全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (1) : 101～105
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0120101205
广东箣竹内生固氮菌生理特性及促生效果研究
侯 伟 1 , 彭桂香 2 , 许志钧 1 , 陈仕贤 1 , 谭志远 13
(1. 广东省植物分子育种重点实验室 , 华南农业大学农学院 ,广东 广州　510642; 2. 华南农业大学资源环境学院 ,广东 广州　510642)
摘要 :从广东箣竹中分离、筛选得到 5株固氮酶活性高且稳定、生长势强的内生固氮菌株 ,对其生理特性、环境适应
性及其对植物的促生效果进行了系统研究。结果表明 :在无氮培养、温度 18～40 ℃时 ,菌株均能生长且有固氮酶活
性 ,其最适生长及固氮的温度为 26～37 ℃;在偏酸 (pH值 5. 0)和偏碱 (pH值 8. 0)的条件下 ,菌株均能保持较强的
生长势和较高的固氮酶活性 ,并能通过调节自身代谢适应环境的酸、碱变化 ,使培养液趋近中性 ;培养液中 NaCl浓
度在 0. 5～2. 5 g·L - 1、(NH4 ) 2 SO4浓度在 0. 05～0. 50 g·L - 1时 ,菌株均能保持旺盛生长且有较高的固氮酶活性。
接种水稻试验表明 :菌株对植物的生长有一定的促进作用。
关键词 :内生固氮菌 ; 接种效应 ;生理特性 ;固氮酶活性 ;箣竹
中图分类号 : S718. 8 文献标识码 : A
收稿日期 : 2005210211　修回日期 : 2007208230
基金项目 : 国家自然科学基金 (30470002)和广东科技攻关计划 (2007B020711004)
作者简介 : 侯伟 (1980—) ,女 ,硕士研究生 ,主要从事植物内生固氮菌的研究.3 通讯作者 Corresponding author, Email: zytan@ scau. edu. cn Tel: 020238604857, 31458280
Growth2prom oting Effects and Physiolog ica l Property of Endophytic D iazotrophs
Isola ted from Guangdong Bam boo ( B am busa blum eana )
HOU W ei1 , PENG Gui2xiang2 , XU Zhi2jun1 , CHEN Shi2xian1 , TAN Zhi2yuan13
(1. Guangdong Provincial Key Lab of PlantMolecular B reeding, College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
Guangdong, China; 2. College of Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China)
Abstract: Five endophytic diazotrophs with high and stable nitrogenase activity screened from Guangdong bamboo
(B am busa blum eana J. A. et J. H. Schult. f. ) were studied by physiological test, the adap tability to environments
and the growth2p romoting effects on rice. The results showed that these strains could grow well at 18—40 ℃and had
nitrogenase activity at 26—37 ℃for op timum growth under nitrogen2free medium. Strains also showed nitrogenase
activity at a pH range of 5. 0 to 8. 0, at a saline (NaCl) concentration range of 0. 5—2. 5 g·L - 1 and at a range of
0. 05—0. 50 g·L - 1 (NH4 ) 2 SO4. Strains can secrete acid or alkali substance as neutralizer at pH 8. 0 and 5. 0 re2
spectively. Experiments of inoculation on rice showed that strains had obviously effects on p romoting the growth of
p lants.
Key words: endophytic diazotroph; physiological test; growth2p romoting effects; nitrogenase activity;
B am busa blum eana
植物内生固氮菌 ( endophytic diazotroph)是指那
些定殖在植物体内 ,与宿主植物进行联合固氮的一
类微生物 [ 1 ]。固氮微生物都含有固氮酶 ,但内生固
氮菌不需要形成特化结构 [ 2 ] ,并以相当高的数量存
在植物组织内 ,几乎可以在宿主植物的各种营养器
官内发挥固氮作用 ,从而为植物提供氮源 ,而不会引
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
起宿主任何不良反应 [ 3 ]。大量试验表明 ,在各种环
境和土壤条件下 ,接种固氮菌对牧草和谷物是有益
的 ,热带地区联合固氮菌对禾本科植物的固氮量每
年可达 30～40 kg·hm - 2 [ 4 ]。然而 ,联合固氮菌接种
剂由于受土著微生物的竞争及结合态氮、氧、植物基
因型差异和环境条件的变化等众多因素的影响而产
生接种增产效果不稳定的问题 [ 5 ] ,在很大程度上制
约了固氮菌接种剂在农业生产中的应用。本实验从
广东箣竹的根、叶中筛选出固氮活性较高且稳定的
5株内生固氮菌 ,探讨不同温度、酸碱度、渗透压、铵
等环境因子对这些菌株的生长及固氮酶活性的影
响 ,以明确菌株对不同环境条件的适应性及其作为
接种剂的可行性。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
在 2004—2005年利用乙炔还原法从广东箣竹
(B am busa blum eana J. A. et J. H. Schult. f. )根、叶中
分离筛选到 5株具有较高固氮酶活性的内生固氮菌
株 (表 1)。内生固氮菌株的来源及分离、纯化的方
法和 16S rDNA序列分析确定的分类地位见参考文
献 [ 6 ]。
表 1　供试菌株
菌株代号 培养条件 固氮酶活性 / ( nmol·mL - 1 ·h - 1 ) 16S rDNA序列相似性
Z2 好氧 870 与巴西固氮螺菌 (A zospirillum brasilense Tarrand J J) 99%相似性
Zy7 兼性好氧 3 370 与塞内加尔埃希菌 ( Escherich ia senegalensis Mbengue M) 98%相似性
Z13 好氧 2 150 与外来水螺菌 (Aquaspirillum peregrinum Skerman V B D) 99%相似性
Z31 好氧 1 430 与假产碱假单胞菌 ( Pseudom onas pseudoalca ligenes Skerman V B D) 98%相似性
Z43 好氧 1 230 与恶臭假单胞菌 ( Pseudom onas putida Skerman V B D) 97%相似性
1. 2 方法
1. 2. 1 菌株的活化及固氮酶活性的测定 将保存
在冰箱中的菌株接种到 VM 2Ethanol固体培养基中
活化 ,在 28 ℃、湿度 85%条件下 ,分别进行厌氧 (仪
器为 : YQX21型厌氧培养箱 )及好氧培养。
VM 2Ethanol 固 体 培 养 基 的 主 要 成 分 是 :
DÊbereiner2basic 溶 液 10. 0 mL · L - 1 , Fe2EDTA
(0. 66% ) 1. 0 mL·L - 1 ,酵母粉 1. 0 g·L - 1 ,蛋白胨
3. 0 g·L - 1 , NH4 Cl 0. 5 g·L - 1 , NaCl 1. 0 g·L - 1 , K2
PO4 -缓冲液 3. 0 mL ·L - 1 (分开灭菌 ) ,无水乙醇
6. 0 mL·L - 1 (过滤灭菌 ) ,琼脂粉 17 g·L - 1。
DÊbereiner2basic溶液配制 : MgSO4 ·7H2 O 20. 0
g·L - 1 , NaCl 10. 0 g·L - 1 , CaCl2 2. 64 g·L - 1 (分开
灭菌 ) ,MnSO4 ·2H2O 1. 0 g·L - 1 , Na2MoO4 ·2H2 O
0. 2 g·L - 1 ;
Fe2EDTA ( 0. 66% ) 配方 : Na2 EDTA 3. 72 g·
L - 1 , FeSO4 ·7H2 O 2. 78 g·L - 1 ;
K2PO4 2缓冲液配置 : KH2 PO4 146. 2 g ·L - 1 ,
K2 HPO4 187. 1 g·L - 1 , pH值 6. 8。
将已活化的菌株再次接入盛有 NFb[ 7 ]无氮半固
体培养基的试管内 ,密封后置于 28 ℃、湿度 85%的
人工气候箱内进行培养 ; 24 h后 ,向管内注入 10%
体积的乙炔气体 ,在同样条件的人工气候箱内培养
24 h,用乙炔还原法测定其固氮酶活性 (测定仪器为
北分 SP22100气相色谱 )。气相色谱柱温 50 ℃,进
样器 150 ℃, F ID 180 ℃。
1. 2. 2 生理特性试验 在 NFb培养基上 ,在 pH值
7. 0、温度 28 ℃、NaCl浓度 0. 1 g·L - 1的标准条件
下 ,分别进行温度、渗透压、铵浓度和 pH值等各单
因子对菌株生长量和固氮酶活性的影响试验。培养
温度设 18、26、28、30、32、35、37、40 ℃共 8个水平 ,
NaCl浓度设 0. 5、1. 0、2. 5、510、10. 0、50. 0 g·L - 1共
6个水平 ,硫酸铵浓度设 0. 05、0. 25、0. 50、2. 50、
5100 g·L - 1共 5个水平 , pH 值设 4. 0、5. 0、5. 5、
610、6. 5、7. 0、8. 0、10. 0共 8个水平 ;各水平设 3个
重复 ,菌株接种量为 2% (预配 OD600值 1. 0菌悬液 ,
每 10 mL培养基中接种 0. 2 mL菌悬液 )。菌株在
NFb无氮液体培养基上振荡培养 ,用 UV21201型分
光光度计在 600 nm波长处测定各菌悬液的光密度
值 ,作为菌株生长量指标。不同水平下供试菌株的
固氮酶活性测定在 NFb半固体 (含 2 g·L - 1的琼
脂 )培养基上进行 ,采用 1. 2. 1节中的乙炔还原方
法 ,固氮酶活性计算方法见参考文献 [ 8 ]。
1. 2. 3 水稻接种试验 以籼型水稻华航 1号 (O ry2
za sa tiva L. Subsp. ind ica Kato cv. Huahang No. 1
Chen Z Q)进行菌株接种试验。根据水稻种子发芽
的时间 ,将菌株活化好 ,保证菌株在对数生长期内 ,
制成菌悬液 ( 108细胞 ·mL - 1 )浸泡水稻苗 24 h;然
后分别转接到装有水稻无氮营养液 [ 9 ]的大试管里
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第 1期 侯 　伟等 :广东箣竹内生固氮菌生理特性及促生效果研究
(以滤纸为衬质 ) ,放在人工气候箱中光照 ( 10 000
lx)培养 12～14 h·d - 1 ,以不接种的水稻苗为对照 ;
设置 3个重复 ,并及时观察、添加营养液。培养 14 d
后 ,将水稻苗从试管中取出 ,照相 ;同时分别测定水
稻株高及根长。数据采用 SAS软件进行分析 ,多重
比较采用 Duncan法。
2 结果与分析
2. 1 温度对广东箣竹内生固氮菌株生长及固氮酶
活性的影响
由图 1、2可见 :在 pH值 7. 0、NaCl浓度 0. 1 g·
L - 1的条件下 ,菌株 Z2, Zy7, Z13, Z31, Z43在 18～
40 ℃范围内均能生长 ,且固氮酶有活性 ,其中在 26
～37 ℃下菌悬液的 OD600值和固氮酶活性都维持在
较高的水平 ,低于 26 ℃或高于 37 ℃时菌株的生长
量和固氮酶活性都明显下降。这说明 5株固氮菌对
温度的适应性较广 ,其最适生长及固氮温度为 26～
37 ℃。
图 1　不同温度对供试菌株生长量 (OD600 )的影响
图 2　不同温度对供试菌株固氮酶活性的影响
2. 2 酸碱度对广东箣竹内生固氮菌株生长及固氮
酶活性的影响
由图 3、4可知 : 5个菌株在 28 ℃、pH值为 5～8
的培养液内保持了较高的生长量和固氮酶活性 ,其
中 ,在 pH值为 5. 5～6. 5时生长势最强 ,而 pH值为
6～7时固氮酶活性最高。由此可见 ,菌株 Z2、Zy7、
Z13、Z31、Z43具有较广的酸碱度适应范围。由接种
各菌株后培养液的 pH值变化结果 (表 2)可知 :无论
在酸性还是碱性环境下 ,供试菌株的生长繁殖均能
改变介质的 pH值 ,使之趋近中性 ,以利于自身的生
长繁殖 ;其中 ,接种菌株 Zy7培养液的 pH值变化最
大 ,分别从 5上升到 5. 8和从 9. 5下降到 7. 2。
图 3　不同 pH值对供试菌株生长量 (OD600 )的影响
图 4 不同 pH值对供试菌株固氮酶活性的影响
表 2 接种各菌株后培养液 pH值的变化情况
接种菌株
培养液 pH值
配置时 4 5 6 8 10
灭菌后 4 5 6 7. 8 9. 5
Z2 4. 7 5. 5 6. 2 6. 9 8. 9
Zy7 4. 2 5. 8 6. 5 7. 0 7. 2
Z13 接种后 4. 5 5. 7 6. 2 7. 1 7. 4
Z31 4. 3 5. 7 6. 6 6. 9 7. 3
Z43 4. 5 5. 4 6. 1 6. 9 7. 7
2. 3 渗透压对广东箣竹内生固氮菌株生长及固氮
酶活性的影响
从图 5、6可看出 :在 pH值 7. 0、温度 28 ℃下 ,
培养液中 NaCl浓度在 0. 5～2. 5 g·L - 1时 , 5个菌株
都能保持旺盛生长且有较高的固氮酶活性 ;当 NaCl
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
浓度大于 5 g·L - 1时 ,固氮酶活性明显降低 ;当 NaCl
浓度达 10 g·L - 1时 ,菌株仍可生长 ,但无固氮酶活
性 ;当培养液中 NaCl浓度达到 50 g·L - 1时 ,菌株生
长势极其微弱。
图 5 不同 NaCl浓度对供试菌株生长量 (OD600 )的影响
图 6 不同 NaCl浓度对供试菌株固氮酶活性的影响
2. 4 ( NH4 ) 2 SO4浓度对广东箣竹内生固氮菌株生
长及固氮酶活性的影响
从图 7、8可看出 :在 pH 值 7. 0、温度 28 ℃、
NaCl浓度 0. 1 g·L - 1下 ,培养液中 (NH4 ) 2 SO4浓度
在 0. 05～0. 25 g·L - 1时 ,供试菌株都具有较高的固
氮酶活性 ,且菌悬液的 OD600值维持在 0. 5～1. 5;当
(NH4 ) 2 SO4浓度在 0. 25～0. 5 g·L - 1时 ,固氮酶活
性有所降低 ,但乙烯生成量仍能保持在 500 nmol·
mL - 1 ·h - 1以上 ;当 (NH4 ) 2 SO4浓度超过 2. 5 g·L - 1
时 ,菌体量随 (NH4 ) 2 SO4浓度增高急剧增加 ,而菌株
固氮酶活性则相当微弱。
2. 5 菌株接种对水稻生长的影响
表 3表明 :接种不同菌株的水稻的株高与对照
间差异均达显著水平 ,而根长与对照间差异达极显
著水平 ;菌株 Z13促进水稻根长、株高生长最明
显 ,根长、株高比对照分别长 5. 7、7. 3 cm; Z13处
图 7 不同 (NH4 ) 2 SO4浓度对供试菌株
生长量 (OD600 )的影响
图 8 不同 (NH4 ) 2 SO4浓度对供试
菌株固氮酶活性的影响
理的根长与其它菌株处理间差异达极显著水平。
从植株的长势可见 ,接种不同菌株水稻的枝叶色泽
更浓绿 (图 9)。
表 3 接种不同菌株 14 d后水稻的生长特征
项目
菌株
对照 Z2 Zy7 Z13 Z31 Z43
根长 / cm 13. 2C 16. 7B 16. 3B 18. 9A 17. 3B 16. 9B
株高 / cm 30. 1b 34. 5a 33. 7a 37. 4a 35. 9a 35. 6a
　　注 :表中所示数值为平均值 ,同行不同大写字母表示极显著性差
异 (α = 0. 01) ,不同小写字母表示显著性差异 (α = 0. 05)。
图 9 接种菌株 Z13水稻苗的生长情况
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第 1期 侯 　伟等 :广东箣竹内生固氮菌生理特性及促生效果研究
3 小结与讨论
测定结果表明 ,这 5株内生固氮菌对环境因子
具有较广的适应性。无氮培养条件下 ,内生固氮菌
在 18～40 ℃下均能生长且表达固氮酶活性。在 pH
值为 5～8时 ,内生固氮菌均能保持较强的生长势和
较高的固氮酶活性 ,并且能使培养液 pH值趋近中
性 ,说明这些菌株可以通过调节自身代谢 ,分泌不同
的代谢产物来适应环境的酸、碱性变化 [ 10 ]。在 NaCl
浓度达 5. 0 g·L - 1的渗透压下 ,菌株虽能旺盛生长
但固氮酶活性较低。铵的存在能抑制绝大多数菌株
固氮酶活性的表达 ,但从本试验结果可看出 ,菌株
Z2、Zy7、Z13、Z31、Z43能耐受环境中存在一定浓度
的铵 ,在 (NH4 ) 2 SO4浓度达 0. 50 g·L - 1 (相当于
NH4
+浓度为 7. 5 mmol·L - 1 )时 ,菌株生长势旺盛
且固氮酶活性仍能保持在 500 nmol·mL - 1 ·h - 1以
上 ,表明菌株有较高的耐铵能力。基于这 5株固氮
菌株对不同环境条件所表现出的广泛适应性及较高
固氮酶活性等特点 ,可作为农牧林业微生物菌肥开
发的潜在资源。
菌株 Zy7采用氨苄青霉素和卡那霉素进行双抗
标记接种水稻 , 2周后收获水稻。将水稻植株表面
消毒后 ,捣碎涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的平
板培养基上 ,获得了大量含氨苄青霉素和卡那霉素
双抗标记的菌落。随机挑一单菌落进行 16S rDNA
序列测定 ,所得序列与 Zy7原有序列一致 ,初步表明
菌株 Zy7寄居水稻组织内。进一步的荧光标记观察
菌株在水稻组织内的分布情况 ,正在进行中。
接种 Z2、Zy7、Z13、Z31、Z43菌株确实对水稻植
株的生长表现出一定的促进作用 ,说明这几株菌具
有较高的应用研究价值。被接种水稻表现的接种效
果 ,究竟是接种菌代谢产物的作用 ,还是接种后内生
固氮菌的作用 ,或者是二者共同作用的结果 ,内生固
氮菌研究者还没有定论 ,需要进一步研究 [ 11 - 13 ]。由
于本试验是在人工、无菌、水培的特殊环境中进行
的 ,在进入应用前还需研究诸如和土著菌之间的竞
争及外界其它环境条件因素的影响等问题。
参考文献 :
[ 1 ] Baldani J I, O livares F L, Hemerly A S. N itrogen2fixing endo2
phytes: recent advances in the association with gram inaceous p lants
grown in the trop ics [M ] / /Elemerich C, Kordorosi A, Newton W
E. B iological N itrogen Fixation for the 21 st Century. Netherlands:
Kluwer Academ ic Publishers, 1998: 203 - 206
[ 2 ] 吕泽勋 ,李久蒂 ,朱至清. 玉米内生固氮菌的回接分离及限菌条
件下在玉米根内的定殖 [ J ]. 应用与环境生物学报 , 2001, 7 (3) :
207 - 212
[ 3 ] DÊbereiner J. H istory and new perspectives of diazotrophs in associa2
tion with non2legum inous p lants[ J ]. Symbiosis, 1993, 23: 1 - 13
[ 4 ] Cojho E H, Reis V M, Schenberg A C G, et a l. Interactions of Ace2
tobacter d iazotrophius with an amylolytic yeast in nitrogen2free bath
culture[ J ]. FEMS M icrobiol lett, 1993, 106: 241 - 346
[ 5 ] 方 　萍 ,高丽梅 ,贾小明 ,等. 固氮螺菌 (Azosprillum brasilense)
NO40在红壤性水稻土上的接种效应 [ J ]. 浙江大学学报 :农业
与生命科学版 , 2001, 27 (1) : 33 - 36
[ 6 ] 侯　伟 ,彭桂香 ,许志钧 ,等. 广东省箣竹内生固氮菌多样性 [ J ].
农业生物技术学报 , 2007, 15 (2) : 290 - 294
[ 7 ] 彭桂香 ,王华荣 ,侯 　伟 ,等. 糖蜜草内生固氮菌 IS2PCR和 16S
rRNA基因全序列分析 [ J ]. 华南农业大学学报 , 2005, 26 ( 4 ) :
73 - 76
[ 8 ] 姚拓 , 张德罡 , 胡自治. 高寒地区燕麦根际联合固氮菌研究 I.
固氮菌分离及鉴定 [ J ]. 草业学报 , 2004, 13 (2) : 106 - 111
[ 9 ] Yoshida S, Forno D A, Cock J H, et a l. Laboratory Manual for
Physiological Studies of R ice. 3 rd Edition [ M ]. Manila, Philip2
p ines: IRR I, 1976: 61 - 64
[ 10 ] 张丽梅 ,方　萍 ,季天委. 高效固氮菌株 W12对环境因子的适
应性研究 [ J ]. 浙江大学学报 :农业与生命科学版 , 2002, 28
(6) : 664 - 668
[ 11 ] W atanabe I, L in C. Response of wetland rice to inoculation with
A zospirillum liperferum and Pseudom onas sp. [ J ]. Soil Sci Plant
Nutr, 1984, 30: 117
[ 12 ] 李久蒂 ,安千里. 联合固氮研究进展 [ J ]. 植物学通报 , 1997, 14
(3) : 14 - 21
[ 13 ] 顾小平 ,吴晓丽. 接种联合固氮菌对毛竹实生苗生长的影响
[ J ]. 林业科学研究 , 1999, 12 (1) : 7 - 12
501