全 文 ：书抗冻基因犆犅犉２表达载体构建及
转化紫花苜蓿的研究
刘晓静１，２，郝凤１，２，张德罡１，２，毛娟３，于铁峰１，２
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．草业生态系统教育部重点实验室中－美草地畜牧业可持续发展
研究中心，甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：本研究以拟南芥基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法扩增目的基因，连接到ＰＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ载体上构建
成克隆载体ＴＣＢＦ２。用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ分别对克隆载体ＴＣＢＦ２ 和植物表达载体ＰＢＩ１２１进行双酶切，获得目的
片段和线性质粒。在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下进行定向连接，构建成植物表达载体ＰＴＣＢＦ２。采用直接转化法
将重组子导入根癌农杆菌ＥＨＡ１０５。经ＰＣＲ鉴定，重组质粒已成功导入根癌农杆菌中。通过农杆菌介导法转化和
田苜蓿，现在已经得到转基因的苜蓿愈伤组织。
关键词：抗冻基因ＣＢＦ２；载体构建；农杆菌；紫花苜蓿；转化
中图分类号：Ｓ５５１＋．７０３．４；Ｑ９４５．７　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０２０１９３０８
　ＣＢＦｓ（冷诱导基因）由一个小的基因家族编码，包含３个成员ＣＢＦ１、ＣＢＦ２ 和ＣＢＦ３，３个基因都聚集在拟南芥
的４号染色体短臂上，紧密连锁在一起，均可在冷胁迫下迅速诱导表达［１］。ＣＢＦ这一冷驯化关键调节基因的发
现，对植物逆境胁迫生理和抗逆植物基因工程研究产生了一定影响。研究发现，ＣＢＦ在植物中是相当保守的，即
使是对冻害敏感的番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿），也存在具功能的ＣＢＦ基因。另外，过量表达ＣＢＦ除了提高
拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）抗冻能力外，也增强了拟南芥对干旱和盐的抗性，因此ＣＢＦ可作为农作物抗逆基
因工程的重要基因［２］。
目前已对ＣＢＦ１ 和ＣＢＦ３ 基因做了很多研究工作，１９９７年Ｓｔｏｅｈｉｎｇｅｒ等［３］从拟南芥中首次克隆出ＣＢＦ１ 基
因，并将其与花椰菜花叶病毒（ＣａＭＶ）３５Ｓ强启动子重组的融合基因转入到拟南芥中获得ＣＢＦ１ 高表达的植株，
同时发现转基因植株不经低温驯化就具有强抗寒性。Ｇｉｌｍｏｕｒ等［４］研究表明ＣＢＦ３ 在转基因拟南芥中过量表达，
不仅使植株耐低温的能力提高，而且抗旱和抗盐性也提高；Ｈｓｉｅｈ等［５］将拟南芥ＣＢＦ１ 转入番茄中，发现转基因番
茄的抗旱性和耐低温性都明显增强；Ｌｉｕ等［６］用ＣＢＦ３ 转化拟南芥，他们获得的转基因拟南芥植株的抗逆性均得
到综合的改良。也有一些关于ＣＢＦ２ 基因的研究，Ｊａｇｌｏ等［７］报道转拟南芥ＣＢＦ２ 的油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）植
株中，ＥＬ５值（导致５０％组织电解质渗漏出来的冰冻温度）比未转化油菜低４．６℃。
苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）为温带地区重要的牧草，是重要的饲料农作物，低温是制约其生长的限制因子之一，
因此开展抗冻基因导入苜蓿的研究具有重大的生态效益和经济效益。该研究期待通过ＣＢＦ２ 单基因的导入显著
提高苜蓿对低温的适应能力，使优良苜蓿在高寒气候区的种植成为现实，也为今后转化其他经济作物，利用ＣＢＦ２
基因综合改良这些作物的抗逆性奠定基础。
１　材料与方法
１．１　供试材料
和田苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．Ｈｅｔｉａｎ），产量稳定，再生速度快，生长寿命长，抗逆性强，适应范围广。在
－３５℃有积雪条件下，能安全越冬；每年灌溉１～２次也可正常生长。种子来源：甘肃农业大学遗传育种实验室。
大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＥＨＡ１０５、ＰＢＩ１２１载体由甘肃
第２０卷　第２期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１９３－２００
２０１１年４月
 收稿日期：２００９１２０８；改回日期：２００９１２３０
基金项目：甘肃省农牧厅生物技术专项（ＧＮＳＷ２００４０７）资助。
作者简介：刘晓静（１９６８），女，甘肃酒泉人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｘｊ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。
农业大学遗传育种实验室保存；质粒ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶
及高保真ＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司。
１．２　ＣＢＦ２ 基因组ＤＮＡ的提取
用ＣＴＡＢ（十六烷基三乙基溴化铵）法［８］，略加修改。取培养１５ｄ的拟南芥无菌苗。
１）称取２００ｍｇ叶片，在液氮处理下，在研钵中研磨成粉末状。
２）２ｍＬ离心管中加入８００μＬ６５℃预热的ＣＴＡＢ提取缓冲液、８０μＬ无水乙醇，颠倒离心管，使叶片粉末与
提取缓冲液充分混合均匀，置于６５℃恒温水浴中３０ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ颠倒离心管数次。
３）３０ｍｉｎ后取出离心管自然冷却至室温，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。
４）吸取上层清液于另一离心管，加入等体积的氯仿，颠倒混匀，在室温下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。
５）转移上层清液至另一新的离心管中，加入２倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻混匀。于－２０℃下放置３０
ｍｉｎ，使ＤＮＡ充分缠绕成团。
６）将上述有絮状沉淀的ＤＮＡ离心，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，倒掉上清液。
７）挑取絮状沉淀，加入７０％乙醇清洗２次。风干，最后加入１００μＬＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０ＴｒｉｓＨＣｌ，
１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）缓冲液充分溶解ＤＮＡ沉淀。
８）－２０℃下贮存备用。
１．３　ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｏｉｎ，聚合酶链式反应）
根据ＧｅｎｅＢａｎｋ的ＣＢＦ２ｃＤＮＡ已知序列，设计合成１对引物［９，１０］，并根据构建植物表达载体的需要在引物
５′端分别引入了ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ的酶切位点。正向：５′ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴ ＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧ
３′，反向：５′ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＡＧＣＴＣＣＡＴＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＣＡ３′，以ＣＢＦ２ 基因组ＤＮＡ为模板。反应程
序：９４℃３ｍｉｎ→（９４℃３０ｓ→５７℃３０ｓ→７２℃１ｍｉｎ）３０（此步骤为３０个循环）→７２℃１０ｍｉｎ。热启动法加
酶［１１，１２］。所用酶为ＴａｑＰｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｑ＋Ｐｆｕ）（高保真聚合酶）。ＰＣＲ仪为ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒＴＭ（基因扩增
仪）。
１．４　目的片段的纯化回收
对ＰＣＲ产物开展琼脂糖凝胶电泳，用ＤＮＡ快速纯化回收试剂盒回收目的片段，具体操作按产品说明书进
行。
１．５　克隆载体的构建
所用载体为ＰＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｔ载体系统），该载体专为ＰＣＲ产物的克隆而设计，具有氨苄青霉素抗
性标记，可以进行蓝白筛选，便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系：３μＬ纯化后的ＰＣＲ产物＋２μＬ１０×
ＬｉｇａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（连接缓冲液）＋１μＬ（５０ｍｇ／Ｌ）ＰＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ＋１μＬＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（连接酶）。在１６℃
条件下连接过夜［１３，１４］。
１．６　感受态细菌的制备及转化
感受态细菌的制备［１５］：
１）在ＬＢ（培养基）平板上挑取新活化的大肠杆菌ＤＨ５α接种于５ｍＬＬＢ液体培养基中，３７℃２８０ｒ／ｍｉｎ震荡
培养过夜（１４～１６ｈ）。
２）取５００μＬ上述菌液转移到５０ｍＬＬＢ三角瓶中（占１％左右），震荡培养３ｈ（ＯＤ６２０＝０．３～０．４）。吸取１
ｍＬ菌液于２ｍＬ离心管中，冰浴１０ｍｉｎ。
３）４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清。
４）加入５００μＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ冰冷的氯化钙，重悬沉淀，冰浴４０ｍｉｎ。
５）４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清。
６）加入１００μＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ冰冷的氯化钙，重悬沉淀。
７）４℃存放２４ｈ，－２０℃保存备用。
转化：
４９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
１）取５μＬ连接产物，加入１００μＬ感受态细胞，混匀（用枪轻轻吸打几次），冰浴４０ｍｉｎ。
２）４２℃热击９０ｓ。（勿动）
３）迅速将离心管转移至冰上，冰浴５ｍｉｎ。（勿动）
４）加入４００μＬＬＢ液体培养基，混匀，３７℃，２００ｒ／ｍｉｎ震荡培养１ｈ。
５）取１００μＬ菌液，用无菌涂布器涂布于含Ｘｇａｌ（５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷）、ＩＰＴＧ（异丙基βＤ硫代
吡喃半乳糖苷）、ＡＭＰ（氨苄）的ＬＢ固体培养基上。
６）将平板置于室温直至液体被完全吸收后倒置培养皿，３７℃培养过夜（２０ｈ）。
１．７　重组质粒的鉴定
在直径９ｃｍ的培养皿上共生成约７０个白色菌落，随机挑取２个白色菌落，分别接种于２ｍＬＬＢ液体培养
基中，在３７℃，２８０ｒ／ｍｉｎ条件下震荡培养过夜，转接于８ｍＬＬＢ中震荡培养。按碱裂解法小量提取质粒［１６］。以
质粒ＤＮＡ为底物用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ进行双酶切鉴定。双酶切反应体系为质粒ＤＮＡ１５μＬ＋１０×Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ
＋ＢａｍＨⅠ１μＬ＋ＳａｃⅠ１μＬ，３７℃，４ｈ。目的基因序列的测定由天根生化科技有限公司完成。
１．８　植物表达载体的构建
植物表达载体ＰＢＩ１２１（工程质粒）是从结瘤农杆菌双元质粒衍生而来，系一组成性表达载体，大小１４ｋｂ，多
克隆位点上游带有ＣａＭＶ３５Ｓ（花椰菜病毒启动子）启动子，下游带有ＧＵＳ（β葡萄糖苷酸酶基因）报告基因；在
ＮＯＳ（胭脂碱合酶基因启动子）启动子下游带有ＮＰＴⅡ（ＫＡＮ抗性基因）基因，可进行Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（Ｋａｎ，卡那霉
素）抗性筛选。ＣＢＦ２ 植物表达载体的构建过程见图１（图中：ＯｒｉＶ：是在营养时期，即游离在细胞质中独立复制
时的复制起点；ＣｏｌＥ１ｏｒｉ：大肠杆菌质粒复制起始点；ＮＯＳ：胭脂碱合酶基因启动子；ｎｐｔⅡ：ＫＡＮ抗性基因；
ＮＯＳｔｅｒ：胭脂碱合酶基因终止子；ＣａＭＶ３５Ｓ：花椰菜病毒启动子）。
分别对重组质粒ＴＣＢＦ２、ＰＢＩ１２１进行ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切，纯化回收。
回收的线性ＰＢＩ１２１和ＣＢＦ２ 基因片段经电泳定量后，在Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（连接酶）作用下进行定向连接，连
接反应体系为ＣＢＦ２ＤＮＡ５μＬ＋ＰＢＩ１２１２μＬ＋１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ＋Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ１μＬ，１６℃连接２２ｈ
［１７，１８］。连
接后对感受态细菌进行转化，在转化过程的培养基中添加Ｋａｎ１００ｍｇ／Ｌ。
１．９　植物表达载体的鉴定
在添加Ｋａｎ１００ｍｇ／Ｌ的筛选培养基上随机挑取转化菌落，提取重组质粒的ＤＮＡ，分别进行ＰＣＲ鉴定、
ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切鉴定。
１．１０　农杆菌的转化
根癌农杆菌感受态细胞的制备。
１）将农杆菌ＥＨＡ１０５（农杆菌菌株）接种于ＹＥＢ（基本培养基）固体培养基上，［ＹＥＢ＋５０ｍｇ／ＬＳｔｒ（链霉素）
＋２５ｍｇ／ＬＲｉｆ（利福平）］，ＹＥＰ为５０ｍＬ，５０ｍｇ／ＬＳｔｒ为１００μＬ，１０ｍｇ／ＬＲｉｆ为２５μＬ。２８℃培养２４～３６ｈ。
２）挑取新活化的农杆菌单菌落接种于５ｍＬＹＥＢ液体培养基上（ＹＥＢ＋Ｓｔｒ＋Ｒｉｆ），２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ震荡培
养２４～３６ｈ。
３）吸取１ｍＬ农杆菌培养液（１∶５０或１∶１００）接种于５０ｍＬ（ＹＥＢ＋Ｓｔｒ＋Ｒｉｆ）中，２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ震荡培养
６～８ｈ，测ＯＤ６００＝０．３～０．５。
４）吸取上述菌液转入２ｍＬ离心管中，常温５０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ去上清，收集菌体。
５）将菌体垂悬于２ｍＬ０．０２ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２ 中常温５０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ去上清，收集菌体（重复２次）用２００μＬ
２０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２ 溶液垂悬。
６）液氮速冻１ｍｉｎ。
７）－７０℃冰箱保存。
液氮冻融法直接转化农杆菌［８，１９］。
１）取新鲜制备的农杆菌感受态细胞或－７０℃保存的２管农杆菌感受态细胞置于室温下融化。
５９１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
２）２管２００μＬ的农杆菌菌液中，其中一管加入１μｇ（５～１０μＬ）质粒ＤＮＡ，另一管加入５～１０μＬ无菌水作
对照，轻弹混匀，冰浴３０ｍｉｎ。
３）置于液氮中速冻１ｍｉｎ，迅速取出，３７℃水浴保温３～５ｍｉｎ融化细胞。
４）溶解完全后加入８００μＬＹＥＢ液体培养基，２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ培养６ｈ。
５）４℃，５０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃上清，仅留下约５０μＬ的菌液。
６）将菌液均匀涂布于（ＹＥＢ＋５０ｍｇ／ＬＳｔｒ＋２５ｍｇ／ＬＲｉｆ＋５０ｍｇ／ＬＫａｎａ）平板上，２８℃，培养２～３ｄ。在
平板上可以看到转化了质粒的农杆菌单菌落，等菌落长至一定大小，４℃保存。
图１　植物表达载体（犘犜犆犅犉２）的构建过程
犉犻犵．１　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉犘犜犆犅犉２
１．１１　转化菌的鉴定
挑取转化农杆菌的单菌落接于２ｍＬＹＥＰ培养液（含Ｓｔｒ５０ｍｇ／Ｌ，Ｒｉｆ２５ｍｇ／Ｌ，Ｋａｎ１００ｍｇ／Ｌ），２８℃，２００
ｒ／ｍｉｎ震荡培养１８ｈ，转接于１０ｍＬＹＥＢ（抗生素同上）中培养。以碱裂解法提取质粒。ＰＣＲ鉴定转化菌：以转
化菌的质粒ＤＮＡ１μＬ为模板，反应体系２５μＬ。
１．１２　苜蓿遗传转化
根据不同的紫花苜蓿品种对Ｋａｎ的敏感程度不同，选择的方法分为３种：前期选择、延迟选择和后期选择。
在筛选时，选择压越低对愈伤的毒害越小，越有利于生长。本试验设置Ｋａｎ浓度梯度（ｍｇ／Ｌ）：３０，４０，５０，６０，７０，
８０，９０，１００；延迟选择天数梯度（ｄ）：０，５，１０，１５，２０。进行完全区组试验。
苜蓿种子用无菌水浸泡，酒精和升汞消毒后在含３％蔗糖的 ＭＳ（基本培养基）固体培养基上无菌培养。切下
７ｄ龄子叶，在愈伤培养基 ＭＳ１［ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．３ｍｇ／ＬＫＴ（激动素）］上预培养３ｄ，在活化的农杆菌
６９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
ＥＨＡ１０５（ＰＴＡＦＰ＋ＥＨＡ１０５）菌液中浸染１０ｍｉｎ，在
图２　犘犆犚扩增产物电泳
犉犻犵．２　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆犪狋狋犲狉狀狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋
Ｍ：分子量标记；１：空白对照；２，３：ＰＣＲ扩增产物；４，５：目的片段
ＤＮＡＭ：Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｂｌａｎｋ；２，３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；
４，５：ＤＮＡｏｆｆｒａｇｍｅｎｔ
图３　蓝白斑筛选
犉犻犵．３　犅犾狌犲狑犺犻狋犲狊犮狉犲犲狀犻狀犵
ＭＳ１ 培养基上和黑暗条件下共培养３ｄ，然后转入筛
选培养基 ＭＳ２［ＭＳ１＋６０ｍｇ／ＬＫａｎ＋４００ｍｇ／ＬＣａｒｂ
（羧苄青霉素）］中筛选抗性愈伤组织，且每２周更换１
次培养基。选取生长状态良好，结构紧凑，长有绿色芽
点的愈伤组织进行ＰＣＲ鉴定。
２　结果与分析
２．１　ＣＢＦ２ 基因的ＰＣＲ
扩增出的ＣＢＦ２ 基因ＤＮＡ的片段，约７００ｂｐ（图
２）。退火温度为５３～６３℃均可扩增出目的片段，但以
５７℃特异性最好。
２．２　克隆载体的构建
由于ＴａｑＰｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（高保真聚合酶）
的ＰＣＲ 产物在３′末端有突出的 Ａ，故以 ＰＧＥＭＴ
ＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ作为克隆载体与目的片段进行连接。转
化细菌后，直径９ｃｍ的培养皿上生成菌落约１５０个，
其中白色菌落约占７０％（图３）。
２．３　重组质粒的鉴定
对白色菌落的质粒ＤＮＡ用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ进
行双酶切均产生预期片段（图４）。取ＴＣＢＦ２ 进行目
的基因的序列测定，所测序列与报道序列的同源性达
到９９％，其中有２个碱基发生突变（小写字母表示），
但不影响整个片段的功能和性质，对应的原序列为ｃ
Ｔ，ａＧ。说明克隆载体的构建是成功的，命名克隆的
重组质粒为ＴＣＢＦ２。测序结果如下：
１ ＡＴＧＡＡＣＴｃＡＴ ＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴ ＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＧ ＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＴＴＴＣＣ
６１ ＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧ
１２１ ＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＣＧＴＣＡＣＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＧＡＧＧａＧＴＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＧＴ
１８１ ＡＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣ
２４１ ＣＡＡＡＣＣＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣＴＣＴＣＣＧＴＧＧＣＡＧＡ
３０１ ＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣ ＴＣＡＡＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＴ
３６１ ＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴ
４２１ ＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＴＴＡＴ
４８１ ＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴ
５４１ ＡＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＴＴＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴ ＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣ
６０１ ＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡ
２．４　植物表达载体的构建及鉴定
挑取转化菌落，提取重组质粒ＰＴＣＢＦ２，以ＰＴＣＢＦ２ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ，极特异地扩增出７００ｂｐ预期
片段，对经过纯化回收的目的片段分别用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ进行双酶切分析，均产生预期片段（图５）。说明ＣＢＦ２
基因在植物表达载体ＰＴＣＢＦ２ 内连接完整。
２．５　农杆菌的转化及鉴定
挑取单克隆的转化菌接种培养，提取质粒ＤＮＡ，进行ＰＣＲ鉴定。非常特异地扩增出７００ｂｐ的目的片段 （图
６）。表明重组质粒ＰＴＣＢＦ２ 已经转入所鉴定的农杆菌中。
７９１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
图４　犜犆犅犉２ 载体鉴定
犉犻犵．４　犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犜犆犅犉２
Ｍ：分子量标记；１，２：ＢａｍＨⅠ，ＳａｃⅠ双酶切产物 Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１，２：
ＢａｍＨⅠ，ＳａｃⅠｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ
图５　犘犜犆犅犉２ 载体鉴定
犉犻犵．５　犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犘犜犆犅犉
Ｍ：分子量标记；１：ＰＣＲ扩增产物；２：ＢａｍＨⅠ，ＳａｃⅠ双酶切产物
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；２：ＢａｍＨⅠ，ＳａｃⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
图６　犘犜犆犅犉２ 导入农杆菌的犘犆犚检测
犉犻犵．６　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犘犜犆犅犉２
狋狉犪狀狊犳犲狉狉犲犱犻狀狋狅犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
Ｍ：分子量标记；１，２，３：重组农杆菌的ＰＣＲＭ：Ｍａｒｋｅｒ；１，２，３：
ＰＣＲｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
图７　转犆犅犉２ 基因愈伤组织的犘犆犚鉴定
犉犻犵．７　犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱
犆犅犉２犵犲狀犲犻狀犮犪犾狌狊
Ｍ：分子量标记；１：阴性对照；２，３：转基因愈伤组织的ＰＣＲ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２，３：ＰＣＲｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃａｌｕｓ
２．６　苜蓿转基因抗性愈伤的获得及选择时间的确定
图８　抗犓犪狀的愈伤组织筛选
犉犻犵．８　犛犲犾犲犮狋犻狅狀狅犳犓犪狀犪犿狔犮犻狀－狉犲狊犻狊狋犪狀狋犮犪犾狌狊
随着选择天数的增加所需 Ｋａｎ浓度增高并且抗
性率降低（表１）；延迟选择天数为０时，所需的临界
Ｋａｎ浓度最低（６０ｍｇ／Ｌ），并且得到的抗性愈伤率相
对较高（２７％）。综合上述结果说明本试验采用６０
ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ浓度为适宜的选择压，并对抗性愈伤进
行前期选择效果最佳。
２．７　转基因苜蓿愈伤的ＰＣＲ鉴定
转基因的植株经ＰＣＲ扩增，在约７００ｂｐ处出现
特征带，在非转基因植株对照的泳道上没有该特征带，
初步证明目的基因已经整合到和田苜蓿基因组中（图
７），转基因抗性愈伤组织见图８。
８９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
３　讨论
３．１　ＣＢＦ２ 基因对农杆菌的转化
本试验采用的农杆菌 ＥＨＡ１０５的 Ｔｉ质粒经改
造，只含有毒性区（Ｖｉｒ），具有链霉素（Ｓｔｒ）抗性和利福
平（Ｒｉｆ）抗性。采用直接转化法，菌株在常温状态下就
可完成转化，虽然转化率较低，但可以满足实际应用，
在转化率能满足需要的前提下，此方法简单易行。从
而显著提高了转基因的可操作性，降低了操作难度。
３．２　ＣＢＦ２ 基因对苜蓿的遗传转化
本试验对紫花苜蓿进行抗冻基因ＣＢＦ２ 的转化已
得到转基因的苜蓿愈伤组织。并且本试验在 Ｋａｎ作
为选择压的筛选时机确定过程中发现，在愈伤组织形
表１　紫花苜蓿在不同犓犪狀浓度下的抗性愈伤率
犜犪犫犾犲１　犃犾犳犪犾犳犪犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋犓犪狀犪犿狔犮犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊
狅犳狋犺犲狉犲狊犻狊狋犪狀狋犮犪犾狌狊狉犪狋犲 ％
延迟选择天数
Ｓｅｌｅｃｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｄｅｌａｙｅｄｄａｙｓ（ｄ）
Ｋａｎ浓度
Ｋａｎａｍｙｃｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／Ｌ）
３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００
０ ５０ ４５ ３６ ２７ ０ ０ ０ ０
５ ５３ ４９ ４０ ３１ ２０ ０ ０ ０
１０ ５５ ４７ ３９ ３０ １７ ０ ０ ０
１５ ６７ ５６ ４４ ３９ ２９ １８ ０ ０
２０ ７４ ６０ ５２ ４７ ３４ １３ ０ ０
成期和胚状体起始分化期进行选择能起到有效的筛选作用，效果较好。根据不同的紫花苜蓿品种对Ｋａｎ的敏感
程度不同，选择的方法分为３种：前期选择、延迟选择和后期选择。本试验研究结果表明前期选择能起到有效的
筛选作用，因为在愈伤组织形成期和胚状体起始分化期对Ｋａｎ的敏感程度较高，并且筛选时Ｋａｎ浓度越低对愈
伤的毒害越小，越有利于愈伤的生长。本试验结果表明采用较低的Ｋａｎ浓度（６０ｍｇ／Ｌ）在前期选择具有相对较
高的准确性，可以进行有效的筛选，并可有效地减少后期工作的工作量，所得结果与王强龙［２０］、张静妮［２１］在紫花
苜蓿基因转化中延迟选择有利于苜蓿体胚的转化不同。
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ＬＩＵＸｉａｏｊｉｎｇ１，２，ＨＡＯＦｅｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＤｅｇａｎｇ１，２，ＭＡＯＪｕａｎ３，ＹＵＴｉｅｆｅｎｇ１，２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｉｎｏＵ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓｆｏｒ
ＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｅｇｅｏｆ
Ａｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｂｙＰＣＲａｎｄ
ｃｏｎｎｅｃｔｉｔｔｏｔｈｅＰＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＴＣＢＦ２．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄｌｉｎｅａｒｐｌａｓｍｉｄｓ
ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒＴＣＢＦ２ａｎｄｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＢＩ１２１ｗｉｔｈｄｕａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇＢａｍＨⅠａｎｄＳａｃＩ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＴＣＢＦ２ｗａｓｂｕｉｌｔｔｈｒｏｕｇｈｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｃｏｎ
ｎｅｃｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇＴ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ．ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｄｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏ
犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ａｎｄｉｔｗａｓｔｈｅｎｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．Ｈｅｔｉａｎｔｈｒｏｕｇｈ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻
狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｔｏａｌｆａｌｆａｃａｌｕｓｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅｇｅｎｅＣＢＦ２；ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
００２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２