全 文 ：紫花苜蓿犈犕犛突变体库的构建和形态学性状鉴定
夏曾润，杜凤凤，李，张吉宇，刘勇，霍雅馨，孔令芳
（草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院 ，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：通过不同浓度的ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）溶液诱变处理紫花苜蓿种子，系统分析了ＥＭＳ对 Ｍ１ 代种子萌发和生
长的影响，对 Ｍ１ 代突变植株的形态学性状进行了初步鉴定。结果表明，ＥＭＳ处理抑制了 Ｍ１ 代种子的最终发芽
率、发芽指数和胚根胚芽长度。初步鉴定了 Ｍ１ 代１０３９个单株的形态学性状，共获得３７８份叶（不含叶形和叶数）、
株高、分枝数、株型以及其他性状发生变异的突变株，其中叶色、分枝数、株型和其他性状突变体依次为２１５，４０，９５
和２８株，突变率依次为２０．６９％，３．８５％，９．１４％，２．６９％。本研究初步构建的紫花苜蓿ＥＭＳ突变群体为苜蓿功能
基因组研究、遗传改良及育种奠定了基础。
关键词：紫花苜蓿；ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）；半致死剂量；突变体库；变异性状
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０１；Ｑ９４４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０２０２１５０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０２２６　　
　　植物突变体库的构建是研究功能基因组学的重要基础［１］。拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）［２］、水稻（犗狉狔狕犪
狊犪狋犻狏犪）［３］等模式植物和小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［４］、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［５］、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）［６］等粮食经济作物
突变体库的建立在研究其功能基因和阐明基因功能方面起了重要作用。采用物理、化学等诱变方法构建饱和基
因突变群体，进而通过突变体分析鉴定基因功能，是功能基因组学研究最直接、最有效的方法［７］。ＥＭＳ（甲基磺
酸乙酯）是最常用且有效的化学诱变剂之一，它使鸟嘌呤烷基化产生Ｏ６烷基鸟嘌呤，直接与胸腺嘧啶错配，可
导致点突变［８９］，生物学上广泛运用ＥＭＳ诱变来创建突变体库和育种［１０］。韩锁义等［１１］利用ＥＭＳ对“南农８６４”
大豆种子进行诱变，构建了大豆品种的突变体库，并在 Ｍ３ 代获得了蛋白质和含油量变化明显的优质材料。汪
念［１２］２００９年利用甘蓝型油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊）半冬性品种宁油７号的一个ＤＨ 系作为野生型亲本材料，通过
ＥＭＳ诱变剂诱变后获得了大型突变体库，０．６％和０．３％的突变体库包含Ｍ２ 单株分别为７１１０和３９２６，共发现表
型变异突变体１１０３６株。Ｃｈｉｕ等［１３］利用ＥＭＳ构建的拟南芥突变体库，筛选到ＴＯＲＮＡＤ０２基因的不同变异类
型，确定了该基因在花的心皮发育过程中起到的重要作用。Ｋｕｒａｐａｒｔｈｙ等［１４］利用二倍体小麦构建的ＥＭＳ突变
体库，筛选到单蘖突变体并且成功地定位了控制分蘖的ｔｉｎ＿３基因在染色体的位置，开辟了提高谷类作物产量的
新方向。
苜蓿属植物生态类型丰富［１５１６］，但功能基因组学研究仍处于起步阶段，目前仅在模式植物截形苜蓿（犕犲犱犻
犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）建立了ＥＭＳ突变体库［１７１８］。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）素有“牧草之王”和“饲料皇后”的美
誉［１９２０］，是产业化发展前景良好的优质豆科牧草，然而目前，国际上尚未见报道创建的紫花苜蓿突变体库。因此，
本研究以甘农３号紫花苜蓿种子为材料，构建了其ＥＭＳ突变体库，并对其变异形态学性状进行了初步鉴定，为
深入研究紫花苜蓿品种改良、功能基因组等方面提供基础材料。
１　材料与方法
１．１　供试材料
试验用甘农３号紫花苜蓿种子由甘肃农业大学曹致中教授提供。试验于２０１０年１０月－２０１１年１２月在兰
第２３卷　第２期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２１５－２２２
２０１４年４月
收稿日期：２０１２０３１２；改回日期：２０１２０５２１
基金项目：国家自然科学基金（３１１０１７５９），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（ＧＮＳＷ２０１１１６）和兰州大学中央高校基本科研费自由探
索项目（ｌｚｕｊｂｋｙ２０１３８７）资助。
作者简介：夏曾润（１９９０），男，陕西岚皋人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｃｒ０９＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｙ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
州大学草地农业科技学院智能温室进行，ＥＭＳ购自ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司（Ｍ０８８０１０Ｇ）。
１．２　ＥＭＳ诱变处理
精选５０００粒甘农３号种子，浓硫酸处理５ｍｉｎ以打破硬实，蒸馏水冲洗５次。种子于４℃冰箱磷酸缓冲液
（１００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）预浸１２ｈ。用磷酸缓冲液配置浓度分别为０，０．２％，０．４％，０．６％，０．８％，１．０％，１．２％，
１．６％，２．０％（ｖ／ｖ）的ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）溶液，使用不同浓度ＥＭＳ溶液室温黑暗条件下分别处理５００粒种子
１８ｈ，期间翻转轻摇，蒸馏水冲洗ＥＭＳ处理种子３次，每次３０ｍｉｎ，以去除残留的ＥＭＳ。每个浓度５次重复，每
个重复处理１００粒种子。
１．３　发芽试验
分别对９个浓度处理种子采用纸上发芽，每皿１００粒，每个处理４次重复。２０℃培养箱中培养，期间每天统
计发芽数，共统计１０ｄ。第４天各处理随机取１０个幼苗测定胚根长、胚芽长。根据发芽数和致死率，分析半致死
剂量。
最终发芽率（％）＝供试种子的发芽数／供试种子总数×１００
发芽指数（犌犐）＝∑犌狋／犇狋
式中，犌狋为在狋日的发芽数，犇狋为发芽天数。
１．４　植株突变性状鉴定
半致死剂量处理后的种子播种于花盆，盆栽土壤为耕种多年的熟成灰钙土，ｐＨ为８．７，肥力中等，温室适宜
条件培养，并统计成活总株数。植株生长期间，以野生型为对照观察突变形态学性状，分类统计鉴定，挂标牌标记
并拍照。
突变株频率（％）＝突变株数／成活总株数×１００
１．５　数据分析
实验数据采用Ｅｘｃｅｌ２０１０进行均值和标准差的计算及制图，ＳＰＳＳ１３．０软件进行单因素方差分析（ＯｎｅＷａｙ
ＡＮＯＶＡ）与多重比较数据分析。
２　结果与分析
图１　不同犈犕犛浓度处理对甘农３号紫花苜蓿
种子发芽率的影响
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳犈犕犛狅狀狊犲犲犱
犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狏犪狉．犌犪狀狀狅狀犵犖狅．３　
２．１　ＥＭＳ对 Ｍ１ 代萌发和生长的影响
不同浓度ＥＭＳ诱变处理的 Ｍ１ 代种子进行发芽
试验，分别统计发芽率、胚根长和胚芽长。结果表明，
ＥＭＳ对甘农３号紫花苜蓿种子的萌发有抑制作用，随
着ＥＭＳ浓度的增大，对种子萌发和幼苗生长的抑制
作用愈发显著。分析得甘农３号紫花苜蓿ＥＭＳ诱变
导致突变的半致死剂量浓度为１．２％，此时种子的最
终发芽率为４８％。
２．１．１　ＥＭＳ对种子发芽过程的影响　不同浓度
ＥＭＳ处理后，种子萌发均延缓，且延缓效应随剂量的
增大而增大。未处理对照种子的萌发率高峰出现在第
２天，达８９％；低浓度（０．２％～０．８％）的ＥＭＳ处理，
萌发率高峰出现在第３天；中浓度（１．０％和１．２％）的
ＥＭＳ处理，萌发率高峰分别出现在第４和５天；而高
浓度（１．６％和２．０％）ＥＭＳ处理则严重抑制了种子萌发，最终发芽率仅为９％（图１）。
２．１．２　ＥＭＳ对种子最终发芽率、发芽指数的影响　各处理的最终发芽率和发芽指数均显著低于对照（犘＜
０．０５），最终发芽率和发芽指数随ＥＭＳ浓度递增而逐步减小（图２）。低浓度（０．２％～０．８％）的ＥＭＳ处理后最终
发芽率均高于８０％；而高浓度（１．６％和２．０％）ＥＭＳ处理后最终发芽率仅为９％，发芽指数分别为８．２７和１０．１３；
６１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
浓度为１．２％的ＥＭＳ处理后，甘农３号紫花苜蓿种子的最终发芽率为４８％，发芽指数为２６．９８；可将此剂量作为
甘农３号紫花苜蓿种子ＥＭＳ处理的半致死剂量。
２．１．３　ＥＭＳ处理甘农３号种子对幼苗生长的影响　ＥＭＳ处理显著抑制了甘农３号紫花苜蓿幼苗胚根胚芽的
生长（图３），表现为随着ＥＭＳ浓度的不断增大抑制作用越强烈。胚芽长在ＥＭＳ浓度大于１．０％的处理间不显
著，但抑制作用极为明显，当浓度为２．０％时，幼苗胚芽长仅为０．１ｃｍ。浓度为１．２％ ＥＭＳ处理种子后幼苗胚
根、胚芽的平均长度分别为对照的１９．３５％和８．００％。
图２　犈犕犛对甘农３号种子发芽率（犃）、发芽指数（犅）的影响
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犈犕犛狅狀犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狉犪狋犲（犃）犪狀犱犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犻狀犱犲狓（犅）狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狏犪狉．犌犪狀狀狅狀犵犖狅．３
　图中不同小写字母表示犘＜０．０５水平差异显著。下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
　
２．２　Ｍ１ 代植株突变性状鉴定分析
图３　不同浓度犈犕犛处理对幼苗胚根和胚芽的影响
犉犻犵．３　犈犳犳犲犮狋狅犳犈犕犛狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅狀狊犲犲犱犾犻狀犵狊狉犪犱犻犮犾犲犪狀犱犵犲狉犿
　
对ＥＭＳ诱变后甘农３号紫花苜蓿群体 Ｍ１ 代
１０３９个单株的叶片、分枝数、株高以及开花时间等生
物学、形态学性状进行调查，结果表明，Ｍ１ 代的诸多
性状均发现了突变株。Ｍ１ 代１０３９个单株中有３７８株
（不含叶形突变）出现了一到多个性状的突变，发生突
变性状的植株达３６．３８％（表１）。
２．２．１　Ｍ１ 代植株性状突变　统计结果表明，突变群
体中共观察到２１５株 Ｍ１ 代的叶片颜色发生了变异，
突变频率达２０．６９％（表１）。共包括９种类型，分别表
现为黄白斑杂叶（图４ａ）、黑褐色叶片、叶红紫（图４
ｂ）、黄斑块（图４ｃ）、叶深绿色（图４ｄ）、灰绿色叶（图４
ｅ）、黄化苗（图４ｆ）、白化苗（图４ｇ）以及矮化并叶黄植株。其中叶片黄斑块（点）变异株数最多为７３株，突变率达
７．０３％。４株白化苗在幼苗期表型明显，不到成熟期就已经死亡，可能是白化苗缺乏叶绿素无法进行光合作用补
充营养的缘故。随着植株的不断生长，叶片颜色的部分突变性状逐渐消失，表型不再明显。除了叶片颜色的突变
之外，叶片还发生了形状的突变。共有６种突变类型，分别表现为卷曲皱缩叶（图４ｈ）、心形叶、圆形叶、针形叶、
叶缘锯齿和叶尖平缘（图４ｉ）。还观察到小叶数的突变性状，同一叶柄上出现４，５，６或７个小叶（图４ｊ）。
在突变群体中共观察到１３５株甘农３号紫花苜蓿的株型、分枝数发生了突变（表１），突变频率为１２．９９％。
单株分枝数包括２种典型，分别为多分枝和单枝。３２株多分枝紫花苜蓿植株占总成活植株的３．０８％，它们的平
均分枝数为１３。共有８个单株枝条未发生分枝。相同栽培条件下的对照组植株一般分６枝。紫花苜蓿植株的
枝条呈现类似三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）的匍匐茎（图４ｋ）、半匍匐（图４ｌ）突变性状，不表现为对照组正常的直
７１２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
立型，突变率分别为０．５８％和０．８７％，这样的突变单
株为研究优良放牧型紫花苜蓿品种提供了可能基因。
矮化苗（图４ｍ）突变率为６．６４％，极度矮化（抑制生
长）的植株（图４ｎ）有１１株。抑制生长植株、半矮化和
正常株同期内在相同环境条件下的自然生长高度呈现
明显的变化梯度（图４ｎ）。
２．２．２　株高、节间长突变性状　Ｍ１ 代紫花苜蓿中度
矮化株和极度矮化植株（抑制生长）的平均株高分别为
正常株高的５１．９％和１２．４％（表２），极度矮化苗的株
高仅为６．７ｃｍ。单株第５节间长随正常植株、半矮化
植株和抑制生长植株依次递减，并且表现为差异显著，
变化趋势跟株高一致。
２．２．３　其他性状突变　突变群体中观察到２８株早开
花植株，突变频率为２．６９％。部分花的颜色不表现为
正常的紫色，呈现出蓝色外缘花瓣（图４ｏ），浅蓝浅紫
镶嵌（图４ｐ），并且外层花瓣泛白色（图４ｑ）。
３　讨论
丰富的种质资源是作物育种和功能基因组学研究
的重要基础，突变体库为其提供了丰富的原始材
料［２１］。化学诱变剂诱发突变具有操作简便、突变频率
高等特点［９，２２］。目前，通过化学因素诱发构建突变体
库的方法已成为创建新型种质资源的一种有效手
段［２１］。在拟南芥［１３，２３］、油菜［１４］、大豆［２４］、小麦［１４，２５２６］、
表１　犕１ 代植株突变表型性状统计
犜犪犫犾犲１　犛狌犿犿犪狉狔狅犳狏犻狊犻犫犾犲狆犺犲狀狅狋狔狆犻犮犮犾犪狊狊犲狊狅犫狊犲狉狏犲犱犻狀
狋犺犲狆狉犲犾犻犿犻狀犪狉狔狊犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳犕１犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀
变异性状
Ｍｕｔａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅ
变异株数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｌａｎｔｓ
突变频率
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
（％）
叶色Ｌｅａｆｃｏｌｏｒ
黄斑块（点）Ｍａｃｕｌａｒｐｏｉｎｔ ７３ ７．０３
黑褐色斑点Ｄａｒｋｂｒｏｗｎｓｐｏｔｓ １２ １．１５
叶深绿色Ｌｅａｖｅｓｉｎｄａｒｋｇｒｅｅｎ １８ １．７３
黄白杂叶Ｙｅｌｏｗｍｉｓｃｅｌａｎｅｏｕｓｌｅａｖｅｓ ４５ ４．３３
叶红紫Ｒｅｄｖｉｏｌｅｔｌｅａｖｅｓ ２０ １．９２
灰绿色叶Ｃｅｌａｄｏｎｌｅａｖｅｓ １４ １．３５
白化苗 Ａｌｂｉｎｏｐｌａｎｔｌｅｔｓ ４ ０．３９
矮化并叶黄Ｄｗａｒｆｅｄａｎｄｙｅｌｏｗｌｅａｖｅｓ ２９ ２．７９
分枝数 Ｎｏ．ｏｆｂｒａｎｃｈ
多枝Ｐｏｌｙｔｏｍｙ ３２ ３．０８
单枝Ｓｉｎｇｌｅｂｒａｎｃｈ ８ ０．７７
株型Ｐｌａｎｔｔｙｐｅ
矮化Ｄｗａｒｆ ６９ ６．６４
抑制生长Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈ １１ １．０６
匍匐Ｓｔｏｌｏｎｓ ６ ０．５８
半匍匐 Ｈａｌｆｓｔｏｌｏｎｓ ９ ０．８７
合计Ｔｏｔａｌ ３５０ ３３．６９
水稻［２７］等植物中利用ＥＭＳ诱变技术构建了多个突变体库，并在育种和功能基因组学研究中发挥了极其重要的
作用。该技术还主要集中运用在对农作物的突变体库构建，并且技术已经相对比较成熟，但运用于牧草及饲料作
物构建突变体库的发展还处于起步阶段。本研究以甘农３号紫花苜蓿为试验材料，采用ＥＭＳ化学诱变的方法，
探究了诱变剂对 Ｍ１ 代种子萌发的影响以及突变植株性状的形态学表现，初步构建了紫花苜蓿ＥＭＳ诱变突变体
库。
表２　突变株与正常株株高、节间长比较
犜犪犫犾犲２　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狆犾犪狀狋犺犲犻犵犺狋犪狀犱犻狀狋犲狉狀狅犱犲犾犲狀犵狋犺犫犲狋狑犲犲狀犿狌狋犪狀狋狊犪狀犱狀狅狉犿犪犾狆犾犪狀狋
测量项
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｉｎｄｅｘ
株型
Ｐｌａｎｔｔｙｐｅ
均值
Ａｖｅｒａｇｅ（ｃｍ）
标准差
Ｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ
最大值
Ｍａｘ（ｃｍ）
最小值
Ｍｉｎ（ｃｍ）
株高
Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ
正常株Ｎｏｒｍａｌｐｌａｎｔ ５３．９４±６．７ａ ６．７１ ６７．０ ４５．０
矮化Ｄｗａｒｆ ２８．０６±２．８ｂ ２．８３ ３２．０ ２３．０
抑制生长Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈ ６．７１±１．４ｃ １．３７ ８．６ ４．５
节间长
Ｉｎｔｅｒｎｏｄｅｌｅｎｇｔｈ
正常株Ｎｏｒｍａｌｐｌａｎｔ ４．８３±０．９ａ ０．９０ ６．６ ３．６
矮化Ｄｗａｒｆ ２．３９±０．５ｂ ０．５５ ３．３ １．６
抑制生长Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈ １．５３±０．３ｃ ０．３１ ２．１ １．１
　注：同列不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
　Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５ｌｅｖｅｌ．
８１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
图４　观察到的 犕１ 代植株代表性突变表型
犉犻犵．４　犞犻狊犻犫犾犲狆犺犲狀狅狋狔狆犲狅犳狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲犕１犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋犿狌狋犪狋犻狅狀
　ａ：黄白斑点杂叶；ｂ：叶红紫；ｃ：黄斑块；ｄ：叶色深绿；ｅ：灰绿色叶；ｆ：黄化苗；ｇ：白化苗；ｈ：卷曲皱缩叶；ｉ：从左至右依次表现为叶缘锯齿、叶尖平缘、
针形叶、圆形叶、心形叶；ｊ：小叶数突变；ｋ：匍匐枝；ｌ：半匍匐；ｍ：矮化苗；ｎ：从左至右依次为抑制生长、半矮化、正常株；ｏ：蓝色外缘花瓣；ｐ：浅蓝浅紫
花；ｑ：花瓣外层泛白色。ａ：Ｙｅｌｏｗｍｉｓｃｅｌａｎｅｏｕｓｌｅａｖｅｓ；ｂ：Ｒｅｄｖｉｏｌｅｔｌｅａｖｅｓ；ｃ：Ｍａｃｕｌａｒｐｏｉｎｔ；ｄ：Ｌｅａｆｉｎｄａｒｋｇｒｅｅｎ；ｅ：Ｃｅｌａｄｏｎｌｅａｆ；ｆ：Ｅｔｉｏｌａｔｅｄ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；ｇ：Ａｌｂｉｎｏｐｌａｎｔｌｅｔｓ；ｈ：Ｃｕｒｌｙｃｒｉｍｐｅｄｌｅａｆ；ｉ：Ｆｒｏｍｌｅｆｔｔｏｒｉｇｈｔ，ｓｅｒｒａｔｅｄ，ｂｌａｄｅｔｉｐｆｌａｔｍａｒｇｉｎ，ｎｅｅｄｌｅｌｅａｆ，ｏｒｂｉｃｕｌａｔｅｌｅａｆ，ｈｅａｒｔｓｈａｐｅｄ
ｌｅａｆ；ｊ：Ｔｈｅｌｅａｆｌｅｔｍｕｔａｎｔｓ；ｋ：Ｓｔｏｌｏｎｓ；ｌ：Ｈａｌｆｓｔｏｌｏｎｓ；ｍ：Ｄｗａｒｆ；ｎ：Ｆｒｏｍｌｅｆｔｔｏｒｉｇｈｔ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈ，ｄｗａｒｆ，ｎｏｒｍａｌｐｌａｎｔ；ｏ：Ｂｌｕｅｒｉｍ
ｐｅｔａｌｓ；ｐ：Ｐａｌｅｂｌｕｅｌｉｇｈｔｐｕｒｐｌｅｆｌｏｗｅｒ；ｑ：Ｏｕｔｅｒｔｈｅｗｈｉｔｅｐｅｔａｌｓ．
　
本试验利用９个浓度ＥＭＳ诱变处理甘农３号紫花苜蓿种子，诱变后的效应表明，随着诱变剂量的增加诱变
效果明显，但浓度过高其萌芽率较低甚至致死。说明ＥＭＳ改变了甘农３号紫花苜蓿种子自身的发芽潜力，大大
降低了其活力。王幼平等［２８］研究表明，高浓度的ＥＭＳ使甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪）种子细胞受到较严重的生理损
伤，这种损伤在短期内尚不能完全修复，因此种子萌发过程中的幼苗生长和呼吸代谢降低，植株生长受抑制，从而
导致发芽率、发芽势和平均株高下降。经诱变处理的种子，在发芽时生长停滞或死亡，其原因是发芽时糖分相对
地比未处理的少［２９３０］。采用ＥＭＳ浸泡种子进行诱变处理时，处理浓度和时间不同则诱变效果不同，浓度过高、
处理时间越长，会产生严重损伤，失去选择机会；浓度较低，则不会产生明显的变异［３１３２］。因此，根据不同的实验
条件，选择最适宜的浓度和处理时间尤为重要［３３３４］。本试验最终确定紫花苜蓿的ＥＭＳ诱变半致死剂量为１．２％
（ｖ／ｖ），此时种子的最终发芽率为４８％。Ｗａｎｇ等［３５］利用ＴＩＬＬＩＮＧ技术确定甘南型油菜的ＥＭＳ诱变最适浓度
在０．３％～０．６％之间，与本研究所得结果存在差异，这可能跟处理材料和方式有关。
使用半致死剂量处理甘农３号紫花苜蓿种子，共获得 Ｍ１ 代植株１０３９株。经筛选鉴定，获得了一批具有叶
片颜色、分枝数、株型、叶形、株高以及早开花等一个至多个形态学突变性状的突变群体。由于ＥＭＳ处理方法的
差异或不同材料对ＥＭＳ的敏感程度不同，ＥＭＳ处理的诱变频率也不尽相同。徐艳花等［２６］利用ＥＭＳ诱变处理
普通小麦豫农２０１种子，突变频率达１１．４４％。叶俊等［３６］、孙加焱［２１］利用６０Ｃｏγ射线和０．４％的ＥＭＳ溶液分别
处理水稻“９３１１”种子和甘蓝型油菜高油６０５种子，表型突变率分别为５．６２％和３０．５８％。本试验获得突变株共
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３７８株（不含叶形突变），表型变异率达３６．３８％。ＥＭＳ诱变处理紫花苜蓿的变异频率远远高于小麦、水稻、油菜、
大豆等其他植物，这意味着ＥＭＳ诱变技术有可能在紫花苜蓿中创造更多的等位变异。其中，叶片颜色突变最为
显著，包括叶片黄斑块（点）、黑褐色叶片、叶深绿色、黄白杂叶、叶红紫、黄化苗、灰绿色叶、白化苗以及矮化并叶黄
植株等９种性状类型，占总突变率的５６．８７％。不同性状的突变频率差异很大，可能与ＥＭＳ作用位点或控制各
性状基因数目的差异有关［３７］。出现多种叶斑突变体，这可能是由于植物某些关键基因的突变引起细胞程序化自
发死亡而形成类病斑状的突变体［２８］。９种叶色变异类型在苗期均有表达，其中部分叶色突变株与Ｊａｒｖｉｓ等［３８］利
用ＴＤＮＡ标签法研究拟南芥时得到的黄化转绿型突变体狆狆犻犾相似，其黄化性状不能在整个生育期内持续表
达，在叶片成熟时转为正常绿色或者深绿色，还有类似病斑的叶片后期逐渐萎黄、死亡。孙加焱［２１］在研究甘蓝型
油菜叶部突变体时曾发现类似的黄化幼叶成熟期转绿的现象，关于花斑叶片的后期变化情况尚未见报道。这些
叶片变异材料的深入研究将对叶色相关功能基因的分离提供一定条件，紫叶突变性状受环境影响小，在整个生育
期稳定表达，可作为明显而可靠的标记应用于杂交育种和突变体选择，简化良种繁育过程，提高育种效率［３７，３９４０］。
理想的株型、叶形有利于提高植株的光合作用效率，加速光合产物从源向库的积累，从而增加单位面积的经济产
量［４１４２］，试验发现卷皱、狭长、锯齿、多叶等叶形突变。整个生长期内，对照组植株叶片长势良好，野生型叶片为羽
状三出复叶；托叶大，卵状披针形，先端锐尖，基部全缘，脉络清晰；叶柄比小叶短；小叶长卵形、倒长卵形至线状卵
形，等大，或顶生小叶稍大，先端钝圆；顶生小叶柄比侧生小叶柄略长［４２］。突变群体中还发现类似于三叶草匍匐、
半匍匐枝型植株，对该突变基因研究为培育放牧型紫花苜蓿品种提供了可能，从而改变直立型苜蓿不耐牧只适合
刈割的缺陷性。这些优质种质资源是人工诱变得到的，因而有可能获得控制这些优良性状新基因或新的等位变
异［４３］。因此，对这些突变体进行深入的遗传学研究具有深远的实际意义。
本试验采用ＥＭＳ化学诱变甘农３号紫花苜蓿种子，经 Ｍ１ 代种子萌发和突变形态学性状鉴定，明确了ＥＭＳ
对紫花苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响关系，已经获得一批产生明显变异的甘农３号突变群体，建立了紫花苜蓿
ＥＭＳ诱变突变体库。对突变群体 Ｍ２、Ｍ３ 代的田间表型调查和重复鉴定、ＴＩＬＬＩＮＧ技术平台构建以及反向遗传
学技术评估突变体库［４４］，转录组学研究突变性状在发育过程中基因表达谱等工作将是下一步研究的主要内容。
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ＸＩＡＺｅｎｇｒｕｎ，ＤＵＦｅｎｇｆｅｎｇ，ＬＩＳｉ，ＺＨＡＮＧＪｉｙｕ，ＬＩＵＹｏｎｇ，ＨＵＯＹａｘｉｎ，ＫＯＮＧＬｉｎｆａｎｇ
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ｗｅｒｅ３７９ｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍ１０３９ Ｍ１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｓｈｏｗｉｎｇｌｅａｆ（ｂｕｔｅｘｃｌｕｄｉｎｇｌｅａｆｓｈａｐｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙ），ｐｌａｎｔ
ｈｅｉｇｈｔ，ｂｒａｎｃｈｎｕｍｂｅｒ，ｐｌａｎｔｔｙｐｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｍｕｔａｎｔｌｉｎｅｓｏｆｌｅａｆｃｏｌｏｒ，ｂｒａｎｃｈｎｕｍｂｅｒ，ｐｌａｎｔｔｙｐｅａｎｄ
ｏｔｈｅｒｓｗｅｒｅ２１５，４０，９５ａｎｄ２８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓ２０．６９％，３．８５％，９．１４％ａｎｄ２．６９％．Ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔｌｉｂｒａｒｙｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｌｂｅａｖｅｒｙｕｓｅｆｕｌｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍ
ｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；ｈａｌｆｌｅｔｈａｌｄｏｓａｇｅ；ｍｕｔａｎｔｌｉｂｒａｒｙ；ｖａｒｉａｔｉｏｎ
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