全 文 ：林业科学研究 2013，26(2) :151 155
Forest Research
文章编号:1001-1498(2013)02-0151-05
基于 RAPD分子标记与表型标记的
柴松分类地位研究
解 庆1，刘志红1，李周岐1* ，原忠林2，王忠钰2
(1. 西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100;2. 辽宁省鞍山市千山风景区管委会林业局，辽宁 鞍山 114045)
收稿日期:2012-11-09
基金项目:国家自然科学基金“柴松分类地位及其遗传多样性研究”(30972382)
作者简介:解 庆(1983—) ，男，陕西咸阳人，在读博士，主要从事林木遗传育种研究．
* 通讯作者:李周岐(1962—) ，男，陕西凤翔人，教授，博士生导师，林木遗传育种专家． E-mail:Lzhouqi@ yahoo． com． cn．
摘要:采用 RAPD分子标记方法与表型标记的方法对柴松的分类地位进行了研究，结果表明:20 条随机引物共扩增
出 176 条条带，其中多态性带为 172 条，多态性百分率为 97． 73%。同时对 24 个形态性状进行了统计分析。对
RAPD试验结果和形态统计的结果分别采用 UPGMA法聚类分析，聚类的结果类似，认为柴松尚未达到油松变种或
近缘种一级的分类水平。
关键词:柴松;RAPD;表形标记;分类地位
中图分类法:S718． 46 文献标识码:A
Analysis of the Taxonomical Position of Pinus tabulaeformis． f． Shekannesis
Based on RAPD Markers and Morphological Traits
XIE Qing1，LIU Zhi-hong1，LI Zhou-qi1，YUAN Zhong-lin2，WANG Zhong-yu2
(1． College of Forestry，Northwest A＆F University，Shaanxi 712100，China;
2． Forestry Bureau of Qianshan Scenic Area，Liaoning 114045，China)
Abstract:In this study，the taxonomical position of Pinus tabulaeformis f． Shekannesis Yao et Hsu was estimated on
the basis of morphological characters and RAPD data． For RAPD analysis，20 random primers were selected and
176 bands，within 172 polymorphic bands and a polymorphism rate of 97. 73%，were obtained． Twenty four mor-
phological characters data were also recorded． The RAPD and morphological characters data were then respectively
analyzed with an unweighted pair-group method using an arithmetic average (UPGMA)． The results based on differ-
ent data are similar and it indicates that the Pinus tabulaeformis f． Shekannesis Yao et Hsü has not yet reached a vari-
ant or relatives of Pinus tabulaeformis．
Key words:Pinus tabulaeformis f． Shekannesis Yao et Hsü;RAPD;morphological traits;taxonomical position
柴松(Pinus tabulaeformis f． Shekannesis Yao et
Hsü)为松科(Pinaceae)、松属(Pinus)植物，其仅分
布于陕西富县桥北林业局和尚源林场大麦秸沟，总
面积约 337. 3 hm2。与油松相比，柴松具有生长
快、树皮光滑、树体高大、树干通直、天然整枝好、
材质较软、单株及林分高、径、蓄积生长量均较高
等特点，被誉为黄土高原上的珍贵遗传资源，国家
林业局“西北地区珍贵树种保护与林业非木质资
源高效栽培”项目已将其作为主要保护对象。柴
松作为陕北黄土高原天然林中的重要建群种，对当
地森林群落的稳定发展以及生态环境的改善都起
着举足轻重的作用，应积极加以保护并对其进行合
理有效的开发利用。
目前有关柴松的研究报道主要包括形态学和分
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
类学［1 － 2］、群落学［2 － 4］及生态学［5］等方面。乐天宇
先生首次将柴松命名为(Pinus tabulaeformis f． Shek-
annesis Yao et Hsü) ，认为它是油松的变型［1］;朱志
诚从生态学角度出发，对柴松的形成进行了分析，认
为其属于油松在黄土区的生态型［2］;但在《中国植
物志》［6］、《中国树木志》［7］、《黄土高原植物志》［8］及
《陕西树木志》［9］等权威性著作中均无有关柴松的
记载。关于柴松的分类地位问题在学术界尚有争
议。由于分类地位的不清，严重制约了对这一优良
遗传资源的系统研究和有效保护利用。
当前应用于植物分类地位研究的主要方法有
表型标记、同工酶标记和分子标记等，有鉴于各种标
记在分析植物分类地位时存在各自的优缺点，如表
型标记虽然简单易行、可操作性强，但费时、费工且
易受外界环境条件的影响;同工酶标记虽然可以弥
补表型标记应用上的某些局限性，但其结果受不同
组织特异和发育阶段的影响［10］;分子标记的结果不
受外界环境条件的影响，准确率较高，但应用成本
高，且不同的标记也存在各自的局限性。因此，采用
不同的标记综合研究的方法显得尤为重要。本研究
采用表型标记和 RAPD分子标记两种方法对柴松的
分类地位进行研究，旨在确定其分类地位，明确其与
油松在进化上的关系，从而为制定科学的物种遗传
资源保护策略及合理的利用措施提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
根据研究需要，选取柴松、油松、油松的 2 个变
种(黑皮油松和扫帚油松)与油松的 2 个近缘种(巴
山松和马尾松)各一个较大的自然居群进行采样
(表 1)。采样时，从每个居群中随机并兼顾均匀地
选取 50 株(扫帚油松仅有 2 株)生长正常的成年个
体，株间距 50 m以上。
表 1 采样情况
物种 采样地 样本量
柴松 P． tabulaeformis． f． Shekannesis Yao et Hsü 陕西富县 50
巴山松 P． henryi Mast． 陕西南郑 50
马尾松 P． massoniana Lamb． 陕西洋县 50
油松 P． tabulaeformis Carr． 陕西黄龙 50
扫帚油松 P． tabulaeformis Carr． var． umbraculif-
era Liou et Wang 辽宁鞍山
2
黑皮油松 P． tabulaeformis var． mukdensis Uyeki 辽宁鞍山 50
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA提取方法及 RAPD 反应程序 选取柴
松 30 个样株(从上述 50 个样株中随机选取)及油
松、黑皮油松、巴山松和马尾松各 30 个样株(从上述
50 个样株中随机选取) ，扫帚油松 2 个样株，于春季
采集幼嫩针叶各 60 80 针，采用快速，少量提取
DNA［11］的方法提取基因组 DNA，用于柴松分类地位
的 RAPD分析。
PCR反应在 PTC-200 型 PCR 仪(美国 MJ Re-
search公司)上进行。25 μL 反应体系包括:10 ×
Buffer(10 mmol·L －1 Tris-HCl，pH8. 3;50 mmol·
L －1 KCl)2. 5 μL ，25 mmol·L －1的 MgCl2 2. 5 μL ，
10 mmol·L －1 dNTP(TaKaRa 公司)0. 5 μL ，Taq 聚
合酶(MBI公司)2. 0 U ，模板 40 ng ，5 μmol·L －1
引物(上海生工生物工程有限公司)1. 0 μL ，用灭菌
双蒸水补足 25 μL。
扩增程序为:94 ℃预变性 3 min ;然后 94 ℃变
性 20 s;38℃ 退火 1 min ;72 ℃延伸 1 min ，共 40 个
循环;最后于 72 ℃延伸 7 min。
在解庆等［12］的研究基础上选取 50 条 RAPD 引
物对 6 个物种中各随机取出的 1 个 DNA 样品共 6
个 DNA样品进行筛选，选出扩增带型清晰、多态性
强、重复性好的引物用于全部基因组 DNA 样品扩
增。取扩增产物 10 μL在 1. 5%(质量分数)琼脂糖
凝胶上，1 × TBE 缓冲液中电泳，稳压电泳 1. 5 h 左
右，DNA Marker DL2000 做分子量标准，用凝胶成像
仪拍照检测。
1． 2． 2 表型性状的统计 采用上述 6 个物种的各
单株为统计样本。野外调查各样株的树高、胸径、树
干中央直径、树皮厚度、枝下高、侧枝直径、针叶长
度、针叶宽度、雄球花长度、雄球花直径及球果长度
和直径等指标，并采集上述球果室内阴干脱粒后测
定各样株的球果干质量、种子千粒质量、种鳞长和
宽、种翅长和宽，种子长和宽等指标。选取针叶长、
针叶宽、球果长和球果直径、球果干质量、千粒质量、
雄球花长与雄球花直径、种鳞长、种鳞宽、种翅长、种
翅宽、种子长、种子宽、树干中央直径 /胸径、枝下高 /
树高、树皮厚度 /胸径、侧枝直径 /胸径、球果长 /球果
直径、雄球花长 /雄球花直径、针叶长 /针叶宽、种鳞
长 /种鳞宽、种翅长 /种翅宽和种子长 /种子宽共 24
个指标(表 2) ，各指标 30 次重复。
1． 2． 3 数据统计与计算 RAPD 数据统计与计算
RAPD 扩增谱带按有(1)和无(0)记录，根据 Nei 相
似系数计算任意两物种间的相似系数 F = 2NXY /
(NX + NY) ，NXY为物种 X 和 Y经 RAPD扩增反应
251
第 2 期 解 庆等:基于 RAPD分子标记与表型标记的柴松分类地位研究
表 2 主要性状及统计方法
性状 统计方法 性状 统计方法
针叶长 直接测量 球果长 直接测量
针叶宽 直接测量 球果直径 直接测量
针叶长 /针叶宽 直接计算 球果长 /球果直径 直接计算
种翅长 直接测量 球果干质量 称量
种翅宽 直接测量 种鳞长 直接测量
种翅长 /种翅宽 直接计算 种鳞宽 直接测量
种子长 直接测量 种鳞长 /种鳞宽 直接计算
种子宽 直接测量 雄球花长 直接测量
种子长 /种子宽 直接计算 雄球花直径 直接测量
千粒质量 称量 雄球花长 /雄球花 直接计算
直径
枝下高 /树高 测量后计算 侧枝直径 /胸径 测量后计算
树干中央直径 /胸径 测量后计算 树皮厚度 /胸径 测量后计算
分子量相同的谱带总和，NX、NY 分别代表物种 X、Y
经 RAPD扩增反应的谱带总数，遗传距离 GD = 1 －
F，再根据遗传距离利用 UPGMA 法构建遗传聚类
图，计算运用 Popgen32 软件进行［13 － 14］。
形态数据统计与计算 运用 SPSS 17. 0 软件，采
用欧氏距离系数(Square euclidean distance)和离差
平方和法(Wards method)作 Q 聚类，分析各物种间
的表型性状相似程度，从而考量各物种间的亲缘关
系远近。
2 结果与分析
2． 1 PCR 扩增结果与 UPMGA 聚类结果
从 50条引物中筛选出多态性好、稳定性高的 20
条引物作为柴松分类地位分析的 RAPD引物(表 3)。
利用这 20 条 RAPD 引物对所有样品基因组 DNA 进
行扩增，共扩增出 176 条带，其中多态性带为 172 条，
多态性百分率为 97． 73%。引物与基因组 DNA 随机
结合，最多扩增出 13 条带，最少有 6 条带，图 1 为引
物 S11和 S19对部分样品 DNA的扩增图片。
根据扩增结果计算出了柴松及其近缘种或变种
共计 6 个物种间的遗传相似系数(见表 4) ，并构建
树状聚类图(图 2)。遗传相似系数的变幅从 0. 024
到 0. 211，平均 0. 104;2 个变种黑皮油松与扫帚油松
与油松的遗传相似系数分别为 0. 036 和 0. 077，平均
为 0. 057;2 个近缘种巴山松与马尾松与油松的遗传
相似系数分别为 0. 069 和 0. 178，平均为 0. 124;柴
松与油松的遗传相似系数为 0. 024，说明柴松与油
松的亲缘关系较 2 个变种和 2 个近缘种与油松的亲
缘关系近，未达到油松的变种或近缘种的范畴。
表 3 RAPD引物序列
引物
引物碱基序列
(5’-3’)
位点总数
多态性位
点数
多态性位点
比例 /%
S11 GTAGACCCGT 11 11 100
S19 ACCCCCGAAG 8 8 100
S29 GGGTAACGCC 6 6 100
S36 AGCCAGCGAA 11 10 90． 91
S37 GACCGCTTGT 9 8 88． 89
S52 CACCGTATCC 9 9 100
S66 GAACGGACTC 13 13 100
S67 GTCCCGACGA 10 10 100
S73 AAGCCTCGTC 8 8 100
S88 TCACGTCCAC 6 6 100
S91 TGCCCGTCGT 6 6 100
S101 GGTCGGAGAA 7 7 100
S237 ACCGGCTTGT 10 9 90
S249 CCACATCGGT 6 6 100
S297 GACGTGGTGA 11 11 100
S332 TCAACGGGAC 9 8 88． 89
S341 CCCGGCATAA 10 10 100
S356 CTGCTTAGGG 9 9 100
S418 CACCATCCGT 8 8 100
S471 AACGCGTCGG 9 9 100
图 1 RAPD S11 引物扩增产生的条带
图 2 RAPD S19 引物扩增产生的条带
表 4 Nei’s遗传距离系数
物种 柴松 油松 马尾松 巴山松 黑皮油松 扫帚油松
柴松 ＊＊＊＊ 0． 976 0． 837 0． 933 0． 965 0． 926
油松 0． 024 ＊＊＊＊ 0． 831 0． 922 0． 953 0． 913
马尾松 0． 178 0． 186 ＊＊＊＊ 0． 864 0． 826 0． 810
巴山松 0． 069 0． 081 0． 146 ＊＊＊＊ 0． 942 0． 902
黑皮油松 0． 036 0． 049 0． 192 0． 059 ＊＊＊＊ 0． 948
扫帚油松 0． 077 0． 091 0． 211 0． 103 0． 054 ＊＊＊＊
从聚类图可以看出，柴松首先与油松聚成一类，
其他 4 个物种依次与之相聚，顺序为黑皮油松、巴山
351
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
松、扫帚油松和马尾松。此结果基本与传统经典形
态分类观点相一致，即油松的 2 个变种黑皮油松和
扫帚油松首先与之相聚，2 个近缘种巴山松与马尾
松再与之相聚。6 个物种间的遗传相似系数同聚类
结果表明，柴松未达到油松的变种或近缘种的范畴，
其只是油松在黄土高原区的一个生态型，与朱志诚
的研究结果相一致。
图 3 柴松及其近缘种或变种的聚类分析
2． 2 形态数据分析结果
表型数据计算出的各物种间的相似性矩阵见表
5，从表 5 可以看出 6 个物种间欧氏距离的平方的变
幅从 19． 761 到 92． 705，平均 44． 807。2 个变种黑皮
油松与扫帚油松与油松之间的欧氏距离的平方分别
为 24． 749 和 66． 332，平均为 45． 541。
2 个近缘种巴山松与马尾松与油松之间的欧氏
距离的平方分别为 53. 331 和 92. 705，平均为
73. 018;柴松与油松之间的欧氏距离的平方为
25. 651，表明柴松与油松之间的欧氏距离近于 2 个
变种和近缘种与油松之间的欧氏距离，说明柴松未
达到油松的变种或近缘种的层面。
表 5 相似性矩阵
物种
欧氏距离系数
柴松 黑皮油松 扫帚油松 巴山松 马尾松 油松
柴松 0. 000 20. 740 34. 960 19. 761 53. 719 25. 651
黑皮油松 20. 740 0. 000 36. 308 50. 368 73. 415 24. 749
扫帚油松 34. 960 36. 308 0. 000 38. 556 78. 539 66. 332
巴山松 19. 761 50. 368 38. 556 0. 000 50. 868 53. 331
马尾松 53. 719 73. 415 78. 539 50. 868 0. 000 92. 705
油松 25. 651 24. 749 66. 332 53. 331 92. 705 0. 000
形态数据聚类结果如图 3，从聚类图(图 3)可以
看出，柴松先与巴山松聚成一类再与扫帚油松相聚，
油松先与黑皮油松聚成一类再与柴松、巴山松和扫
帚油松所聚的一大类相聚，最后与马尾松相聚。此
结果与传统经典形态分类观点相差较大，这可能是
因为应用欧氏距离聚类分析时未考虑各指标间的相
关性所造成的偏差。
图 4 柴松及其近缘种或变种的聚类分析
3 结论与讨论
随着分子标记技术的发展，RAPD 技术与其他
分子标记技术相比，逐渐显示出了一些缺点，主要是
为显性标记、重复性较差、扩增条带有限、可靠性较
差，但因为其原理简单、操作容易、成本较低，且是直
接揭示 DNA水平上的差异，具有一定的可靠性，仍
然在植物的种质资源研究方面得到了广泛的应
用［15 － 16］。在实践中，为提高分析结果的可靠性，可
将形态数据的分析与 RAPD 数据相对照，起到相互
验证的作用［17 － 18］。该试验即采用这种对照方法，结
果表明二者的相似性较高，说明 RAPD 用于柴松分
类地位的研究，具有一定的可靠性。
本研究采用 RAPD分析同表型标记分析相结合
的方法对柴松的分类地位进行了探讨，两者所得结
果相一致，都支持朱志诚［2］的观点，即柴松尚未达到
油松变种或近缘种一级的分类水平，仅是油松在黄
土高原区的生态型(Ecotype)。生态型是同种植物
对不同环境条件趋异性适应的结果，生态型的分化
是新物种形成的开始。
陕北黄土高原南部及其邻近地区(柴松分布
区) ，是油松分布的几何中心，与油松其它的分布区
相比较，这里具有深厚的黄土层，充足的降水(年降
水量在 600 700 mm) ，且属暖温带气候，特别是从
基质条件来看，黄土要比各类岩质土对油松的生长
发育优越。因而可能由于这些缘故，导致油松在黄
土高原发生了相应的变异，这种分析与柴松所表现
的大部分特征相一致，例如其针叶翠绿、树皮光滑
等，都是相对水热较好的标志;村干通直、枝形平展，
这些也都是在相对较好水热条件下，长期处于密度
较大的林分中，所形成的一些特点。
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