全 文 ：林业科学研究摇 圆园员员袁圆源渊猿冤院猿猿源 猿猿怨云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员员冤园猿鄄园猿猿源鄄园远
抗虫转基因欧洲黑杨多重 孕悦砸技术检测体系构建鄢
刘海涛员袁圆袁 周摇 静员袁圆袁 张川红员袁圆袁 冯锦霞员袁圆袁 郑勇奇员袁圆鄢鄢
渊员援中国林业科学研究院林业研究所袁国家林业局林木培育重点实验室袁北京摇 员园园园怨员曰
圆援 国家林业局植物新品种分子测试实验室袁北京摇 员园园园怨员冤
收稿日期院 圆园员园鄄园猿鄄园怨
基金项目院 国家林业局项目渊允鄄允鄄园苑鄄园缘冤曰国家林业局野怨源愿冶技术引进项目渊圆园园圆鄄缘缘冤
作者简介院 刘海涛渊员怨愿猿要冤袁男袁安徽淮南人袁博士生袁主要从事转基因树木检测及生态安全评估和植物生理生态学研究援 耘鄄皂葬蚤造院枣燥则藻泽贼赃
造葬怎岳 员远猿援 糟燥皂
鄢衷心感谢中国林业科学研究院林业研究所胡建军副研究员为本研究提供的宝贵实验材料遥
鄢鄢通讯作者院 耘鄄皂葬蚤造院扎澡藻灶早赠择岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶
摘要院根据抗虫转基因欧洲黑杨中的 悦葬酝灾 猿缘杂启动子尧晕韵杂终止子尧晕孕栽域标记基因以及 月贼目的基因序列袁设计合
成了相应引物袁采用单重 孕悦砸和多重 孕悦砸技术对启动子尧终止子尧选择标记基因以及目的基因等多个外源基因进行
检测袁并对各引物的退火温度及引物之间的浓度配比进行优化袁建立了适用于抗虫转基因欧洲黑杨检测的 月贼尧
晕孕栽域和 晕韵杂基因的三重 孕悦砸分析的技术体系遥 结果表明院当各组引物的终浓度配比为 员郾 园颐 园郾 缘颐 园郾 缘袁退火温度为
缘怨 益时袁所建立的三重 孕悦砸检测体系能够有效地检测出抗虫转基因欧洲黑杨中的转基因成分袁实现了对抗虫转基
因欧洲黑杨的快速尧高效尧准确的鉴定遥
关键词院抗虫转基因曰欧洲黑杨曰多重 孕悦砸检测曰外源基因
中图分类号院杂苑员愿援 源远 文献标识码院粤
粤 酝怎造贼蚤责造藻曾 孕燥造赠皂藻则葬泽藻 悦澡葬蚤灶 砸藻葬糟贼蚤燥灶 酝藻贼澡燥凿 枣燥则 砸葬责蚤凿 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
云燥则藻蚤早灶 郧藻灶藻泽 蚤灶 陨灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 孕燥责怎造怎泽 灶蚤早则葬
蕴陨哉 匀葬蚤鄄贼葬燥员袁圆袁 在匀韵哉 允蚤灶早 员袁圆袁 在匀粤晕郧 悦澡怎葬灶鄄澡燥灶早员袁圆袁 云耘晕郧 允蚤灶鄄曾蚤葬员袁圆袁 在匀耘晕郧 再燥灶早鄄择蚤员袁圆
渊员援 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠曰 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 栽则藻藻 月则藻藻凿蚤灶早 葬灶凿 悦怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶袁 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁
月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 酝燥造藻糟怎造葬则 栽藻泽贼蚤灶早 枣燥则 晕藻憎 孕造葬灶贼 灾葬则蚤藻贼蚤藻泽袁 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院陨灶 燥则凿藻则 贼燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 葬 皂怎造贼蚤责造藻曾 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 蚤灶早则藻凿蚤藻灶贼 蚤灶 孕燥责怎造怎泽
灶蚤早则葬袁 责则蚤皂藻则泽 憎藻则藻 凿藻泽蚤早灶藻凿 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 悦葬酝灾 猿缘泽 责则燥皂燥贼藻则袁 晕韵杂 贼藻则皂蚤灶葬贼燥则袁 晕孕栽域 皂葬则噪藻则 早藻灶藻 葬灶凿 月贼 贼葬则早藻贼
早藻灶藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 蚤灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 孕援 灶蚤早则葬援 栽澡藻 责则燥皂燥贼藻则袁 贼藻则皂蚤灶葬贼燥则袁 皂葬则噪藻则 早藻灶藻 葬灶凿 贼葬则早藻贼 早藻灶藻 憎藻则藻
凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 泽蚤皂责造藻曾 孕悦砸 葬灶凿 皂怎造贼蚤责造藻曾 孕悦砸援 栽澡藻 孕悦砸 泽赠泽贼藻皂 泽怎糟澡 葬泽 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬灶凿 糟燥灶贼藻灶贼 燥枣 责则蚤皂藻则泽
憎藻则藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 澡蚤早澡 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 孕悦砸 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿 憎澡藻灶 贼澡藻 枣蚤灶葬造 则葬贼蚤燥 燥枣 贼澡藻
责则蚤皂藻则 蚤泽 员郾 园颐 园郾 缘 颐 园郾 缘 枣燥则 月贼袁 晕孕栽域 葬灶凿 晕韵杂 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠袁 葬灶凿 贼澡藻 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 蚤泽 缘怨 益 援 月葬泽藻 燥灶
贼澡藻泽藻袁 葬 贼藻糟澡灶蚤糟葬造 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 泽藻贼 怎责 贼燥 凿藻贼藻糟贼 贼澡藻 月贼袁 晕孕栽域袁 晕韵杂 早藻灶藻 燥枣 蚤灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 孕援 灶蚤早则葬 憎蚤贼澡
贼则蚤责造藻 孕悦砸袁 葬灶凿 贼澡藻 择怎蚤糟噪袁 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 葬灶凿 葬糟糟怎则葬贼藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 憎葬赠 燥枣 蚤灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 孕援 灶蚤早则葬 憎葬泽
葬糟澡蚤藻增藻凿援 摇
运藻赠 憎燥则凿泽院 蚤灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟曰 孕燥责怎造怎泽 灶蚤早则葬曰 皂怎贼蚤责造藻曾 孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶曰 枣燥则藻蚤早灶 早藻灶藻
圆园 世纪 苑园 年代以来袁植物基因工程技术飞速
发展袁据国际农业生物技术应用咨询服务中心
渊陨杂粤粤粤冤统计袁截止到 圆园园愿 年底全球转基因植物的
种植已遍布 圆缘 个国家和地区袁种植面积约 员郾 圆缘 亿
第 猿 期 刘海涛等院抗虫转基因欧洲黑杨多重 孕悦砸技术检测体系构建
澡皂圆袁相当于世界上 员缘 亿 澡皂圆 耕地的 愿豫 袁从 员怨怨远
年转基因植物第 员 次实现商业化袁累计 员圆 年的全球
价值达 源怨愿 亿美元咱员暂 遥 在转基因植物研究取得了举
世瞩目的成就的同时袁国际上也多次出现了有关转
基因植物安全性负面事件袁引起了学术界的广泛争
论咱圆暂 遥 为了消除转基因产品的安全隐患和消费者对
转基因产品安全性方面的疑虑袁世界许多国家对转
基因产品的研究开发尧生产销售及在自然环境里的
代谢降解等各个环节都制订了严格的法规条例曰同
时袁越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制
度袁对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严
格的要求袁各种转基因检测技术也逐渐成为研究
热点遥
孕悦砸渊孕燥造赠皂藻则葬泽藻 糟澡葬蚤灶 则藻葬糟贼蚤燥灶冤是 圆园 世纪 愿园 年
代末发展起来的应用最广泛的分子生物学技术之
一袁现已渗透到生命科学的各个领域袁孕悦砸作为一种
快速尧灵敏的核酸检测方法袁在转基因产品的检测上
已得到广泛的认可和应用袁但采用普通 孕悦砸 检测多
个转基因成分时袁一次反应只能扩增出一个目的基
因片段袁存在效率偏低袁操作繁琐袁且成本较高等问
题曰而且如果事先不清楚待测样品的转基因背景袁普
通 孕悦砸的检测结果可能不可靠院因为大多数转基因
植物中的启动子和终止子都是 悦葬酝灾猿缘杂 启动子和
晕韵杂终止子袁而 猿缘杂 启动子天然存在于花椰菜花叶
病毒中袁晕韵杂 终止子天然存在于植物病毒 栽蚤 质粒
中袁所以针对启动子和终止子的单一基因的检测无
法排除病毒感染的可能性遥 多重 孕悦砸 渊酝怎造贼蚤责造藻曾
孕燥造赠皂藻则葬泽藻 悦澡葬蚤灶 砸藻葬糟贼蚤燥灶袁 酝孕悦砸冤是指在一个单一
反应体系中加入一对以上的特异性引物对袁一次性
扩增多个序列的反应过程袁从而实现同时检测出多
个目的基因片段遥 与普通 孕悦砸相比袁多重 孕悦砸无疑
极大的加快检测进程袁提高了检测效率遥 自从 员怨愿愿
年 悦澡葬皂遭藻则造葬蚤灶 等咱猿暂首先报道多重 孕悦砸 以来袁因该
技术具有高效快捷尧高产率尧高度特异性等优点而被
广泛的应用于植物种质纯度鉴定尧植物病虫害检测尧
植物分子育种等方面咱源 原 苑暂 遥 目前利用多重 孕悦砸 技
术检测转基因植物袁大多局限于转基因玉米渊在藻葬
皂葬赠泽 蕴援 冤尧大豆渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾 蕴援 冤等农作物和转基因
花卉等观赏植物咱愿 原 怨暂 遥 将多重 孕悦砸 技术应用于转
基因木本植物外源基因的检测方面的研究报道相对
较少袁国内仅见于对转基因白桦渊月藻贼怎造葬 责造葬贼赠责澡赠造造葬
杂怎噪援 冤及转基因番木瓜渊悦葬则蚤糟葬 责葬责葬赠葬 蕴援 冤的研究
中咱员园 原 员员暂 遥 转 月贼基因欧洲黑杨渊孕燥责怎造怎泽 灶蚤早则葬 蕴援 冤是
国际上少数几种被批准商品化的木本植物之一袁在
我国转 月贼 基因欧洲黑杨已在 苑 省 愿 个基点大田释
放袁是世界上释放面积最大的转基因树木咱员圆暂 遥 目
前袁中国还没有建立这类转基因杨树产品的国家检
测标准袁而转基因木本植物及其产品的检测已被纳
入国内外检验检疫部门的检测项目袁成为各主要贸
易国的一项重要工作遥 因此袁开展转基因欧洲黑杨
外源基因 孕悦砸检测技术的探索袁构建出一套快速定
性检测抗虫转基因欧洲黑杨的标准体系袁以期为相
关的检验检疫部门提供技术支持是一项十分有意义
的工作遥 本研究以转 月贼基因的欧洲黑杨为材料袁利
用 孕悦砸技术对转基因植物中常用的启动子尧终止
子尧选择标记基因和目的基因等多个外源基因进行
检测袁以期建立可同时扩增 月贼 基因尧晕孕栽域基因和
晕韵杂基因的三重 孕悦砸检测的技术体系袁从而实现对
抗虫转基因欧洲黑杨的快速尧高效尧准确的鉴定遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 转基因植株及阳性对照
于 圆园园愿 年 远 月进行实验样品的采集工作遥 抗
虫转基因欧洲黑杨无性系 灶员缘猿尧阴性对照非转基因
欧洲黑杨无性系 悦运圆 的鲜叶均采自中国林科院北
京玉泉山下实验苗圃地袁采集后放入便携式小冰箱
中迅速带回实验室用无菌蒸馏水冲洗干净并阴干后
放入 原苑愿 益超低温冰箱中冷冻储藏备用遥 阳性对
照质粒渊孕造葬泽皂蚤凿冤由中国林科院林业研究所胡建军
副研究员提供遥
员援 圆摇 试剂及仪器
员援 圆援 员摇 主要试剂摇 圆 伊 栽葬择 孕悦砸 酝葬泽贼藻则酝蚤曾渊产品组
成院栽葬择 孕燥造赠皂藻则葬泽藻 园郾 员 哉窑滋蕴 原员袁缘园园 滋皂燥造窑蕴 原员
凿晕栽孕 藻葬糟澡袁圆园 皂皂燥造窑 蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造 渊 责匀 愿郾 猿 冤袁员园园
皂皂燥造窑蕴 原员运悦造袁猿 皂皂燥造窑蕴 原员酝早悦造圆 冤袁其它稳定剂和
增强剂购自 栽陨粤晕郧耘晕公司曰造葬凿凿藻则 阅晕粤 酝葬噪藻则 购自
栽陨粤晕郧耘晕公司曰其余试剂为国产分析纯遥 引物由北
京奥科生物技术有限责任公司合成遥
员援 圆援 圆摇 主要仪器摇 普通 孕悦砸扩增仪渊粤月陨怨苑园园冤袁温
度梯度 孕悦砸扩增仪渊月陨韵鄄砸粤阅 阅晕粤 耘灶早蚤灶藻冤袁电泳仪
渊孕杂 圆粤圆园园冤袁全自动凝胶成像分析仪渊郧月韵载鄄匀砸冤遥
员援 猿摇 总 阅晕粤的提取
用改良的 悦栽粤月 法提取杨树叶片中的总
阅晕粤咱员猿暂 遥 主要步骤如下院
渊员冤圆 伊 悦栽粤月 提取缓冲液院圆豫 渊憎 辕 增冤 悦栽粤月袁
员郾 源 皂皂燥造窑蕴 原员晕葬悦造袁园郾 圆豫 渊增 辕 增冤茁鄄皂藻则糟葬责贼燥藻贼澡葬灶燥造袁
缘猿猿
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆源 卷
圆园 皂皂燥造 窑 蕴 原员 耘阅栽粤袁 员园园 皂皂燥造 窑 蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造
渊责匀愿郾 园冤袁远园 远缘 益水浴预热曰
渊圆冤将 园郾 圆 早植物叶片在液氮中研磨成粉末袁转
移至 员郾 缘 皂蕴离心管中曰
渊猿冤加入 苑园园 滋蕴 圆 伊 悦栽粤月 缓冲液袁远缘 益水浴
猿园 皂蚤灶袁期间稍加混匀曰
渊源冤加等体积的氯仿 颐 异戊醇 渊圆源 颐 员 冤袁轻柔
混匀曰
渊缘冤员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 员园 皂蚤灶袁小心将上清液
转移到干净的 员郾 缘 皂蕴离心管中曰
渊远冤园郾 愿 灾 预冷异丙醇渊或 圆 灾 预冷的无水乙
摇 摇 摇
醇冤和 园郾 员 灾 猿 皂燥造窑蕴 原员 晕葬粤糟渊责匀缘郾 圆冤沉淀 阅晕粤袁
在 原圆园 益下放置 猿园 皂蚤灶以上曰
渊苑冤员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 员园 猿园 皂蚤灶袁沉淀用
苑园豫预冷乙醇洗涤 员 圆 次曰
渊愿冤用适量 栽耘或去离子灭菌水 缘园 滋蕴溶解曰
渊怨冤采用紫外分光光度法检测 阅晕粤浓度遥
根据 韵阅圆远园值计算提取的 阅晕粤 浓度袁并依据测
得的浓度将 阅晕粤溶液稀释到 圆园 灶早窑皂蕴 原员袁 原 圆园 益
保存备用遥
员援 源摇 引物
本实验所用特异性引物见表 员遥
表 员摇 引物序列及扩增产物大小
扩增基因渊序列冤 引物名称 引物序列渊缘爷要猿爷冤 产物 辕 遭责
悦葬酝灾 猿缘杂启动子 猿缘杂 云燥则憎葬则凿
猿缘杂 砸藻增藻则泽藻
郧悦栽悦悦栽粤悦粤粤粤栽郧悦悦粤栽悦粤栽栽郧悦
郧粤栽粤郧栽郧郧郧粤栽栽郧栽郧悦郧栽悦粤栽悦悦悦 员怨缘
晕韵杂终止子 晕韵杂 云燥则憎葬则凿
晕韵杂 砸藻增藻则泽藻
郧粤粤栽悦悦栽郧栽栽郧悦悦郧郧栽悦栽栽郧
栽栽粤栽悦悦栽粤郧栽栽栽郧悦郧悦郧悦栽粤 员愿园
晕孕栽域卡那霉素抗性基因 晕孕栽域云燥则憎葬则凿
晕孕栽域砸藻增藻则泽藻
栽悦悦郧郧悦悦郧悦栽栽郧郧郧栽郧郧粤郧粤郧
悦栽郧郧悦郧悦郧粤郧悦悦悦悦栽郧粤栽郧悦栽 源苑园
月贼苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因 月贼 云燥则憎葬则凿
月贼 砸藻增藻则泽藻
郧粤粤栽栽悦郧悦栽粤郧郧粤粤悦悦粤粤郧悦悦粤栽栽
粤粤郧栽粤栽粤栽悦悦粤栽悦粤粤粤栽郧栽郧郧粤悦栽 苑园园
则遭糟蕴杨树叶绿体内源基因 则遭糟蕴 云燥则憎葬则凿
则遭糟蕴 砸藻增藻则泽藻
粤悦郧郧郧悦栽栽粤悦悦粤郧栽悦栽栽郧粤栽
粤悦郧悦粤栽粤粤粤栽郧郧栽栽郧郧郧粤郧栽栽 源圆缘
员援 缘摇 单重 孕悦砸扩增
反应体系成分及用量见表 圆遥
表 圆摇 孕悦砸反应体系渊圆缘 滋蕴冤
成分 用量 辕 滋蕴
圆 伊 孕悦砸 酝蚤曾贼藻则 员圆援 缘
孕则蚤皂藻则 员 渊员园 滋皂燥造窑蕴 原员 冤 员援 园
孕则蚤皂藻则 圆 渊员园 滋皂燥造窑蕴 原员 冤 员援 园
阅晕粤 渊圆园 灶早窑皂蕴 原员 冤 员援 园
无菌去离子水 怨援 缘
摇 摇 注院每次反应均以无菌去离子水替代模板 阅晕粤 作为对照袁检测
反应成分中有无污染遥
孕悦砸反应采用如下循环参数院预变性院怨缘 益袁缘
皂蚤灶曰变性院怨缘 益袁猿园 泽寅退火院缘圆 远愿 益 渊缘圆郾 源尧
缘猿郾 源尧缘源郾 远尧缘远郾 猿尧缘愿郾 愿尧远员郾 缘尧远猿郾 愿尧远缘郾 缘尧远远郾 愿尧远苑郾 苑
益冤袁猿园 泽寅延伸院苑圆 益袁源缘 泽渊猿缘 个循环冤曰抚平院苑圆
益袁苑 皂蚤灶遥
扩增产物用 员豫琼脂糖凝胶在 员 伊 栽粤耘 电泳缓
冲液中电泳袁以凝胶成像系统检测并记录扩增产物
在琼脂糖凝胶上的条带袁确定每对引物的最佳退火
温度遥 染料用量为院员园园 皂蕴 琼脂糖凝胶 垣 缘 滋蕴
郧燥造凿灾蚤藻憎袁缘 滋蕴电泳样品 垣员 圆 滋蕴 杂再月砸郧则藻藻灶遥
员援 远摇 三重 孕悦砸检测体系的优化
在单重 孕悦砸确定各个引物的最佳退火温度范围
的基础上袁综合考虑各个引物的最佳退火温度袁确定
三重 孕悦砸检测体系的最佳退火温度遥 反应体系设定
为 缘园 滋蕴袁对引物浓度进行优化袁月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂 终浓
度的配比设 猿个组合院粤尧员颐 员颐 员曰月尧员颐 园郾 缘颐 员曰悦尧员颐 园郾 缘
颐 园郾 缘袁单位院滋蕴遥 模板 阅晕粤 员郾 园 滋蕴袁圆 伊 孕悦砸 酝蚤曾贼藻则 圆缘
滋蕴袁无菌去离子水补足至 缘园 滋蕴遥 孕悦砸反应的循环参
数除退火温度外袁其他条件与单重 孕悦砸 反应条件相
同遥 扩增产物的检测方法同 员郾 缘节遥
员援 苑摇 孕悦砸空白对照尧阴性对照及内标基因
空白对照以无菌去离子水作为模板进行 孕悦砸
扩增曰阴性对照以欧洲黑杨未转化植株 悦运圆 叶片提
取的 阅晕粤 作为模板进行 孕悦砸 扩增曰内标基因采用
本实验室设计的核酮糖 员袁缘鄄二磷酸羧化酶 辕加氧酶
大亚基基因渊砸蚤遭怎造燥泽藻 遭蚤泽责澡燥泽责澡葬贼藻 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 辕 燥曾赠鄄
早藻灶葬泽藻 造葬则早藻 泽怎遭怎灶蚤贼袁简称 则遭糟蕴 基因冤袁它是由叶绿体
阅晕粤编码袁属于比较保守的功能基因遥 本实验针对
此内标基因设计的通用引物在五大派杨树中均得到
了良好的扩增效果袁相关试验结果另有报道咱员猿暂 遥
远猿猿
第 猿 期 刘海涛等院抗虫转基因欧洲黑杨多重 孕悦砸技术检测体系构建
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 阅晕粤提取质量分析
本实验采用改良的 悦栽粤月 法提取的杨树叶片基
因组 阅晕粤袁经紫外分光光度计测定并记录其在 圆远园尧
圆愿园 灶皂 的紫外光吸收率袁韵阅圆远园值在 员郾 愿 左右袁说明
纯度很好遥
圆援 圆摇 单重 孕悦砸扩增检测体系的建立
为了优化 孕悦砸 反应条件袁本研究设置了 员园 个
不同的退火温度以分别进行不同检测基因最佳退火
温度筛选试验袁图 员 是各个引物进行退火温度筛选
试验的检测结果遥
图 员摇 各个引物进行退火温度筛选试验的检测结果渊电泳支持物
为 员豫琼脂糖袁酝为 员园园 遭责 责造怎泽 阅晕粤 造葬凿凿藻则袁从下至上的条带分别
为 员园园尧圆园园尧猿园园尧源园园尧缘园园尧远园园尧苑园园尧愿园园尧怨园园尧员 园园园尧员 缘园园尧圆 园园园尧
猿 园园园尧缘 园园园 遭责袁员 员园 代表的退火温度依次为院缘圆郾 源尧缘猿郾 源尧缘源郾 远尧
缘远郾 猿尧缘愿郾 愿尧远员郾 缘尧远猿郾 愿尧远缘郾 缘尧远远郾 愿尧远苑郾 苑 益遥冤
从图 员 可以看出院晕孕栽域引物的 孕悦砸 扩增产物
经电泳后袁在 缘圆郾 源 远苑郾 苑 益之间均有明显尧清晰尧
单一尧大小一致的目的条带出现袁且温度越高袁条带
越清晰遥 猿缘杂引物的 孕悦砸 扩增产物经电泳后袁退火
温度在 缘圆郾 源 远猿郾 愿 益之间虽有明亮条带袁但也存
在明显的非特异性条带曰退火温度在 远缘郾 缘 远苑郾 苑
益之间时袁非特异性条带不明显袁目的条带较清晰袁
扩增效果较好遥 月贼引物的 孕悦砸 扩增产物经电泳后袁
退火温度在 缘圆郾 源 远员郾 缘 益之间时均有明显尧清晰尧
单一尧大小一致的目的条带袁扩增效果好曰退火温度
在 远猿郾 愿 远苑郾 苑 益之间时袁无目的条带出现或有较
弱的非特异性条带出现遥 晕韵杂 引物的 孕悦砸 扩增产
物经电泳后袁退火温度在 缘圆郾 源 远苑郾 苑 益之间均有
明显尧清晰尧大小一致的目的条带出现袁但在 缘圆郾 源
缘远郾 猿 益时有非特异性条带出现袁温度为 缘愿郾 愿
远苑郾 苑 益时袁扩增效果相对较为理想遥 综上所述袁针
对 月贼袁晕孕栽域袁晕韵杂 引物的三重 孕悦砸 的检测体系的
退火温度理论上应该设定为 缘怨 益较为理想遥 图 圆
显示的就是以 缘怨 益退火温度分别针对 月贼袁晕孕栽域袁
晕韵杂基因的单重 孕悦砸检测结果遥
图 圆摇 月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂基因的单重 孕悦砸 检测结果渊电泳支持物为
员豫琼脂糖袁酝员 为 阅晕粤 酝葬噪藻则 玉袁从下至上的条带分别为 员园园尧
圆园园尧猿园园尧源园园尧缘园园尧远园园 遭责袁退火温度均为 缘怨 益遥冤
圆援 猿摇 三重 孕悦砸检测体系的建立
圆援 猿援 员摇 特异性引物最适反应浓度的确定摇 引物浓
度直接影响到 孕悦砸的扩增效果袁引物过多会产生错
误引导或产生引物二聚体袁过低则降低产量遥 一般
孕悦砸反应中的引物终浓度为 园郾 圆 员郾 园 滋皂燥造窑蕴 原员遥
设定退火温度为 缘怨 益袁引物浓度优化实验结果图 猿
表明院当转基因欧洲黑杨 月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂 的引物浓
度比为 员颐 员颐 员 或 员郾 园颐 园郾 缘颐 员郾 园 时袁猿 个目的片段虽然
都得到了扩增袁但有些片段不是很清楚袁只能隐约可
见袁且非特异性明显曰只有当引物浓度比为 员郾 园颐 园郾 缘
颐 园郾 缘 时袁月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂基因均得到了有效的扩增袁
猿 条目的片段清晰可见袁且只有极为微弱的非特异
性条带出现袁效果相对较好遥
圆援 猿援 圆摇 最适退火温度的确定摇 退火温度是影响多
重 孕悦砸扩增的一个非常重要因素袁因此对退火温度
进行进一步优化确定是非常必要的遥 设定 月贼尧晕孕栽
域尧晕韵杂的引物浓度比为 员郾 园颐 园郾 缘 颐 园郾 缘袁设置了 员圆
个不同的退火温度遥 由图 源 可以看出院当退火温度
位于 缘源郾 缘 远猿郾 缘 益时袁均可以实现 月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂
基因的三重 孕悦砸袁以 缘怨郾 缘 益效果最好袁这与单重
孕悦砸 得出的理论最适退火温度为 缘怨 益的结论相
符合遥
苑猿猿
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆源 卷
图 猿摇 特异性引物 月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂 基因最适反应浓度的优化渊电
泳支持物为 员豫琼脂糖袁酝为 阅圆园园园袁从下至上的条带分别为 员园园尧
圆缘园尧缘园园尧苑缘园尧员 园园园尧圆 园园园 遭责袁孕 为质粒阳性对照袁宰 为去离子水
空白对照袁退火温度为 缘怨 益遥冤
图 源摇 三重 孕悦砸最适退火温度的确定及验证渊电泳支持物为 员豫
琼脂糖袁酝为 阅圆园园园袁从下至上的条带分别为 员园园尧圆缘园尧缘园园尧苑缘园尧
员 园园园尧圆 园园园 遭责袁员 员圆 代表的退火温度依次为院缘园援 园尧缘园援 源尧
缘员郾 源尧缘圆援 远尧缘源援 缘尧缘远援 愿尧缘怨援 缘尧远员援 愿尧远猿援 缘尧远源援 愿尧远缘援 苑尧远远援 园 益遥冤
猿摇 结论与讨论
通常袁转基因产品的检测方法要求具有快速尧简
便尧灵敏尧可靠尧适应样品量大等特点遥 目前袁国际上
转基因产品的检测方法主要是基于插入的外源基因
和表达产物的基础上袁包括 阅晕粤 检测方法和蛋白质
检测方法咱员源暂 遥 此外袁还可以利用酶法分析尧组织化
学定位等方法快速检测鉴定报告基因的表达袁对转
基因产品进行初步分析遥 以 阅晕粤 为基础的检测方
法又包括聚合酶链式反应 孕悦砸尧 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交尧
晕燥则贼澡藻则灶杂交尧砸栽鄄孕悦砸 等曰以蛋白质为基础的检测
方法主要包括 耘蕴陨杂粤 检测和 宰藻泽贼藻则灶 杂交遥 用于
孕悦砸检测的 阅晕粤材料用量少袁提取方便袁快速袁适合
大批量样品分析袁适用于转基因产品的初步检测遥
杂燥怎贼澡藻则灶尧晕燥则贼澡藻则灶尧宰藻泽贼藻则灶 杂交分别从整合尧转录尧
翻译水平检测外源基因袁说服力强曰但这些分子杂交
技术操作繁琐且费用高袁不适合大批量的检测袁可在
孕悦砸检测为阳性结果的基础上对转基因产品做进一
步的鉴定遥
利用 孕悦砸 检测转基因植物时袁通常要通过 圆 种
或 圆 种以上的转基因成分的检测结果来判断是否为
转基因产品遥 另外袁通常还需要检测植物的内源基
因以确定是否提取到 阅晕粤或 阅晕粤提取物中是否存
在抑制 孕悦砸反应的物质遥 普通 孕悦砸 方法在检测这
些转基因成分和内源基因上存在着种种缺点和弊
端袁利用多重 孕悦砸技术检测转基因植物的应用前景
较好曰同时由于多重 孕悦砸 的复杂性袁基因组 阅晕粤 的
提取质量尧引物设计尧引物组合尧引物浓度的比例尧退
火温度等都会影响到多重 孕悦砸 的检测效果袁因此不
同基因渊片段冤组合的多重 孕悦砸 反应体系和反应条
件都需要进行优化咱源袁 苑袁 员缘 原 员苑暂 遥
本实验通过对普通 孕悦砸和多重 孕悦砸的比较袁证
明了该方法在转基因木本植物欧洲黑杨上同步检测
外源基因的可行性遥 同时袁针对基因组 阅晕粤 的提
取尧引物的特异性尧解链温度尧引物浓度比等方面袁对
月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂三个基因的多重 孕悦砸条件进行了摸
索袁建立并优化了 猿 个基因组合的多重 孕悦砸 检测体
系袁当 月贼尧晕孕栽域尧晕韵杂 三个基因引物的终浓度配比
为 员颐 园郾 缘 颐 园郾 缘袁退火温度为 缘怨 益时袁所建立的多重
孕悦砸检测体系能够有效地检测出抗虫转基因欧洲黑
杨中的转基因成分袁实现了对抗虫转基因欧洲黑杨
的快速尧高效尧准确的鉴定遥 同普通 孕悦砸 相比袁本方
法简化了检测步骤袁节约了大量原料袁效率明显提
高袁结果也确凿可靠曰同时袁这一研究结果也为下一
步利用全自动化毛细管电泳仪检测大批量转基因杨
树及其产品奠定了良好的基础遥
参考文献院
咱员暂 允葬皂藻泽 悦援 圆园园愿 年全球生物技术 辕转基因作物商业化发展态势要
第一个十三年渊员怨怨远 原 圆园园愿冤咱允暂 援中国生物工程杂志袁 圆园园怨袁 圆怨
渊圆冤院 员 原 员园
咱圆暂 云蚤则灶 砸 阅袁 允燥灶藻泽 悦 郧援 杂藻糟燥灶凿葬则赠 皂藻贼葬遭燥造蚤泽皂 葬灶凿 贼澡藻 则蚤泽噪泽 燥枣 郧酝韵泽
咱允暂 援 晕葬贼怎则藻袁 员怨怨怨袁 源园园渊源苑猿怨冤院 员猿 原 员源
咱猿暂 悦澡葬皂遭藻则蚤葬灶 允 杂袁 郧蚤遭遭泽 砸 粤袁 砸葬灶蚤藻则 允 耘袁 藻贼 葬造援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 泽糟则藻藻灶蚤灶早
燥枣 贼澡藻 凿怎糟澡藻灶灶藻 皂怎泽糟怎造葬则 凿赠泽贼则燥责澡赠 造燥糟怎泽 增蚤葬 皂怎造贼蚤责造藻泽 阅晕粤 葬皂责造蚤枣蚤鄄
糟葬贼蚤燥灶咱允暂 援 晕怎糟造 粤糟蚤凿泽 砸藻泽袁 员怨愿愿袁员远院员员源员 原 员员缘远
咱源暂 刘正斌袁 高庆荣袁 王瑞霞袁 等援 多重 孕悦砸 技术在植物生物学中
研究的应用咱允暂 援分子植物育种袁 圆园园缘袁 猿渊圆冤院 圆远员 原 圆远愿
咱缘暂 云则葬葬蚤躁藻 月 粤袁 蕴燥增藻造造 阅 允袁 悦燥藻造澡燥 允 宰袁 藻贼 葬造援 孕悦砸鄄遭葬泽藻凿 葬泽泽葬赠泽 贼燥 葬泽鄄
泽藻泽泽 憎澡藻葬贼 增葬则蚤藻贼葬造 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 遭造燥贼糟澡 葬灶凿 则怎泽贼 凿蚤泽藻葬泽藻泽咱 允暂 援 耘怎则燥鄄
责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园员袁 员园苑渊怨冤院 怨园缘 原 怨员苑
咱远暂 酝葬贼泽怎燥噪葬 栽袁 运怎则蚤遭葬则葬 匀袁 粤噪蚤赠葬皂葬 匀袁 藻贼 葬造援 粤 皂怎造贼蚤责藻曾 孕悦砸 皂藻贼澡鄄
燥凿 燥枣 凿藻贼藻糟贼蚤灶早 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 阅晕粤泽 枣则燥皂 枣蚤增藻 造蚤灶藻泽 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 皂燥凿蚤鄄
枣蚤藻凿 皂葬蚤扎藻咱允暂 援 杂澡燥噪怎澡蚤灶 耘蚤泽藻蚤早葬噪怎 在葬泽泽澡蚤袁 圆园园员袁 源圆渊员冤院 圆源 原 猿圆
愿猿猿
第 猿 期 刘海涛等院抗虫转基因欧洲黑杨多重 孕悦砸技术检测体系构建
咱苑暂 陶摇 震袁杨胜利袁龚摇 毅援 利用 酝孕悦砸 方法快速检测植物基因背
景咱允暂 援生物技术通报袁 圆园园园袁 渊远冤院 猿苑 原 源员
咱愿暂 邵碧英袁陈文炳袁李寿崧袁等援 转基因花卉的 阅晕粤 提取与多重
孕悦砸分析咱 允暂 援 厦门大学学报院自然科学版袁圆园园圆袁源员 渊缘冤院远苑源
原 远苑愿
咱怨暂 吴摇 影袁陆徐忠袁赵摇 伟袁等援 多重 孕悦砸 分析方法应用于转基因
农作物的检测咱允暂 援安徽农业科学袁圆园园远袁猿源渊苑冤院员圆怨苑 原 员圆怨怨
咱员园暂 詹亚光袁苏摇 涛袁韩摇 梅袁等援 转基因白桦外源基因的多重 孕悦砸
快速检测咱允暂 援植物研究袁圆园园远袁圆远渊源冤院源愿园 原 源愿缘
咱员员暂 杨冬燕袁 杨勇存袁 邓平建援 转基因番木瓜 缘缘鄄员 的多重 孕悦砸 鉴
定方法研究咱允暂 援中国卫生检疫杂志袁圆园园远袁员远渊员园冤院员员缘远 原 员员缘苑
咱员圆暂 侯英杰袁张冰玉袁苏晓华援 转基因林木潜在生态风险研究进展
咱允暂 援中国生物工程杂志袁圆园园远袁圆远渊员圆冤院员员苑 原 员圆员
咱员猿暂 刘海涛袁张川红袁马摇 淼袁等援杨属转基因植物 孕悦砸检测内标准
基因的建立咱允暂 援广东农业科学袁圆园员园袁猿苑渊猿冤院圆园愿 原 圆员员
咱员源暂 贺熙勇袁陈善春袁彭爱红援转基因植物的分子检测与鉴定方法及
进展咱允暂 援热带农业科技袁圆园园愿袁猿员渊员冤院猿怨 原 源源
咱员缘暂 邵碧英袁江树勋袁陈文炳袁等援番茄尧甜椒中转基因成分和内源基
因的多重 孕悦砸检测方法的建立咱 允暂 援 食品科学袁圆园园源袁圆缘渊员园冤院
圆园怨 原 圆员猿
咱员远暂 黄银花袁胡晓湘袁徐慰倬袁等援 影响多重 孕悦砸 扩增效果的因素
咱允暂 援遗传袁圆园园猿袁圆缘渊员冤院远缘 原 远愿
咱员苑暂 允葬皂藻泽 阅袁 杂糟澡蚤凿贼 粤 酝袁 宰葬造造 耘袁 藻贼 葬造援 砸藻造蚤葬遭造藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 蚤凿藻灶鄄
贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 皂葬蚤扎藻袁 泽燥赠遭藻葬灶袁 葬灶凿 糟葬灶燥造葬 遭赠
皂怎造贼蚤责造藻曾 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽咱允暂 援 允 粤早则蚤糟 云燥燥凿 悦澡藻皂袁 圆园园猿袁 缘员院缘愿圆怨
原 缘愿猿源
怨猿猿