全 文 ：林业科学研究 2005, 18( 2) : 109~ 113
Forest Research
文章编号: 10011498( 2005) 02010905
乐昌含笑种群遗传多样性的研究
姜景民, 滕花景, 袁金玲, 栾启福, 谭梓峰
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 311400)
摘要:基于随机扩增多态 DNA( RAPD)方法分析了珍稀木兰科植物乐昌含笑 6 个种群的遗传多样性及分化程度。19
条随机引物扩增出 111个可分析位点, 多态位点百分比为 8198% ,经 POPGENE分析发现, 乐昌含笑的 Nei s 基因多
样度(H e )为 0325 5, Shannon 表型指数( I )为 0 475 1,与其它植物比较具有较高水平的遗传多样性。6 个乐昌含笑群
体间基因分化系数( Gst )值为 0222 6, 群体内的遗传变异大于群体间的遗传变异。按照遗传距离将乐昌含笑 6 个群
体划分为两类:第 1 类有广西三江、湖南宜章、湖南双牌和湖南资兴的群体,第 2 类包括江西官山和湖南醴陵的群
体;研究表明: 第 2类种群的遗传多样性指数高于第 1 类种群的遗传多样性指数。
关键词:乐昌含笑; RAPD;遗传多样性; 群体分化
中图分类号: S71846 文献标识码: A
收稿日期: 20040701
基金项目: 科技部基础项目 亚热带珍稀树种种质资源收集、保存及编目! ( 2002DEA1000203)课题和浙江省林木良种技术支撑项目 浙
江省阔叶绿化树种选育和快繁技术研究!
作者简介: 姜景民( 1963 ∀ ) ,男,河南长葛人,研究员,硕士生导师.
Genetic Diversity of Michelia chapensis Dandy Populations
JIANG Jingmin , TENG Huaj ing , YUAN Jinling , LUAN Qif u , TAN Zif eng
( Research Inst itute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: Michelia chapensis , belonging to Michelia genus in the family Magnoliaceae, is a elite species for timber production
and for landscaping. In this paper, the genet ic diversity were investigated using RAPD technique. The total DNA were extracted
following a modification of CTABmethod with some adjustments. A total of 144 individuals representing 6 natural populat ion of
M . chapensis were surveyed using 19 RAPD primers. At species level, the percentage of polymorphic bands was 81. 98% ,Nei s
gene diversity was 0. 325 5 and Shannon index was 0. 475 1.AMOVA showed that 29. 96% of the genetic diversity resulted from
differentiation among populations. The coefficient of gene different iation( Gst ) generated by POPGENE32 was 0. 222 6. The 6 nat
ural populations of M . chapensis might be divided into 2 groups used UPGMA cluster system, and the genetic diversity of second
group was higher than that of the first.
Key words: Michelia chapensis; RAPD; genetic diversity; population differentiation
乐昌含笑 ( Michelia chapensis Dandy ) , 木兰科
(Magnoliacea)含笑属( Michelia L. )植物,自然分布于
我国中亚热带偏南地区。由于原始林受人为砍伐的
影响,现呈间断零散分布, 水平分布东起福建武夷
山,西至贵州黔东南山区, 南至广东怀集, 北达湖南
慈利,包括江西、湖南、广东、广西、贵州、福建六省,
是南方常绿阔叶林的主要组成树种之一 [1] 。自 20
世纪 90年代中期乐昌含笑被作为优良绿化树种推
出后,在华东地区得到广泛研究利用,很快就攻克了
其引种育苗,嫁接繁殖等方面的技术,但是, 由于乐
昌含笑开发利用前期被无节制地采种和砍伐, 野生
资源遭到了严重的破坏,遗传多样性受到严峻考验。
随机扩增多态 DNA( RAPD)技术由于其简便快
捷、多态检出率高、不用放射性同位素等特点, 已被
广泛应用于群体遗传结构分析、基因定位、遗传图谱
构建、品种鉴别等领域。本研究利用 RAPD 技术研
究了乐昌含笑群体遗传多样性与遗传分化程度, 探
讨了其群体遗传结构, 试图为乐昌含笑资源保护和
遗传改良提供科学依据。
1 材料与方法
11 实验材料
2002年 7月采集了广西、湖南、江西的野生乐昌
含笑 6个群体共 144个个体,分单株取叶片, 硅胶快
速干燥。采样群体的地理位置、样本大小、生境海拔
见表 1。
表 1 采样群体生境的基本情况
群体编号 地点 地理位置 群体大小株 样本大小株 生境特点
Sj 广西三江 109#27∃E 25#43∃N 约 80 30 散生,沟谷次生林
Jx 江西官山 114#30∃E 28#25∃N > 200 30 沟谷,阔叶林
Ll 湖南醴陵 113#27∃E 27#40∃N 约 250 35 天然纯林
Hn 湖南双牌 111#35∃E 25#44∃N 14 12 混生林,深山沟谷
Yz 湖南宜章 113#10∃E 25#20∃N 200 22 散生,深山沟谷
Zx 湖南资兴 113#30∃E 25#50∃N 80 15 散生, 深山沟谷
12 实验方法
121 DNA提取 用改良的 CTAB法 [ 2] 提取 DNA,
利用日本岛津 UV2401PC 紫外分光光度计测光吸
收,其中采用 OD 260值( 260 nm 处光吸收值)代表提取
的DNA 的浓度, 用 OD 260OD 280的比值表示提取的
DNA纯度, 利用 8 g%L- 1的琼脂糖凝胶电泳检测全
DNA的质量。
122 PCR扩增程序的构建 根据 Taguchi法优化
的结果[ 3] ,确定25 L反应体系如下: 10倍 PCR反应
缓冲液 25 L, 引物(上海生工, 10 bp 随机引物)
04 mol%L- 1 ,Mg2+ 25 mmol%L- 1 , dNTPs(上海生工)
01 mmol%L- 1 ,模板 20 ng, taq酶(上海生工) 117 U,
扩增在 PCR扩增仪 PE9600上进行。扩增的热循环
参数设定如下: 94 & 预变性 5 min, 随后进入 3步法
PCR循环(循环包括 94 & 变性 45 s, 37 & 退火 45 s,
72 & 延伸 90 s) ,这 3 步循环 40次后跳出循环再在
72 & 处延伸 10 min, 扩增过程结束。设定仪器自动
转入 4 & 以保存扩增产物等待操作人员检测。
123 引物筛选 选择经预备实验 PCR扩增良好
的来自不同群体的 6个DNA模板,对 72条 RAPD随
机引物(上海生工,引物编号S10~ S45 , S140~ S175 )进行
扩增、筛选,最后筛选出稳定性好、多态性强的引物
对所有群体的 DNA模板进行PCR扩增和电泳分析。
124 数据处理与统计分析 扩增产物用 15 g%
L
- 1的琼脂糖凝胶在 05倍TBE缓冲液中电泳分离,
200 bp ladder DNA(购自上海华美)为分子量标准, 溴
化乙锭染色后用 FR960紫外可见分析成像系统观
察拍照。每个样品的扩增电泳谱带按有( 1)和无( 0)
记录, 构成原始数据矩阵, 用 POPGEN32软件(版本
号 131, 由加拿大Alberta大学Francis C Yeh博士及
其实验室于 1997年开发, 官方发布于以下网站: Ht
tp:wwwualbertaca~ fyeh)和WINAMOVA软件(版
本号104,由瑞士日内瓦大学的 Laurent Excffier博士
1992年编写,官方发布于:
http:anthropologieunigech) [ 4]进行统计分析。
2 结果与分析
21 乐昌含笑 RAPD扩增片段的多态性
对 72个随机引物进行筛选, 从中选出 19 个扩
增谱带清晰且多态性丰富的引物对 6个乐昌含笑群
体 144个个体进行扩增反应。本文不同引物扩出的
带从 3 个到 7 个不等, 19 个引物共扩增出 111 条
DNA片段,其中多态性片段有 91条, 占总条带数的
8198%,平均每条引物扩增出的多态条带 48条,
表明乐昌含笑种群具有较丰富的遗传变异 (见图 1
和图2,由于篇幅有限, 所以不一一列出所有的模板
扩增的结果,仅列举一二)。
110 林 业 科 学 研 究 第 18 卷
图 1 引物 S167对部分模板的扩增模式图(示同一引物对不同个体扩增得到的片段从 3条到 7条不等)
图 2 引物 S11对部分模板的扩增模式图
22 乐昌含笑不同种群的遗传多样性
221 乐昌含笑群体遗传变异的分布 为了衡量
群体间和群体内遗传变异的程度, 利用 AMOVA 软
件对 6个乐昌含笑群体进行 RAPD遗传变异分布的
分析。结果(表 2)发现: 在乐昌含笑群体间与群体
内存在丰富的变异, 其中群体间变异占 2996%, 群
体内变异占 7004% ,差异显著性水平 0001。乐昌
含笑的 st 值是03。
表 2 乐昌含笑 6个种群144个个体
基于 RAPD的 AMOVA分析
变异来源 自由度 平方和 均方 st 1) 均方比(方差分量)
群体间 5 79734 159468 0300 619( 2996% )
群体内 138 1 99746 14470 1447( 7004% )
总计 143 2 79480 19540
注: 1) st ,在AMOVA中基因分化系数的表示符号, 和下文 POP
GENE32中的 Gst 表示的意义相同。两个软件在保留小数点位数以
及统计分析过程中不一样,导致有 007左右的差异,为了表示区别,
所以没有共用一个符号。
222 乐昌含笑种群的遗传多样性 多样性指数
通常用于表示种群内和种群间的遗传变异程度, 基
因多样度和 Shannon信息指数是衡量生物遗传多样
性的 2个重要指标。基于19条 RAPD引物所扩增出
的多态条带, 用 POPGENE32 在假设遗传平衡时, 利
用 POPGEN32 软件计算的有效等位基因数( Ne )、
Nei s基因多样度( He )和 Shannon 表型指数( I )等指
标列于表 3 中。乐昌含笑总群体基因多样性和
Shannon多样性指数分别为 0318 7和 0475 1, 群体
间基因分化系数( Gst )值为0222 6, 说明不同种群的
遗传变异有 22%左右存在于群体间, 78%左右的变
异存在于群体内, 比 AMOVA所得的值略低(见表 2
附注)。
表 3中 Shannon遗传多样性分析结果显示, 在 6
个种群中, Shannon表型指数以湖南资兴种群最低,
湖南醴陵种群最高。6 个种群的 Shannon表型指数
依次为: 湖南醴陵种群 ( 0391 5) > 江西官山种群
( 0386 1) > 广西三江种群( 0377 6) > 湖南宜章种群
( 0361 9) > 湖南双牌种群( 0356 6) > 湖南资兴种群
( 0326 0)。Nei s基因多样度研究结果显示:以湖南
资兴种群最低, 湖南醴陵种群最高。6个种群的遗
传多样性依次为: 湖南醴陵种群( 0267 3) > 江西官
山种群( 0260 8) > 广西三江种群( 0255 4) > 湖南宜
章种群( 0244 7) > 湖南双牌种群( 0240 5) > 湖南资
兴种群( 0217 8) , 表现出与 Shannon 表型指数相同
的趋势。
表 3 乐昌含笑种群的遗传多样性与分化
种群 有效等位基因
( Ne )
Nei s基因多样度
( He )
Shannon表型指数
( I )
总群体基因多
样性(Ht )
群体内基因多
样性( Hs )
群体间基因分
化( Gst )
广西三江 1449 6 0255 4 0377 6
江西官山 1451 4 0260 8 0386 1
湖南醴陵 1476 4 0267 3 0391 5
湖南双牌 1420 1 0240 5 0356 6
湖南宜章 1426 0 0244 7 0361 9
湖南资兴 1371 2 0217 8 0326 0
总体分析 1577 6 0325 5 0475 1 0318 7 0247 8 0222 6
标准差 0360 1 0182 6 0253 0 0032 6 0024 4
111第 2期 姜景民等: 乐昌含笑种群遗传多样性的研究
23 乐昌含笑种群间遗传距离和聚类树状图
基因分化系数只能对群体分化的程度作出评
价,却不能判定群体间相互关系的远近,而遗传相似
系数和遗传距离的度量则可以说明每个群体间彼此
关系的远近。为了确定乐昌含笑 6个群体间的遗传
关系,需计算出各群体间的遗传相似系数和遗传距
离,计算结果见表 4。由表 4可见,群体间遗传相似
系数最高为 0983 6,最低为 0824 3。
表 4 乐昌含笑 6个种群 Nei∃s非偏差遗传距离和遗传相似系数
种群 广西三江 江西官山 湖南醴陵 湖南双牌 湖南宜章 湖南资兴
广西三江 - 0845 5 0845 4 0960 0 0983 6 0942 3
江西官山 0167 8 - 0930 3 0830 4 0831 4 0849 8
湖南醴陵 0168 0 0072 2 - 0848 9 0824 3 0834 3
湖南双牌 0040 8 0185 9 0163 8 - 0920 2 0928 5
湖南宜章 0016 5 0184 6 0193 3 0083 2 - 0926 1
湖南资兴 0059 5 0162 8 0181 2 0074 2 0076 7 -
注:右上角为遗传相似系数,左下角为遗传距离。
遗传距离表示 2 个群体间的遗传差异, 一般
用单个数值来表示[ 5] , 乐昌含笑各群体的遗传距
离:湖南宜章和广西三江的距离最近( 0016 5) ,
湖南宜章和湖南醴陵最远 ( 0193 3)。一般情况
下植物群体遗传变异性的分布情形和该物种的地
理分布情形、生态特征有关 [6] , 但也存在不同的观
点。一种研究结果认为遗传距离与空间距离之间
的相关性很大 [7~ 10] , 但也有学者的研究结果认为
遗传距离与空间距离之间并无明显的内在关
系[ 11~ 13] 。本研究发现遗传距离的大小和它们的纬
度距离的远近存在正相关, 随着纬度距离增大, 群
体间遗传距离也有增大的趋势, 但没有表现出数
学上严格的正相关。根据遗传距离利用 UPGMA
聚类法得出了 6个乐昌含笑群体的亲缘关系树状
图(图 3)。由图 3可以看出, 利用 RAPD标记可以
较好地将 6 个产地乐昌含笑群体划分为 2 个大
类。第 1类主要包括广西三江、湖南宜章、湖南双
牌和湖南资兴的群体, 第 2 类包括江西官山和湖
南醴陵的群体。分类结果与群体所居的纬度位置
是比较一致的, 其中第 1 类群都是在 25#N 附近
(广西三江( 25#43∃N)、湖南宜章 ( 25#20∃N)、湖南
双牌( 25#44∃N)和湖南资兴( 25#50∃N) ) , 只跨越了
半个纬度( 30∃) ; 第 2类群是在 27#N 附近(湖南醴
陵( 27#40∃N ) 和江西官山 ( 28#25∃N) ) , 纬度跨越
45∃。聚类的结果和经度没有多少关系, 从经度上
看是交叉分布于 109#27∃E 到 114#30∃E, 这种聚类
结果从一个侧面反映了植物种群的变异主要受与
纬度相关的温度和光照的影响, 而在一个小的范
围内与经度关系不大, 经度造成的气候差别对遗
传变异只有微弱的影响。
图 3 乐昌含笑 6个种群UPGMA 聚类法得出的树状图
3 讨 论
遗传多样性是物种长期进化的结果, 是种群生
存和发展的前提。本研究结果揭示乐昌含笑具有较
高的遗传多样性,平均 Shannon指数为 0475 1,多态
位点频率高达 8198% , 种群间的基因分化系数为
2226%。Bussell[ 14] 曾对 35 个物种的 RAPD研究结
果进行了总结,发现 29个远交物种的群体间变异在
总的遗传变异中平均占 193% ( Gst = 0193) , 而 6
个近交物种的平均 Gst值为 0625,显然乐昌含笑的
基因分化系数远低于近交物种的水平, 但却略高于
远交物种的平均值。按遗传距离将乐昌含笑 6个群
体划分为 2类: 第 1类主要包括广西三江、湖南宜
章、湖南双牌和湖南资兴的群体,在本研究的乐昌含
笑分布区中属于较低纬度群体( 25#N 到 26#N的半个
纬度的狭窄范围内) ,第 2类包括江西官山和湖南醴
陵的群体,属于本研究的乐昌含笑分布区中较高纬
度群体( 27#N左右大约 34个纬度范围内)。第 2类
种群的遗传多样性指数高于第 1类种群的遗传多样
性指数,可能是因为所跨越的纬度范围要比第 1 类
广,也可能是因为第2 类种群的江西官山于 1981年
112 林 业 科 学 研 究 第 18 卷
即设立了省级自然保护区,所以其物种保存完好; 而
湖南醴陵市各级政府和林业部门都采取了一系列措
施对自然资源予以保护, 其野生物种保护也取得较
好的效果。总之,由于第 2类种群受到的人为破坏
比较少,种群规模比较大, 存在着丰富的基因交流,
所以其遗传多样性水平较高, 而在野外调查过程中,
由于人为的砍树采种,无节制伐木用材等原因,作者
发现广西三江, 湖南双牌及湖南资兴等地的乐昌含
笑已遭到严重破坏, 致使其种群在急剧减少,近于濒
危,所以第 1类种群遗传多样性水平比较低。
遗传多样性指数是反映种质材料遗传多样性的
有效指标,遗传多样性指数高的地区说明种质类型
较多,遗传差异较大,在品种改良中有较大的遗传潜
力。因此,遗传多样性的研究为有效地发掘和利用
野生乐昌含笑丰富的基因资源提供了理论依据。本
研究结果表明: 乐昌含笑群体内的遗传变异大于群
体间的遗传变异, 所以在进行种质收集或种源试验
时,可以适当地在群体内加大取样单株的数量,以增
加遗传变异的来源。
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