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林业科学研究　2009, 22 (1) : 115～119
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0120115205
中国水仙 ZDS基因的克隆及表达分析
陈段芬 1, 3 , 彭镇华 1, 23 , 高 　健 1
(1. 国际竹藤网络中心 ,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 ,北京　100102;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091; 3. 河北农业大学园艺学院 ,河北 保定　071001)
关键词 :中国水仙 ; ZDS 基因 ;序列分析 ;组织表达
中图分类号 : S682. 2 + 1 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007212206
基金项目 : 国家林业局 948项目 (2006242C07)
作者简介 : 陈段芬 (1968—) ,女 ,河北宁晋人 ,博士 ,主要从事观赏植物栽培和分子育种研究.3 通讯作者.
C lon ing and Expression Ana lysis of ZDS Gene in
N a rc issus taze tta var. ch inensis
CHEN Duan2fen1, 3 , PENG Zhen2hua1, 23 , GAO J ian1
(1. International Center for Bamboo and Rattan; Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, State Forestry Adm inistration,
Beijing　100102, China; 2. Research Institute of Forestry, CAF, Beijing　100091, China; 3. College of Horticulture,
Agricultural University of Hebei, Baoding　071001, Hebei, China)
Abstract:A new gene, named asN TZDS1 ( GenBank accession number: EU138882) , was cloned from the alabastrum
of N arcissus tazetta var. chinensis through RT2PCR. The sequence consists of 1 899 bp, has an open reading frame of
1 725 bp encoding a polypep tide of 574 am ino acids. Homology analysis showed that the deduced NTZDS1 p rotein was
highly homologous to other ZDS p roteins from different species. Phylogenetic analysis indicated thatN TZDS1 wasmore
related to ZDS of N arcissus pseudonarcissus (O 49901). N TZDS1 gene was detected in flowers, leaves and roots excep t
scales, and exp ression level was especially high in flowers. W ithin open flowers, level was the highest in petals and
higher in corana while lower in stamens and p istils.
Key words:N arcissus tazetta var. ch inensis; ZDS gene; sequence analysis; tissue exp ression.
　　中国水仙 (N arcissus tazetta L. var. ch inensis Ro2
em)是我国著名的传统名花 ,其花姿秀美 ,花香馥
郁 ,在花卉出口中占有重要份额 ;但长期以来 ,中国
水仙品种稀少 ,花色单一 ,所以花色创新一直是中国
水仙育种的重要目标之一 [ 1 ]。由于中国水仙为同源
三倍体植物 ,利用有性杂交或实生育种很难实现品
种创新 [ 2 ]。近年来 ,利用植物基因工程改良花色取
得的进展为中国水仙的品种创新奠定了基础。已有
研究表明 ,水仙花朵中主要成分为类胡萝卜素 ,该类
色素的积累可导致黄色花变为橘红色 [ 3 - 4 ]。ζ - 胡
萝卜素脱氢酶 ( ZDS)是影响类胡萝卜素合成的限速
酶之一 ,该酶可催化 ζ - 胡萝卜素脱氢生成链孢红
素继而进一步脱氢生成番茄红素 ,再进一步合成类
胡萝卜素 [ 5 ] ,所以研究编码该酶的 ZDS基因功能具
有重要意义。本研究通过克隆和分析中国水仙的
ZDS基因 ,研究其组织表达模式 ,以期初步预测该基
因功能 ,进而为通过基因工程选育出花色改变的中
国水仙新品种奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　植物材料和菌株
中国水仙品种 ’金盏银台 ’幼嫩花蕾 (产地为中国
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
漳州 )。大肠杆菌 ( Esherich ia coli) DH5α菌株由国
家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室保存。
1. 2　总 RNA提取与 cD NA合成
采用 Invitrogen公司的 Trizol reagent提取中国
水仙幼嫩花蕾 RNA [ 6 ] ,用 Promega公司的反转录试
剂盒合成 cDNA。
1. 3　基因的克隆与测序
根据 ZDS基因家族的保守区序列设计引物 ,用于
RT2PCR,引物 1: 5′- GGCATGGCTTCTTCCAC TTG - 3′;
引物 2: 5′- TTACATTTGCTTCTTGCGATTTC - 3′。由上
海生工生物工程技术有限公司合成。
以中国水仙 cDNA为模板 ,进行梯度 PCR。在引
物 1和引物 2的反应体系中应用宝生物工程有限公
司的 LA Taq酶 ,反应条件为 : 94 ℃预变性 5 m in;
94 ℃ 1 m in, 54～56 ℃ 1 m in, 72 ℃ 2. 0 m in, 36个循
环 ; 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物电泳分析后用上海申
能博彩生物科技有限公司试剂盒回收 ,按照 Promega
的 pGEM2T easy载体快速连接试剂盒操作流程 ,将回
收的 DNA片段连到载体上 ,转化大肠杆菌 ,经蓝白斑
筛选 ,提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后 ,再将单
克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。
1. 4　序列的生物信息学分析
利用 DNASTAR、SMART和 Clustl W 等生物软
件分析测定 cDNA 序列及其编码蛋白质的结构特
点 ,并与国际核酸和蛋白质数据库联网进行 blast比
较分析。
1. 5　N TZD S1基因的组织表达分析
用 Trizal法从中国水仙花期的不同器官和花的
不同部位提取 RNA ,反转录成 cDNA第 1链。以中
国水仙 18S rRNA 基因为内标调整 cDNA用量和循
环数 ,使内标基因在不同组织的表达丰度一致。在
此条件下扩增不同组织中目的基因 ,用光密度值差
异来表示目的基因在不同组织的表达量。
2　结果与分析
2. 1　基因克隆与结构分析
以反转录合成的中国水仙 cDNA作为模板 ,用
引物 1和引物 2进行扩增反应 , PCR产物在 1%的琼
脂糖凝胶中电泳 , EB染色结果显示 ,在 2 000 bp左
右处有一条亮带 ,与预测的基因片段相符 ,初步确定
为目的基因片段 (图 1)。回收后与 pGEM 2T easy载
体连接 ,转化后将阳性克隆送公司测序。测序结果
表明 ,插入片段大小为 1 899 bp。序列分析表明 ,插
入片段含有一个完整的开放阅读框 ( 1 725 bp ) ,
GenBank登记号为 EU138882。
　　　图 1　梯度 PCR产物电泳结果
1: 54. 6℃; 2: 55. 2℃; 3: 56. 0℃; M: 200 bp分子量标记
利用 MotifScan等生物学软件对 EU138882的序
列进行分析发现 ,该基因包含一个完整的编码 574
个氨基酸 (图 2)的开放读码框 ;其编码肽链的第 66
～538位为一保守结构区域 ,其中的 66～96位具有
ζ
-胡萝卜素脱氢酶 ( ZDS)的典型结构 ———吡啶二
硫酸核苷酸氧化还原酶保守结构域 [ 5 ]。编码蛋白质
等电点和分子量分别为 7. 1和 63 606. 96 Da。把该
基因命名为 N TZDS1。
对蛋白质结构预测分析发现 ,在该肽链中 ,存在
番茄红素环化酶蛋白位点 1个 (67～83) ,吡啶二硫酸
核苷酸氧化还原酶保守结构域 1个 (66～96) ,异戊烯
转移酶α - 亚基重复序列位点 1个 (566～574)。此
外还有氨基化合物位点 1个 ,蛋白激酶 C磷酸化位点
5个 , 酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点 11个 , N - 豆蔻酰化
位点 10个 , N -糖基化位点 3个 ,酪氨酸激酶磷酸化
位点 1个和乙醛脱氢酶谷氨酸活性位点 1个。
2. 2　氨基酸序列比较与系统进化树分析
通过 NCB I在线 B last软件 ,将 N TZDS1基因编
码的蛋白与数据库中已知的序列进行比较分析 ,结
果显示 NTZDS1 ( EU138882)与喇叭水仙 (N arcissus
pseudo2narcissus L. )的 ZDS1 (O 49901)、向日葵 (He2
lian thus annus L. )的 ZDS ( CAD 55814 )、万寿菊
( Tagetes erecta L. )的 ZDS (AAG 10425)、苹果 (M a2
lus pum ilac M ill. )的 ZDS2 (AAQ 04225)有着较高的
一致性 ,氨基酸一致性均达 83%以上 ,其中与喇叭
水仙的 ZDS1一致性最高 ,达 96%。图 3为 N TZDS1
编码的蛋白质与一致性较高的上述 4个物种蛋白质
序列的 ClustalW 比较分析结果 ,可以看出氨基酸序
列的 5’端和 3’端保守性较低 ,而中间保守性较高 ,这
与软件预测的结果一致。
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第 1期 陈段芬等 :中国水仙 ZDS基因的克隆及表达分析
图 2　N TZDS1编码区核酸序列及其推导出的氨基酸序列
(单下划线为保守区 ,灰色方框部分为吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶保守结构域 )
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图 3　N TZDS1编码的氨基酸序列与其他物种 ZDS蛋白的序列比较
　　对 N TZDS1基因编码的蛋白和其他 11个物种
的 ZDS蛋白进行系统进化分析发现 , NTZDS1与喇
叭水仙的 ZDS1的遗传距离最近 ,可归为一类 ;之后
与作为类胡萝卜素合成途径研究的模式植物蕃茄
(ABD67160)和辣椒 (CAA61985)聚在一起 ,然后依
次是苹果 (AAQ04225)和菊花 (BAE78555) ;同为单
子叶植物的龙胆 (BAA88843 )和玉米 (AAV91511 )
没有 与 2 种 水 仙 聚 在 一 支 , 而 是 与 拟 南 芥
(NP974222)和柑橘 (ABC33728)聚在一支 ;向日葵
和万寿菊虽然与中国水仙的 ZDS 基因编码的氨基
酸具有 83%以上的一致性 ,但在系统进化上却与之
相距最远 (图 4)。
图 4　N TZDS1基因编码蛋白的系统进化树分析
2. 3　N TZD S1基因组织表达分析
中国水仙 N TZDS1基因的半定量 PCR分析结
果表明 ,开花期的叶片、根系和花朵中均有该基因的
表达 ,但花中表达量显著高于叶片和根系 ,而在鳞片
中未能检测到该基因的表达 (图 5)。说明该基因在
此时期的花中大量表达 ,可能参与了中国水仙的花
色发育。对花器官不同部位的表达分析发现 ,花瓣、
副冠、雄蕊和雌蕊中均有表达 ,但以花瓣中表达量最
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第 1期 陈段芬等 :中国水仙 ZDS基因的克隆及表达分析
多 ,其次为副冠、雄蕊和雌蕊 (图 6)。上述表达模式
表明 ,该基因在中国水仙花色发育中起着重要作用 ,
尤其是花瓣的显色方面。
图 5　N TZDS1基因在不同器官中的表达
1: 叶片 ; 2: 鳞叶 ; 3: 根系 ; 4: 花
图 6　N TZDS1基因在花中不同部位的表达
1: 花瓣 ; 2: 副冠 ; 3: 雄蕊 ; 4:雌蕊
3　讨论
到目前为止 , ZDS基因已从辣椒、拟南芥、喇叭
水仙、柑橘、向日葵、万寿菊等植物中分离出来 ,其
cDNA长 1. 8～2. 1 kb,编码 558～574个氨基酸 ;
ZDS编码的氨基酸序列中都有一个特征序列 ,即吡
啶二硫酸核苷酸氧化还原酶 [ 5 ]。对中国水仙‘金盏
银台 ’ZDS基因编码的 574个氨基酸序列分析中也
发现了这一特征序列 ,此外还存在番茄红素环化酶
蛋白位点和异戊烯转移酶α - 亚基重复序列位点等
与类胡萝卜素合成相关的结构位点 ,这充分说明了
所得序列的正确性。
氨基酸比较结果表明 ,中国水仙 N TZDS1基因
与喇叭水仙 ZDS 基因编码的蛋白序列一致性高达
96% ,在 574个氨基酸中 ,仅有 18个有所不同 (图
3) ;系统进化树分析同样证明了上述结论 ,说明水仙
属植物的 ZDS蛋白可能是高度保守的 ;但喇叭水仙
大多颜色鲜艳 ,有些品种的花冠呈亮黄色 ,有些品种
的副冠呈橘红色 ,而中国水仙的花冠一般为白色 ,副
冠为黄色 ,由此推测 , ZDS基因编码氨基酸的差异可
能是造成此差异的因素之一。
Zhu等 [ 7 ]在研究开花期龙胆的 ZDS基因表达时
发现 ,龙胆的 ZDS 基因只在花和叶片中表达 ,在茎
中不表达 ;在幼嫩花苞中转录水平最低 ,而在全开的
花中最高 ,这与类胡萝卜素在植物不同器官中的含
量与分布规律呈现出一致性 ,所以该基因的转录控
制着龙胆花发育中类胡萝卜素的积累。本研究中 ,
N TZDS1基因的表达模式与龙胆 ZDS表达模式基本
一致 ,说明 N TZDS1基因对中国水仙花朵中类胡萝
卜素的合成可能具有重要的调控作用。
植物类胡萝卜素是许多植物花和果实中的主要
色素 ,对园艺植物的观赏性有着重要影响。作为类
胡萝卜素合成途径中的重要限速酶 ,ζ- 胡萝卜素脱
氢酶 ( ZDS)在植物的花和果实显色中起着重要作
用 [ 4, 8 - 9 ]。中国水仙 N TZDS1基因的克隆和分析为
进一步研究其基因功能奠定了基础 ;但由于水仙是
单子叶植物 ,农杆菌不甚敏感 ,目前尚未建立成熟的
遗传转化体系 [ 10 ] ,这为验证中国水仙 N TZDS1基因
的功能带来了不便。目前 ,本文作者已经构建了该
基因的植物表达载体 ,并已经将该基因成功转入拟
南芥和矮牵牛中 ,正在进行其功能的鉴定工作。
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