全 文 ：收稿日期 : 2004204213
基金项目 : 湖北省林业局重点项目 (2002LK015)
作者简介 : 宋丛文 (1965 —) ,男 ,湖北麻城人 ,高级工程师.
林业科学研究　2004 ,17 (5) :605～609
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2004) 0520605205
利用 RAPD 标记对珙桐地理种群
遗传分化的研究
宋丛文1 ,2 , 包满珠1
(11 华中农业大学 ,湖北 武汉　430070 ; 21 湖北省林业科学研究院 ,湖北 武汉 ,430079)
摘要 :利用 RAPD 标记对珙桐全分布区 5 个种群的遗传多样性进行了分析。研究发现 ,珙桐具有丰富
的遗传多样性 ,但由于小种群效应 ,以及缺乏有效的基因流 ,种群间遗传分化巨大 ,26 %的遗传变异存
在于种群间。使用 Nei’s 遗传距离进行 UPGMA 聚类分析 ,可以很好地将珙桐划分为东南部和西北部
两个种源区 ,为今后珙桐的种质资源保存和开发利用研究提供理论依据。
关键词 :珙桐 ;RAPD ;地理种群 ;遗传分化
中图分类号 :Q75 　　　文献标识码 :A
珙桐 ( Davidia involucrata Baill . )系我国特有的珙桐科 (Davidioideae) 单型属植物 ,其起源古
老 ,是第三纪古热带植物区系的孑遗种 ,1896 年由法国人岱维斯首次发现 ,被列为国家一级保
护珍稀濒危植物[1 ] ,也是世界著名的孑遗活化石观赏木本花卉植物。仅分布在甘肃东南部的
文县、陕西西南部的安康地区、湖北的神农架及恩施各县市、湖南的武陵山区、贵州的梵静山、
四川的西南部及云南北部共 7 省 40 多个县市 ,分布范围为 23°25′～33°38′N ,99°05′～111°18′
E ,呈星散状分布 ,现有的原生群落面积十分有限[2 ] 。
研究种群间的遗传分化是探讨植物适应性、物种形成过程及进化机制的基础 ,也是保护生
物学和遗传资源学的核心[3 ] 。焦健等[4 ]对珙桐种群的分布格局、变化趋势、种间联结性等进行
过研究 ,但对我国特有种珙桐的遗传多样性方面的研究报道很少。本文利用 RAPD 标记研究
珙桐全分布区地理种群间的遗传分化与变异模式 ,为有效保护和开发利用珙桐种质资源提供
理论指导。
1 　材料与方法
111 　试验材料
根据珙桐的分布特点 ,在甘肃文县、湖北神农架、湖北宣恩、四川峨眉山、贵州梵静山等 5
个地方 ,选择具有连续分布特征的天然林分作为研究对象群体 ,在全林分随机抽取 30～50 株
珙桐树 (每两珙桐株间距不少于 50 m) ,分别单株采集 10～15 片叶 ,置于加入了足量干燥剂的
塑料袋中密封 ,带回实验室后置于 - 20 ℃的冰箱中保存供试。
112 　实验方法
11211 　DNA 提取 　5 个群体共 186 份样品 (湖北宣恩 40 份、四川峨眉山 41 份、贵州梵静山 37
份、湖北神农架 30 份、甘肃文县 38 份) ,采用 2 ×CTAB 法提取 DNA[5 ] 。测定 DNA 的浓度和纯
度 ,通过琼脂糖电泳检查 DNA 的完整性 , - 20 ℃保存备用。
11212 　引物筛选 　随机引物采用 Operon 公司引物系列 A、B、C、D 共 80 个引物 ,经预备试验选
择能产生多态性、清晰明亮的谱带且重复性强的 13 个引物 ,对所有个体 DNA 进行扩增。
11213 　RAPD 扩增及产物分离 　RAPD 扩增反应条件 :94 ℃预变性 3 min ;然后进入 40 个循环 ,
每个循环 94 ℃变性 1 min ,45 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 2 min ;循环完成后于 72 ℃延伸 7 min ,最
后于 4 ℃保存。反应采用 20μL 体系 : H2O 1116μL ,1 ×Buffer 2μL ,2 mmol·L - 1 MgCl2 018μL ,
012 mmol·L - 1 MdNTP 014μL ,014μmol·L - 1 Primer 2μL ,1 uTaq 012μL ,30μg·μL - 1 DNA 3μL。扩
增产物在 10 g·kg - 1含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离 ,最后在紫外灯下用拍照记录结果
(图 1) 。
图 1 　引物 OPB05 的 RAPD 扩增产物在部分珙桐地理种群样品中的分离
113 　数据处理
RAPD 谱带按 1/ 0 标记 ,利用 POPGENE软件[6 ]进行数据分析。首先计算衡量种群遗传变
异的多态百分率、Nei’s 基因多样度[7 ] ,以度量珙桐各地理种群的遗传变异。采用 F2统计量分
析种群的基因多样性 ,估算基因分化系数 ,以研究确定珙桐种群间的遗传分化。基于地理种群
间 Nei’s 无偏遗传距离的估算 ,用非加权成组配对法 (UPGMA) 对 5 个地理种群进行聚类分析 ,
构建聚类树状图。
2 　结果分析
211 　引物及其检测结果
用 13 个随机引物对 5 个天然珙桐种群共 186 个个体的基因组DNA 进行了 RAPD 分析 ,每
个引物检测到的位点数在 1～12 之间 ,共检测到 101 个可重复的位点。平均每个引物检测到
的位点为 7177。
各引物名称、序列及检测带数见表 1。
606 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
表 1 　13 个随机引物序列及扩增的总带数
引物 引物序列 (5′23′) 总带数 引物 引物序列 (5′23′) 总带数
OPA03 AGTCAGCCAC 12 OPB05 TGCTCCCTTC 12
OPA05 AGGGGTCTTG 2 OPB06 TGCTCTGCCC 11
OPA11 CAATCGCCGT 7 OPB11 GTAGACCCGT 7
OPA13 CAGCACCCAC 7 OPB17 AGGGAACGAG 8
OPB01 GTTTCGCTCC 4 OPB18 CCACAGCAGT 12
OPB03 CATCCCCCTG 7 OPD01 ACCGCGAAGG 1
OPB04 GGACTGGAGT 11 (总计) 101
212 　多态位点比率及 Nei’s 基因多样度
多态百分率和 Nei’s 基因多样度是检验种群内遗传多样性的常用指标。从表 2 可见 ,珙
桐各种群的多态百分率很高 ,平均达到 75184 % ,不同种群间多态百分率差异较大 ,最高的是
四川峨眉山种群 ,高达 85115 % ,其次是贵州梵静山种群、湖北神农架种群 ,再次为甘肃文县种
群 ,最低为湖北宣恩种群 ,只有 64136 %。从 Nei’s 基因多样度来看 ,珙桐种群具有较为丰富的
遗传多样性 ,其种群平均值为 01247 6 ,高于一般针阔叶树种 01206 的估算值[8 ] 。种群间基因
多样度相差巨大 ,多数种群的遗传多样性丰富 ,以贵州梵静山种群、湖北神农架种群和四川峨
眉山种群遗传变异水平最高 ,分别达到 01279 5、01277 4 和 01260 0 ,湖北宣恩种群内的遗传变
异水平较低 ,只有 01198 9。
表 2 　5 个珙桐地理种群的多态百分率和 Nei’s 基因多样度
　地理种群 多态百分率/ % Nei’s 基因多样度
11 湖北宣恩 64136 01198 9
21 四川峨眉山 85115 01260 0
31 贵州梵静山 80120 01279 5
41 湖北神农架 79121 01277 4
51 甘肃文县 70130 01222 3
平均 75184 01247 6
213 　遗传分化系数
基因分化系数估算结果 (见表 3)显示 ,珙桐群体间的遗传分化达到 26 %。珙桐有 26 %左
右的遗传变异存在于种群间 ,而 74 %左右的遗传多样性存在于种群内 ,基因流 Nm 只有
11423 9 ,这一估算值近似于我国濒危植物马褂木 (Liriodendron chinense ( Hemsl1) Sarg1) 的研究
结果[9 ] 。珙桐是古老的孑遗植物 ,虽然在我国 7 省 40 多个县 (市)有分布 ,但呈星散间断分布 ,
多数种群个体数少。这是生境片断化 ,小种群效应和距离隔离效应的结果 ,使得珙桐种群内的
变异程度降低 ,而种群间的遗传分化程度加大。
表 3 　珙桐地理种群的遗传分化系数
树种
总的种群基因多样性
( HT)
种群内基因多样性
( Hs)
种群间基因多样性
( Dst)
基因分化系数
( Gst)
基因流
( Nm)
珙桐　　 01334 5 01247 6 01086 9 01259 9 11423 9
马褂木① 01391 1 01256 8 01134 3 01343 4
　　①引自文献[9 ]
706第 5 期 宋丛文等 :利用 RAPD 标记对珙桐地理种群遗传分化的研究
214 　Nei’s 遗传距离及 UPGMA聚类分析
表 4 给出了珙桐 5 个种群间的遗传同一性和 Nei’s 遗传距离 ,并据此使用 UPGMA 聚类法
得出了聚类树形图 (图 2) 。图 2 表明 ,可以按地理区域将珙桐划分为两个种源区 ,第一个种源
区是东南种源区 ,第二个种源区是西北种源区。从珙桐种群间的遗传距离来看 ,最大遗传距离
存在于湖北宣恩与甘肃文县之间 ,最小遗传距离在湖北神农架与贵州梵静山之间。
表 4 　珙桐 5 个地理种群 Nei’s 遗传同一性(对角线以上)与遗传距离
　地理种群　 湖北宣恩 四川峨眉山 贵州梵静山 湖北神龙架 甘肃文县
湖北宣恩　 01863 7 01878 1 01887 8 01814 1
四川峨眉山 01146 6 01858 0 01845 8 01857 7
贵州梵净山 01129 9 01153 1 01932 1 01828 5
湖北神农架 01119 0 01167 5 01070 3 01838 2
甘肃文县　 01205 7 01153 5 01188 1 01176 4
图 2 　5 个地理种群 UPGMA 聚类法得出的树状图
3 　小结
珙桐现残遗和间断分布于我国甘肃、陕西、湖北、湖南、四川、云南、贵州等地 ,面积约 4 500
hm2 ,呈星散状分布。利用 RAPD 标记对珙桐全分布区 5 个种群进行遗传多样性分析结果表
明 ,珙桐虽因小种群效应和距离隔离效应经历了严重的遗传漂变 ,种群内仍具有丰富的遗传变
异。但是 ,由于珙桐种群受小种群效应 ,以及缺乏有效的基因流 ( Nm = 11423 9) 和致濒机制的
影响 ,造成珙桐种群间的遗传分化巨大 ,26 %的遗传变异存在于种群间 ,与我国濒危树种马褂
木[9 ] 、银杉 ( Cathaya argyrophylla Chun et Kuang) [10 ]等相似 ,而与广布性树种相异。利用 RAPD
标记在 DNA 水平上可以很好地将珙桐划分为东南和西北两个种源区 ,为今后开展珙桐的种质
资源保存和开发利用提供了理论依据。
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Study on Genetic Differentiation for Geographic Population of
Davidia involucrate by RAPD Marker
SONG Cong2wen1 ,2 , BAO Man2zhu1
(11Huazhong Agricultural University ,Wuhan 　430070 ,Hubei ,China ;
21Hubei Academy of Forestry ,Wuhan 　430079 ,Hubei ,China)
Abstract :Davidia involucrate genetic diversity of 5 populations in distribution regions was analyzed by RAPD
marker. It was found that D. involucrate possessed rich genetic diversity ,however ,the genetic differentiation was
enormous among the populations ,26 % genetic variation existed among the populations due to small population
effect and shortage of effective gene flow. By the use of UPGMA cluster analysis with Nei’s genetic distance ,D.
involucrate could be soundly divided into two provenance plots of southeast and northwest ,which would provide
theory references for conservation and study on the development and application of germ plasm resource from D.
involucrate.
Key words :Davidia involucrate ;RAPD ;geographic population ;genetic differentiation
906第 5 期 宋丛文等 :利用 RAPD 标记对珙桐地理种群遗传分化的研究