全 文 ：　　收稿日期: 1999-08-23
基金项目: 浙江省自然科学基金项目“一氧化氮与植物氮代谢及信号传导酶之间关系的研究”(编号: 397273)的部分内
容
作者简介: 苏梦云 ( 1942-) ,女,福建莆田人,副研究员.
　　文章编号: 1001-1498( 2000) 02-0141-06
桤木叶片中 NO 与硝酸盐还原系统
关 系 的 研 究
苏梦云, 吴祖洪
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳　311400)
摘要: 在桤木生长期间, 叶片中的一氧化氮( NO )含量和一氧化氮合成酶( NOS )活力随生长而变
化, 即生长初期水平较低,以后逐渐升高 ,生长高峰期达到最高值, 随后在叶片开始衰老时下降。硝
酸还原酶( NR )和谷氨酰胺合成酶( GS)的活力变化与 NOS 活力的变化类似, 但 NR 活力高峰出现
比 NOS 早,而 GS 活力高峰期在NOS 之后。用NO 处理, 叶片中NO 含量和 NOS 活力都有所增加,
但 NR 活力只在幼苗中表现增加, 而在离体枝条的叶片中则下降。在 NO 处理时供给枝条0. 05 mol
·L - 1KNO 3溶液,可明显提高叶片中的 NR 活力。如只用 KNO 3 溶液诱导处理,除 NR 活力增加
外, 也能提高叶片中的 NO 含量和NOS 活力。这表明NO 和 NOS 与NR、硝酸盐还原系统有一定联
系。
关键词: 桤木; 一氧化氮( NO ) ; 一氧化氮合成酶( NOS) ; 硝酸还原酶( NR ) ;
中图分类号: S718. 43 　　　　文献标识码: A
　　一氧化氮( NO)是大气污染的成分之一,常以氮氧复合物的形式( NO x+ NO)出现。它与臭
氧和二氧化硫等气体污染物一样,对生物体具有明显的伤害作用。近年来,在动物和医学方面
的研究发现, NO具有奇妙的二重性。它一方面作为活性氮自由基具有细胞毒性, 干扰鸟氨酸
循环[ 1] ; 另一方面它是一种气体信使分子, 能传导神经递质 [ 2, 3]、调节行为和保持长时记忆 [ 4, 5]。
因此对 NO 的研究成为国内外生化研究的热点之一。
在植物的研究上初步表明, NO在生长发育中也具有二重性。其既有伤害作用的一面, 又
具有利于生长的一面。Leshem 等[ 7]研究指出,低浓度的 NO能促进豌豆( Pisum satium Linn. )
叶圆片的增长,而高浓度的 NO 则抑制生长。NO 与乙烯也有密切关系[ 6]。
硝酸盐还原系统是植物氮素同化的重要还原系统。硝酸还原酶( NR)是氮素同化的关键
酶,与树木的生长呈正相关[ 8]。NO 与NR 的氮素同化系统有何关系,尚不清楚。本文以非豆科
固氮树种——四川桤木( A lnus cremastogyne Burkill)为材料,研究 NO在桤木中的形成和变化
及其与硝酸盐还原系统的关系, 以期从硝酸盐还原方面阐明 NO在树木中的生理作用。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
以四川桤木幼苗( 6个月龄)和幼树( 1年生和 2年生)作材料。
林业科学研究　2000, 13( 2) : 141～146
For est R esear ch 　　 　　
NO 变化规律的分析测定采用 1年生幼树,在 5～10月分别取其顶部成龄叶片(顶起第 3
片)进行 NO 含量和有关酶活力的测定。每月取 1次样,每个测定项目取6株树的叶片,分单株
制样、测定。对不同叶龄叶片的比较测定, 按叶片不同着生部位取样测定。
NO 处理试验采用 2年生幼树和幼苗。在生长旺盛期( 7月份)取幼树的带叶小枝插入盛有
水或 0. 05 mol·L - 1KNO 3溶液的细口瓶中,置于透明的反应室( 36 dm 3)内。试验前抽去反应
室内气体,同时充入经过焦性没食子酸和亚硫酸氢钠双重过滤的空气,以降低反应室气体中的
氧分压。试验材料经过不同浓度的 NO和不同时间处理后,取顶部成龄叶片进行分析测定,每
个处理 10个小枝。以幼苗试验时,直接将土杯苗置于反应室内,每个处理 5株苗,取成龄叶片
(鲜样)进行分析测定。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　NO发生方法　按照 Leshem 和Haramaty 方法[ 7] ,即根据化学反应式 2KNO 2+ 2KI+
2H2SO 4→2NO + I2+ 2K 2SO 4, 先制备 A 液( 0. 1 mo l KI+ 0. 1 mol H2SO 4 )和 B 液( 50
mol
KNO 2 ) ,试验时将 B 液注入 A 液进行反应。反应完全产生的 NO 摩尔数等同于反应 B 液的
KNO 2摩尔数。
1. 2. 2　NO含量测定　采用亚硝酸盐法,利用磺酰胺和萘乙二胺显色,在波长 520 nm 下测定
光密度。
1. 2. 3　NO合成酶( NOS)活力测定　采用精氨酸氧化法, 以精氨酸作底物, NADPH 作辅酶,
测定产生的 NO。酶活力以
molNO·g - 1·h- 1表示。
1. 2. 4　硝酸还原酶( NR)活力测定　按文献[ 9]方法。测定前不进行诱导处理。
1. 2. 5　谷氨酰胺合成酶( GS)活力测定　基本按黄维南方法[ 10]。
2　结果与分析
2. 1　桤木不同叶片中的 NO含量和 NOS 活力比较
在桤木不同发育程度的叶片中都可以检测到NO 含量和NOS 活力,而且表现出明显的差
异。在刚展开的叶芽中 NO含量甚微;随着叶片的生长, NO的浓度明显提高;成龄叶中略有下
降,到叶片开始角质化时明显减少。NOS 活力的变化趋势为幼嫩叶片中较低,成龄叶片中较
高,而角质化叶片中明显下降(表 1)。从表 1可以看出,在不同叶片中 NO 的变化趋势基本与
NR活力的变化趋势相同,均在生长活跃的幼叶中水平较高。
表 1　桤木不同叶片中 NO含量和 NOS、NR 活力的比较
叶片类型 NO/
( nmo l·g- 1)
NOS/
( nmo l NO·g - 1·h- 1)
NR/
(
mol NO-2 ·g - 1·h- 1) 叶片形态特征
芽　叶 微量 351 0. 79 黄绿色,长×宽 3. 0 cm×2. 0 cm
幼叶( 1) 145 355 1. 23 黄绿色,长×宽 6. 0 cm×3. 5cm
幼叶( 2) 133 558 1. 20 浅绿色,长×宽 9. 0 cm×5. 5 cm
成龄叶( 1) 100 606 0. 60 绿色,长×宽 9. 5 cm×5. 5 cm
成龄叶( 2) 125 770 0. 34 绿色,长×宽 11. 0 cm×8. 0 cm
角质化叶 72 498 0. 29 深绿色,长×宽 10. 0 cm×5. 5 cm
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图 1　桤木叶片中 NO 含量的变化
2. 2　桤木生长期间 NO含量和 NOS及 NR活力的
变化
桤木在浙江富阳地区的生长期一般在 4～11
月,以后叶片便逐渐黄化脱落。在幼树( 1年生)的成
龄叶中的NO 含量从 5～7月不断增加,以后则迅速
下降(图1)。在生长旺盛期( 7月)叶片中的NO 含量
最高,为 3. 3
mo l·g- 1 ,比生长初期的( 5月)叶片
中的NO含量增加 2. 3倍。这表明 NO在桤木生长
过程中起一定的作用。可能适当的 NO浓度有利于
桤木的生长。
在桤木生长期 NOS 活力变化趋势与 NO的变
化相同,均以生长旺盛期( 7月)的水平最高。在生长
旺盛期叶片中的 NOS活力为 2. 4
mo l NO·g - 1·
h- 1,比生长初期增加了1. 1倍。从 7月下旬开始,由于高温干旱,桤木生长受到明显的影响,酶
活力难以测定。到 9月中旬生长有所恢复,但 NOS活力仍相当低(图2)。这也表明 NOS对内
源 NO 水平有一定的调节作用。
图 2　桤木生长期间 NOS、NR和 GS活力变化
　　从图 2还可以看出, NR活力在生长初期( 5月)很低,但到 6月份增加了 7. 6倍, 7月份仍
保持较高的活力, 随后逐渐降低。作为硝酸盐还原系统后续的 NH+4 同化酶——谷氨酰胺合成
酶( GS)活力也是从生长初期逐渐增加,其活力高峰出现在 9月中旬,至 10月份又下降到生长
初期的水平。这表明 NR、GS 和 NOS 3种酶在桤木生长过程中都起着一定的作用。
2. 3　NO处理对 NOS和 NR活力的影响
以 100
mo l·g - 1 NO 处理幼苗和幼树( 2年生)的枝条对叶片内源的NO含量和 NOS 及
NR 的活力产生不同的影响(图 3)。处理 5 min, NO 含量和 NOS、NR活力都有所提高,随后
NO基本保持这一水平。NOS和 NR活力的变化在幼苗和离体枝条中有所不同。在幼苗中,用
143第 2 期　　　　　　　苏梦云等: 桤木叶片中 NO 与硝酸盐还原系统关系的研究
NO 处理 10 m in以后 NOS 和 NR活力都表现出缓慢的增加趋势; 而在离体枝条的叶片中,
NOS和 NR 活力在处理 10 min以后基本呈下降趋势。这表明低浓度 NO 短时间处理能提高
NR活力,有利于生长。
——幼苗; ●——离体枝条
图 3　NO 不同处理时间对NOS 和NR 活力的影响
用更低浓度( 5～30
mol·L - 1) NO 处理 10 min, 均能提高离体枝条叶片中的 NO 含量,
以5
mo l·L - 1浓度的 NO处理的效果最显著;在 5～30
mol·L - 1 NO 处理时, NOS活力均
有显著增加; NR 活力仅在 5～10
mol·L - 1 NO 浓度下表现增加, NO 浓度高于 10
mol·
L - 1处理 10 m in时, NR 活力下降(图 4)。低浓度 NO短时间处理能提高桤木叶片中 NR 和
NOS活力这一现象,反映出 NO 可能起着某种信息传导或诱导因子的作用。
图 4　不同浓度 NO 处理对NOS 和NR 活力的影响
2. 4　硝酸盐诱导处理对 NO和NOS的影响
用 KNO 3溶液处理,不仅提高了叶片中的 NR活力,且提高了 NOS 和 NO的水平。用 10
144 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　第 13卷

mol·L - 1NO 处理 30 min,叶片中 NO 浓度有所增加,但 NOS 活力并未增加, 而 NR活力则
明显下降(表 2)。
表 2　KNO3 处理对桤木叶片中 NO和 NOS活力的影响
处　　理　　 NR/
( nm ol NO-2 ·g- 1·h- 1)
NOS/
(nmol NO·g - 1·h- 1)
NO/
( nm ol·g- 1)
CK 448 516 35
KN O3( 0. 05 mol·L- 1) 638 669 66
NO(10
mol·L- 1) 262 521 60
NO+ KNO 3 563 591 85
　　在用 NO 处理的同时供给 KNO 3 ,不仅提高了 NR活力, 而且也使 NOS 和 NO 水平明显
提高。这表明NR 活力的提高对叶片内NO 和 NOS 的水平也有一定的调节作用。叶片保持高
NR活力的生理状态较能适应外源 NO 的影响。
3　讨　论
　　植物体内的 NO是由 NOS在 NADPH 的参与下, 使精氨酸氧化成瓜氨酸时而产生的 [ 7]。
在硝酸盐还原过程中也产生 NO, 但很快被继续还原[ 13]。通常在植物体内 NO 的含量很低, 当
植物受到大气中 NO x 污染或进行 NO 胁迫时,生长受到抑制, 主要是植物体内的 NO浓度迅
速增加,引起组织和器官的伤害。桤木用低浓度( 5～10
mol·L - 1) NO 进行短时间处理( 5～
10 min)对生长有利。这与NO 增加豌豆叶圆片生长的结果一致 [ 7]。桤木生长旺盛期叶片中含
有较高的NO 和 NOS活力表明, 在其体内保持适当的 NO 浓度对生长是有益的。
NR在硝酸盐还原系统中起关键作用。NR把硝酸盐逐步还原成 NH+4 ( NO -3→NO-2 →NO
→⋯→NH+4 ) , 而 GS 又把 NH+4 同化为谷氨酰胺并参与氨基酸循环[ 13] ,所以 NR 活力与树木
生长呈正相关 [ 8]。较高浓度的 NO 处理或处理时间过长,使叶片中NR活力受到明显抑制甚至
引起伤害。但在NO 处理时用 KNO 3诱导 NR活力,也能提高 NOS活力和内源 NO浓度,表明
桤木在正常的生长中需要维持适当的 NO 浓度和 NR 活力。NO 对 NR活力有一定的调节作
用,而 NR活力的变化对 NOS和 NO 的水平也产生影响。在植物硝酸盐还原系统中, NO与亚
硝酸还原酶还原的产物形式相同,所以NO 对 NR的调节不是参与还原系统,很可能是起着一
种诱导信号的作用。
参考文献:
[ 1]　Feldman P L, Gr iff ith O W , Stuehr D J. Th e surpr ising lif e of mi tric ox ide [ J] . Chem E ng New s, 1993, 71: 26～38.
[ 2]　Snyder S H. Nit ric oxide: f irst in a new s clas s of neurot ran smit ters [ J ] . S cience, 1992, 257: 494～496.
[ 3]　Madison D V. Pass th e nit ric oxide [ J ] . Proc Nat l Acad Sci, USA, 1993, 90: 4329～4331.
[ 4] 　Fin C , De Cunha C, Bromberg C, et al. Experiments sug gest ing a role for nit ric oxide in the hippocampus in memory
processes [ J] . Neurob iol L earn Memory , 1995, 113～115.
[ 5]　Anderson K E ,Wagner Y. Ph ysiology of penile erection [ J ] . Phys iol Rev, 1995, 75: 191～236.
[ 6]　Leshem Y Y, Rapaport D, Frimer A A, et al . Buckministerfullerene (C -60 carbon allot rope) inhibit s eth ylene evolut ion
f rom 1-aminocyclopropane-carboxylic acid ( ACC ) -t reated shoots of pea ( P isum satium ) , broad bean ( Vicia f aba ) and
f low ers of camat ion ( Dianthus caryop hy llus) [ J ] . Ann Bot , 1993, 72: 457～461.
145第 2 期　　　　　　　苏梦云等: 桤木叶片中 NO 与硝酸盐还原系统关系的研究
[ 7]　Lesh em Y Y, Haramaty E . The ch aracterization and cont rast ing effect s of the nit ric oxide f ree radical in vegetat ive
s t res s and senescence of Pisum satium Lin n. Fol iage [ J ] . J Plant Ph ysiol, 1996, 148: 258～263.
[ 8]　周国璋,苏梦云.杉木硝酸还原酶活力、氮素贮藏与其生长的关系[ J] .林业科学研究, 1993, 6( 2) : 141～147.
[ 9]　苏梦云,周国璋.树木硝酸还原酶活力测定方法[ J] .林业科技通讯, 1986, ( 7) : 25～27.
[ 10]　薛应龙.植物生理学实验手册[ M ] .上海:上海科学技术出版社, 1985. 223～225.
[ 11]　Anderson L S, Mans field T A. T he ef fect of n itri c oxide pollu tion on grow th of tom ato [ J] . E nviron Pollut , 1979, 20:
113～121.
[ 12]　Neigh bour E A, Pears on M , Mehlhorn H. Puraf il f ilt rat ion preven ts the developmen t of oz on e-indu ced f rost injury : a
potent ial role for n itric ox ide [ J] . Atmos Environ, 1990, 24 A : 711～715.
[ 13]　汤玉玮,林振武.硝酸还原酶活力与作物耐肥性的相关及其在生化育种上应用的探讨[ J ] .中国农业科学, 1985, ( 6) :
39～45.
Study on Relationship between Nitric Oxide and Nitrate Reduction
in Leaf of Alnus cremastogyne
SU Meng-yun, WU Zhu-hong
( T he Research Inst itute of S ubt ropical Fores t ry, CAF, Fu yang　311400, Zhejian g, China)
Abstract: The nit ric ox ide ( NO ) content and nit ric ox ide synthase ( NOS ) act ivity in
seedlings varied with the grow ing period of A lnus cremastogyne . In the initial stag e, NO
content and NOS activity w er e low . They gradually r aised unt il the peak o f the grow th.
When leaf began aged, the NO content and NOS act ivity turned to low level. The changes o f
nit rate reductase ( NR) and g lutam ine synthase ( GS) act ivit ies in g row ing period w ere
sim ilar to the NOS, but the max imum act ivity of NR appear ed ear lier than that of NOS. T he
fo rmer w as in June and the lat ter w as in July . GS maximum act ivity appear ed in September.
When leavies w er e dir ect ly exposed to NO ( 5～30
mol·L - 1) , NO content and NOS act ivity
appear ed obv ious increase. NR act ivity in seedling leaf ( in vivo ) raised, and in young tree
leaf ( in vit ro) reduced. T reated w ith NO the nit rate reductase ( NR) act ivity in br anch’s leaf
cult ivated in KNO 3 solut ion ( 0. 05 mol·L - 1 ) obviously raised. If branch w er e direct ly
cult ivated in KNO 3 solut ion, NO content and NOS act ivity appeared increase except for NR
act ivity. The results show ed that there exist r elat ionship betw een the level o f NO and NOS,
and g row ing o f A . cr emastogyne. NO related to nit rate reduct ion.
Key words: A lnus cremastogyne; nit ric ox ide ( NO) ; nit ric ox ide synthase ( NOS) ; nit rate
reductase( NR)
146 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　第 13卷