
ＣＡＴＴＧＴＣ３′）和 ＨＰ２（５′ＧＡＣＧＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧ３′），进行ＲＴＰＣＲ反应检测，半定量ＰＣＲ检测转
基因植株的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ的表达量。
１．２．５ 转基因拟南芥植株游离脯氨酸含量的测定 选择经过ＲＴＰＣＲ检测的Ｔｐ１、Ｔｐ３转基因及野生型株系
进行脯氨酸含量的测定，测定方法参照Ｂａｔｅｓ［７］茚三酮测定法。测定结果用Ｅｘｃｅｌ和ＤＰＳ软件进行分析。
２ 结果与分析
２．１ 引物设计
为了对犔狆犘５犆犛的第１２８位编码氨基酸Ｐｈｅ的功能进行分析，在不改变氨基酸总数的前提下，用结构简单
的Ａｌａ将其替换。图１序列分析表明，将突变位点ＧＣ放在引物１２８Ｒ５′端，２条引物的重叠区域为１５个碱基，延
伸区为１０个碱基，以保证２个片段的重叠区较大，而使引物的长度最小。
图１ 突变位点及两侧序列
犉犻犵．１ 犜犺犲犿狌狋犪狀狋狊犻狋犲犪狀犱犳犾犪狀犽犻狀犵狊犲狇狌犲狀犮犲狊
方框部分表示欲突变的位点Ｆｒａｍｅｓｈｏｗｓｔｈｅｓｉｔｅｆｏｒｍｕｔａｔｉｏｎ
２．２ 阳性菌落鉴定突变基因的获得
将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接，转化ＤＭＴ感受态细胞。挑取白色克隆，进行菌落ＰＣＲ分析，引物为ＯＥＡ和
ＯＥＦ。扩增结果如图２所示：在２０００ｂｐ的上方有一条大约２１５１ｂｐ的片段。提取阳性菌落的质粒ＤＮＡ，用载
体上的犛犪犾Ⅰ／犛犿犪犾Ⅰ位点进行酶切分析（犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ序列不含此位点），反应成分及反应时间如１．２．２，电
泳检测，质粒ＤＮＡ已被切成２个部分，大片段与Ｔ载体大小一致，小片段与目的片段大小相似，确认目的片段已
经插入到Ｔ载体中。通过ＰＣＲ扩增，目的条带清晰，大小与野生型犔狆犘５犆犛的扩增结果一致。
２．３ 突变犔狆犘５犆犛的序列分析
将构建在Ｔ载体上的突变犔狆犘５犆犛进行序列分析，测序结果与野生型犔狆犘５犆犛比对表明，第１２８位编码苯
丙氨酸的ＴＴＣ已成功突变成编码丙氨酸的ＧＣＣ，而其他位点未发生任何改变（图３）。
３４２第２０卷第１期 草业学报２０１１年
２．４ 转基因拟南芥阳性植株的ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ鉴定
图２ 犘犆犚及酶切产物检测结果
犉犻犵．２ 犃犵狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犘犆犚犪狀犱犛犪犾Ⅰ／犛犿犪犾Ⅰ
犱狅狌犫犾犲犱犻犵犲狊狋犲犱狆狉狅犱狌犮狋狊
Ａ：１代表质粒ｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛的扩增产物，Ｍ 代表 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
（ＤＬ２０００ｐｌｕｓ）；箭头所示为目标片段；Ｂ：１和２－３分别代表质粒
ｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛犉１２８Ａ的扩增产物和酶切产物，Ｍ 代表ＤＮＡｍａｒｋｅｒ
（ＤＬ２０００ｐｌｕｓ）；箭头所示为目标片段Ａ：１ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ
ｏｆｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛，ＭｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＤＮＡｍａｒｋｅｒ，ａｎｄａｒｒｏｗｓｓｈｏｗｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｓ；１ａｎｄ２－３ｉｎＢｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｎｄ犛犪犾
Ⅰ／犛犿犪犾ⅠｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛犉１２８Ａ，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ．ＭｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ，ａｎｄａｒｒｏｗｓｓｈｏｗｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇ
ｍｅｎｔｓ
以开花期的拟南芥为材料，采用渗透法把基因
犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ转入花蕾，收集转基因当代植株的种
子，在含潮霉素（Ｈｙｇ，５０ｍｇ／Ｌ）的１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培养基中筛选，对抗性植株进行分子水
平检测。结果表明，５株 ＰＣＲ 检测为阳性。ＲＴ－
ＰＣＲ检测转基因植株的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ 的表达量。
结果表明，４个转基因株系中靶基因均高水平表达，１
个转基因株系未检测到外源靶基因的转录本，说明靶
基因在该转基因系植株中发生基因沉默现象。因此最
终获得４个转基因的拟南芥独立株系，分别命名为
Ｔｐ１、Ｔｐ２、Ｔｐ３和Ｔｐ４（图４Ａ，Ｂ）。
２．５ 过量表达的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ转基因拟南芥（Ｔ２
代）植株的形态观察
Ｔ２ 代幼苗在添加Ｈｙｇ的培养基上的生长情况如
图５Ａ。野生幼苗生长细弱并且不能正常生根，继续培
养会黄化死亡。而转基因株系中７５％左右植株能正
常生根，生长健壮，２５％左右Ｔ２ 代幼苗在抗性筛选时
不能正常生根，说明转基因拟南芥Ｔ２ 代株系出现基
因和性状分离。
图３ 突变后的测序结果
犉犻犵．３ 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵犪犳狋犲狉犿狌狋犪狋犻狅狀
划方框的位置表示苯丙氨酸残基（ＴＴＣ）突变为丙氨酸残基（ＧＣＣ）Ｔｈｅｆｒａｍｅｓｈｏｗｓｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｆｒｏｍｆｒｏｍｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅ（Ｐｈｅｎｙｌａｌ
ａｎｉｎｅ，ＴＴＣ）ｉｎｔｏａｌａｎｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓ（Ａｌａｎｉｎｅ，ＧＣＣ）
图５Ｂ为播种３周后，Ｔ２ 代过量表达的转基因Ｔｐ３株系和野生对照株系的形态观察，过量表达的转基因植
株生长旺盛，莲座叶片肥大，而野生对照植株莲座叶片细小（数据未列出），这与Ｚｈａｎｇ等［３］研究结果一致。说明
转犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ基因促进了转基因拟南芥生物量的增加。
２．６ 转基因拟南芥植株的脯氨酸含量测定
将２．５培养７ｄ能够成活的Ｔ２ 代转基因Ｔｐ１和Ｔｐ３株系幼苗，与同期播种的野生型拟南芥幼苗（不加Ｈｙｇ
筛选），转移到含有１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（不含Ｈｙｇ）的 ＭＳ培养基上继续培养７ｄ。按照１．２．５的方法测定不同转
基因株系和野生型植株全苗脯氨酸含量（图６）。方差分析显示，转基因株系脯氨酸含量显著高于野生型植株
４４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
图４ 转犔狆犘５犆犛犉１２８犃基因犘犆犚检测
犉犻犵．４ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱狑犻犾犱狋狔狆犲犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狊犲犲犱犾犻狀犵狊
Ａ：Ｔ２代转基因植株ＤＮＡ－ＰＣＲ检测，Ｍ代表ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００），ＣＫ１代表清水对照，ＣＫ２代表质粒ＤＮＡ－ＰＣＲ检测；Ｂ：Ｔ２ 代转基因植
株ＲＴ－ＰＣＲ检测，ＷＴ代表野生植株，Ｔｐ１～Ｔｐ４代表转基因植株 Ａ：ＤＮＡ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，ＭｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒ，ＣＫ１ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｗａｔｅｒｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，ＣＫ２ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅＤＮＡ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＭＤ１９犔狆犘５犆犛；Ｂ：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，ＷＴｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔ，Ｔｐ１－Ｔｐ４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔＴ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
图５ 转犔狆犘５犆犛犉１２８犃基因和野生型拟南芥幼苗的生长
犉犻犵．５ 犌狉狅狑犻狀犵狊狋犪狋狌狊狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱狑犻犾犱狋狔狆犲犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狊犲犲犱犾犻狀犵狊
Ａ：在５０μｇ／ＬＨｙｇ抗性培养基上的生长情况Ｇｒｏｗｉｎｇｓｔａｔｕｓｏｎｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ５０μｇ／ＬＨｙｇ；Ｂ：Ｔ２ 代转基因Ｔｐ３株系和野生型幼苗生长情况
犔狆犘５犆犛Ｆ１２８ＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴ２ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
（犘＜０．０１），表明转犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ基因拟南芥植株比
图６ １００犿犿狅犾／犔犖犪犆犾处理下转犔狆犘５犆犛犉１２８犃基因
和野生型拟南芥幼苗的脯氨酸含量
犉犻犵．６ 犘狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔狆犘５犆犛犉１２８犃
犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犜２狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱狑犻犾犱狋狔狆犲犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊
狊犲犲犱犾犻狀犵狊狋狉犲犪狋犲犱狑犻狋犺１００犿犿狅犾／犔犖犪犆犾
野生型能合成更多脯氨酸，犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ在转基因
植株体内被正常表达并行使催化功能。在正常培养条
件下，Ｔｐ１和Ｔｐ３之间差异不显著，但它们的脯氨酸
含量显著高于野生株系，其中Ｔｐ３株系脯氨酸含量最
高，为１５８０μｇ／ｇＦＷ；１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理
下，Ｔｐ１和Ｔｐ３株系之间的脯氨酸含量差异显著，分
别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ，均显著高于野生型株
系。暗示转基因株系能积累更多的脯氨酸，与 Ｈｏｎｇ
等［２］研究结果相同。这也预示转犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ基因
植株可能表现出更强的对渗透胁迫的耐性。
３ 结论与讨论
在 ＤＮＡ 序 列 上 进 行 定 点 突 变 （ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）是研究蛋白质的结构和功能以及蛋白质
之间的相互作用的重要手段［８］。Ｌｉ等［９］以含有目的
基因的质粒为模板，以含突变位点的２个反向重叠引物起始ＰＣＲ扩增，扩增产物不需连接反应直接转化大肠杆
菌，利用细胞内表达的ＤｐｎＩ消化去除原始模板质粒的干扰。但该方法使用的引物片段反向重叠区域大，在ＰＣＲ
过程中易形成引物二聚体，致使ＰＣＲ扩增效率和所得产物阳性率均非常低。为此，利用北京全式金生物技术公
５４２第２０卷第１期 草业学报２０１１年
司ＥａｓｙＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ试剂盒内配套的ＤＭＴ超敏感受态细菌得到了足够的菌落［１０］。将构建在Ｔ载体上
的突变犔狆犘５犆犛进行序列分析，测序结果与野生型犔狆犘５犆犛比对表明：第１２８位编码苯丙氨酸的ＴＴＣ已成功突
变成编码丙氨酸的ＧＣＣ，而其他位点未发生任何改变。ＰＣＲ扩增效率和所得产物阳性率均非常高。
大量研究表明，脯氨酸积累与植物对干旱和盐胁迫适应性之间有显著的正相关［１１，１２］。将犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ基
因插入表达载体的３５Ｓ启动子下游，成功地将犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ转入拟南芥中，实现了基因的高效表达，本试验结
果表明，在正常和盐处理条件下，Ｔｐ１和Ｔｐ３转基因株系脯氨酸含量的平均值是野生型的２．７２和２．８３倍，由于
犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ基因的转入，明显提高了转基因拟南芥植株脯氨酸的积累速度。脯氨酸含量显著提高，预示着转
目的基因犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ后，可提高转基因植物抗逆性［１３］。
目前转基因株系正进行连续自交筛选，将进行抗逆性功能验证。总之，犔狆犘５犆犛的定点突变为进一步研究多
年生黑麦草在渗透胁迫过程中脯氨酸的作用机制奠定了基础。
参考文献：
［１］ ＫａｖｉＫｉｓｈｏｒＰＢ，ＳａｎｇａｍＳ，ＡｍｒｕｔｈａＲＮ，犲狋犪犾．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｕｐｔａｋｅａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎ
ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ：Ｉｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，８８：４２４４３８．
［２］ ＨｏｎｇＺ，ＬａｋｋｉｎｅｎｉＫ，ＺｈａｎｇＺ，犲狋犪犾．ＲｅｍｏｖａｌｏｆｆｅｅｄｂａｃｋｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆΔ１ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄｐｒｏｌｉｎｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｓｆｒｏｍｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２２：１１２９１１３６．
［３］ ＺｈａｎｇＣＳ，ＬｕＱ，ＶｅｒｍａＤＰＳ．Ｒｅｍｏｖａｌｏｆｆｅｅｄｂａｃｋｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｄｅｌｔａ１ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ａｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｓｉｎｇｔｈｅｆｉｒｓｔｔｗｏｓｔｅｐｓｏｆｐｒｏｌｉｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，２７０：
２０４９１２０４９６．
［４］ ＣｈｏｕｄｈａｒｙＮＬ，ＳａｉｒａｍＲＫ，ＴｙａｇｉＡ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆΔ１ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅｄｕｒｉｎｇｄｒｏｕｇｈｔｉｎｒｉｃｅ（犗狉狔
狕犪狊犪狋犻狏犪Ｌ．）［Ｊ］．ＩｎｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２００５，４２：３６６３７０．
［５］ ＣｌｏｕｇｈＳＪ，ＢｅｎｔＡＦ．Ｆｌｏｒａｌｄｉｐ：Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．Ｔｈｅ
ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６（６）：７３５７４３．
［６］ 贾小霞，张金文，王汉宁，等．抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究［Ｊ］．草业学报，
２００９，１８（１）：８６９３．
［７］ ＢａｔｅｓＬＳ．Ｒａｐｉｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｐｒｏｌｉｎｅｆｏｒｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｏｉｌ，１９７３，３９：２０５２０７．
［８］ ＴａｎＭ，ＸｉａＭ，ＣａｏＳ，犲狋犪犾．ＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆａＧＩＩ２４ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｗｉｔｈＨＢＧＡｒｅｃｅｐｔｏｒｓｂｙｓｉｔｅｄｉ
ｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，２２（１３）：２５８７２５９１．
［９］ ＬｉＪ，ＬｉＣ，ＸｉａｏＷ，犲狋犪犾．ＳｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｓｉｓｂｙｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄＤｐｎＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｔｅｍｐｌａｔｅｉｎ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪
犮狅犾犻［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，３７３：３８９３９１．
［１０］ ＨｏｇｒｅｆｅＨＨ，ＣｌｉｎｅＪ，ＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄＧＬ，犲狋犪犾．Ｃｒｅａｔｉｎｇｒａｎｄｏｍｉｚｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｌｉｂｒａｒｉｅｓｗｉｔｈｔｈｅｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅｍｕｌｔｉｓｉｔｅｄｉ
ｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２，３３（５）：１１５８１１６５．
［１１］ 燕丽萍，夏阳，梁慧敏，等．转犅犃犇犎 基因苜蓿Ｔ１代遗传稳定性和抗盐性研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（６）：６５７１．
［１２］ 赵宇玮，王英娟，步怀宇，等．ＡｔＮＨＸ１基因对菊苣的转化和耐盐性研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（３）：１０３１０９．
［１３］ 刘磊，陈立波，李志勇，等．晚秋温度对苜蓿地上部游离脯氨酸、可溶性糖和ＰＯＤ活性的影响［Ｊ］．草业科学，２００９，
２６（１０）：８９９３．
６４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
犛犻狋犲犱犻狉犲犮狋犲犱犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊狅犳狋犺犲犔狆犘５犆犛犵犲狀犲狅犳犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲
犪狀犱犻狋狊狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犻狀犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪
ＣＡＯＬｉ１，２，ＹＩＭｉｎｇｆａｎｇ１，ＳＵＮＺｈｅｎｙｕａｎ２，ＨＡＮＬｅｉ２，ＪＵＧｕａｎｓｈｅｎｇ２，ＭＡＸｉｎｒｏｎｇ３
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｎａｍｅｎｔａｌＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ＼Ｋｅｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
１０００９１，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｈｅｎｇｄｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ
ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＦｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅ犔狆犘５犆犛ｇｅｎｅ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅ
ｕｓｅｄａｓａｂａｓｉｓｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅ犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲ｐｒｏｌｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅ
犔狆犘５犆犛．Ｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｕｓｅｄｉｎ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｖｅｒｉｆｙａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｕ
ｔａｎｔｇｅｎｅ．ＡｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｗａｓｕｓｅｄｗｉｔｈＰｆｕｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｓＤＭＴｉｎＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａｍｕｔａｎｔｇｅｎｅｗｈｉｃｈｃｏｎ
ｔａｉｎｅｄｔｈｅｄｅｓｉｒｅｄｍｕｔａｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓｗａｓｄｉｒｅｃｔｌｙｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＣＡＭＢＩＡ１３００，ｆｏｒ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｏ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｆｏｒｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｌｏｃｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｈａｄｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎ
犔狆犘５犆犛ａｎｄｃｈａｎｇｅｄｔｈｅｅｎｃｏｄｉｎｇｃｏｄｏｎＮｏ．１２８ｆｒｏｍａｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅ（ＰｈｅｏｒＦ）ｉｎｔｏａｎａｌａｎｉｎｅｒｅｓｉ
ｄｕｅ（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａｌａ）．ＴｈｉｓｗａｓｐｒｏｏｆｔｈａｔＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｄｓｕｃｃｅｅｄｅｄｉｎｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅ
犔狆犘５犆犛ｇｅｎｅ．ＦｏｕｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｐｌａｎｔｓｂｙ
ＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅＴ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒ
７ｄａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＴ１ａｎｄＴ２ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅ４２６２ａｎｄ５６２３μｇ／ｇＦＷｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎｔｈｅ２５８１μｇ／ｇＦＷｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓｃａｎａｃｃｕｍｕｌａｔｅｍｏｒｅｐｒｏ
ｌｉｎｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲；ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｐｒｏｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７４２第２０卷第１期 草业学报２０１１年