全 文 ：林业科学研究　2006, 19 (4) : 477～483
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0420477207
欧洲黑杨育种基因资源 SSR多态性比较研究 3
张香华 , 苏晓华 3 3 , 黄秦军 , 张冰玉
(中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘要 :本研究利用 13对 SSR引物对 120份 (105份国外引进、15份我国新疆 )欧洲黑杨基因资源进行了遗传多态性
分析 ,共检测出 171个等位基因 ,每个多态性位点检测到 7～19个等位基因 ,平均为 1312,多态信息指数为 0. 396～
0. 909,平均为 01808;遗传距离为 0～01456 4。欧洲黑杨基因种源具有丰富的遗传多样性。通过 UPGMA等类分析 ,
将 120份材料划分为 8类 ,地理分布较近的材料基本聚在一起 ,表明遗传距离与地理距离相关性强。
关键词 :欧洲黑杨 ;基因资源 ; SSR;遗传多样性
中图分类号 : S72213　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2005201206　修回日期 : 20062012103 基金项目 : 农业科技成果转化资金项目 :“西丰杨系列无性系生产性试验”(05EFN216700382) ;“948”项目 :“北方型美洲黑杨纸浆材
基因资源及分子育种技术引进”(200524251)
作者简介 : 张香华 (1966—) ,女 ,高级实验师 ,主要研究方向 :杨树分子生物技术3 中国林科院林业所马常耕先生、卢孟柱研究员对该文提出宝贵意见 ,王敏杰博士在作图方面给予很大帮助 ,在此一并致谢 !3 3 通讯作者 : Suxh@ caf. ac. cn
Com por ison of Genetic Var ia tion s of Black Poplar( Popu lus n igra L. )
Gene Resource by M icrosa tellite M arkers
ZHANG X iang2hua, SU X iao2hua, HUANG Q in2jun, ZHANG B ing2yu
(Research Institute of Forestry, CAF, Key Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, State Forestry Adm inistration, Beijing　100091, China)
Abstract: The simp le sequence repeat ( SSR) or m icrosatellite marker is currently p referred in genetic analysis due to its
highly desirable p roperties. 13 pairs of SSR p rimers were used to detect genetic diversity among 120 Populus nigra L. gene
resource. A total of 171 allels were observed among the polymorphic loci, 7～19 SSR alleles were detected for each locus
with an average of 13. 2 alleles per locus. 13 pairs of SSR p rimers were polymorphic with the polymorphism information
content ( P IC) ranging from 0. 396 to 0. 909. The 120 clones were clustered based on the banding patterns generated by 13
polymorphic SSR loci. In general, this study indicates that SSR s are sufficiently abundant and polymorphic to be useful ge2
netic markers in genetic diversity study of Populus nigra L. gene resources. This study p rovided theoretic basis for efficient
utilization of these gene resources.
Key words: Populus n ig ra; gene resource; SSR; genetic diversity
研究林木基因资源遗传多样性是基因资源保存
的前提 ,对培育林木新品种具有重要的指导意义。
遗传多样性是伴随基因传递过程产生的同一物种个
体间的变异 ,包括极其微小的、不易见到的变异 [ 1 ]。
一个种群遗传多样性越高、越丰富 ,适应环境的能力
就越强 ,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。
保护基因资源可以满足不同育种目标和未来的良种
需要 ,包括应对特殊环境和病虫害都有赖于丰富的
遗传多样性 [ 2 ]。近年来 ,树木遗传多样性研究方面
已越来越多的应用 DNA标记 ,限制性片断长度多态
性 (RFLP)技术是最早应用的 DNA分子标记 ,现已
衍生出多种形式的分子标记技术 [ 3～8 ] ,如 RAPD、
AFLP、SSR、SNP等分子标记。微卫星 ( SSR)标记由
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
于其具有较高多态性 ,目前在遗传多样性研究中得
到广泛应用。微卫星 ( SSR ) [ 9 ]是指 1～6个核苷酸
为基序 (多数为 2～4个 ) ,按串联形式重复而形成的
DNA序列 ,一般称之为简单重复序列。微卫星 DNA
的生物学功能尚不清楚 ,它主要集中在非编码区 ,可
能对基因起调节作用 ,或许是基因重组的热点。作
为遗传标记微卫星有如下优点 : ( 1 )微卫星标记数
量多且在基因组中均匀分布 ; ( 2)微卫星标记揭示
的多态性水平高 ,具有染色体组特异性 ,适宜于遗传
多样性分析 ; ( 3 )微卫星标记检测易操作、重复性
好、省时、适合自动化分析。鉴于 SSR分子标记比其
它分子标记具有更多的优越性 ,在遗传多样性研究
中已得到广泛应用 , 在小麦 ( Triticum sestivum
L inn. ) [ 10 ]、玉米 ( Zea m ays L inn. ) [ 11 ]、大豆 (Glycine
m ax Merr. ) [ 12 ]等许多作物上应用 SSR标记进行遗
传多样性的研究。 Powell等 [ 13 ] 用叶绿体微卫星
( cpSSR)对欧洲白皮松 ( P inus leucoderm is Ant. ) 7个
群体的分析表明群体内多态性的变化大 ,群体的亚
分化明显。在林木上 ,国内利用 SSR进行遗传多样
性研究的报道还较少。
欧洲黑杨 ( Populus n igra L inn. )属于杨属黑杨
派 (A igeiros Section)树种。黑杨派具有早期速生、材
质好等特点 ,约 10年左右就可以给工业用材提供大
径材 ,这是其它杨树难以比拟的。在杨树育种中 ,要
想提高育种选择效率 ,加速育种进程 ,获得丰富的遗
传变异类型杨树新品种 ,就须选择遗传差异大的亲
本材料 ,这又依赖于大量的基因资源。因此作者收
集了欧洲 15个国家和我国新疆的欧洲黑杨 ,建立了
欧洲黑杨资源基因库。本研究利用 SSR标记对来自
16个国家的 120份欧洲黑杨遗传材料进行了多态
性比较分析 ,以揭示其遗传多样性水平 ,并为其鉴定
提供依据。了解该基因库中材料多态性及无性系间
的遗传距离 ,为评价其代表性 ,服务于良种选育提供
科学依据。
1　材料和方法
1. 1 材料
中国林科院林业所 2000年从欧洲 15个国家引
进及国内收集欧洲黑杨基因资源 ,并在陕西、内蒙
古、黑龙江、大连、北京 5个不同生态区建立了欧洲
黑杨基因库。本研究所用实验材料是从北京基因库
中选取的 120份欧洲黑杨 (表 1)。
1. 2 D NA提取
从欧洲黑杨植株上采集新鲜叶片约 012 g,研磨粉
碎 ,用 CTAB法提取其总 DNA, 参照 Doyle等 [14 ]方法。
1. 3 SSR扩增及扩增产物的检测
实验共选用 13对 SSR引物 ,其中 9对是从欧洲
黑杨 [ 15 ]中开发的引物 , PCR反应条件略有改变。另
外从适用于其它杨树的 100对 SSR引物中筛选出 4
对多态性较高的引物 (表 2)。
PCR反应体积为 25 μL。反应体系为 : 0115
mmol Mg2 + , 012 mmol dNTP, 50 ng基因组 DNA ,
012μmol Primer, 1U Taq DNA 聚合酶 (赛百盛公
司 )。在 PE—9600型 PCR仪上进行 PCR扩增 ,扩
增条件为 : 94 ℃预变性 5 m in;再 94 ℃变性 45 s、55
～61 ℃复性 45 s (表 2)、72 ℃延伸 1 m in,共 35个
循环 ;然后 72 ℃充分延伸 10 m in。将 PCR反应产
物在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分离 ,凝
胶测序仪为 B IO2RAD ( Sequi2Gen GC 38 cm ×50
cm) ,硝酸银染色并照相。
1. 4　数据分析
每个样品电泳后的 SSR位点用 1和 0赋值等位
基因的有无 ,按 Nei等 [ 16 ]的方法计算样品间相似系
数 (GS ij )和遗传距离 (GD ij )。
GS ij = 2N ij / (N i +N j ) , GD ij = 1 - S ij ,其中 N i为 i
样品出现的谱带数 , N j为 j样品出现的谱带数 , N ij为
i样品和 j样品共有的谱带数。应用非加权平均数
法 (UPGMA)进行聚类分析 ,通过 NTSYS程序运算。
根据 Sm ith[ 17 ]等的方法计算标记位点的多态信
息量 P IC (polymorphism index content)值 ,公式 :
P IC = 1 - ∑
n
fi 2
fi表示第 i个等位基因的频率。P IC值反映某一
群体中遗传多样性丰富程度 , PIC值与等位基因的
数目有关 ,并与等位基因的频率有关。若某一位点
上某一等位基因频率很高 ,它反应的多态性较各个
等位基因频率相等时的差。
2　结果与分析
2. 1 SSR标记的多态性
从筛选出的 13对 SSR引物中 ,共检测到 171个
等位基因 ,每个 SSR位点检测到 7～19个等位基因 ,
平均为 1312 个 ,其中检测等位基因最多的引物
W PMS08 检出 19 个 , 最少的引物是 PMGC93、
PMGC108,也检测出 7个等位基因 ,多态信息量 P IC
值从 01396到 01909,平均为 01808 (表 3,图 1)。从
以上结果可看出 :所收集引进的欧洲黑杨基因资源
中具有较高的遗传多态性。
874
第 4期 张香华等 :欧洲黑杨育种基因资源 SSR多态性比较研究
表 1　欧洲黑杨基因资源地理分布
序号 编号 国家 纬度 N (°′) 经度 E (°′) 序号 编号 国家 纬度 N (°′) 经度 E (°′)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
87
88
89
92
86
91
93
95
90
94
43
63
64
65
39
40
3
2
6
25
119
120
29
10
18
19
28
116
128
148
13
20
4
14
31
15
30
8
11
7
1
37
16
26
23
12
24
22
9
187
5
17
21
125
32
78
38
36
35
42
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
土耳其
意大利
俄罗斯
俄罗斯
俄罗斯
意大利
意大利
保加利亚
比利时
英国
德国
德国
德国
意大利
意大利
捷克
捷克
俄罗斯
德国
德国
荷兰
斯洛伐克
罗马尼亚
德国
斯洛伐克
意大利
南斯拉夫
意大利
克罗地亚
荷兰
克罗地亚
比利时
意大利
南斯拉夫
德国
德国
荷兰
德国
西班牙
匈牙利
比利时
德国
捷克
西班牙
德国
意大利
俄国
意大利
意大利
意大利
意大利
38 02
38 02
37 40
37 05
37 44
37 05
37 37
37 05
37 02
36 58
45 14
52 00
52 00
52 00
45 33
45 43
42 45
50 40
51 30
52 30
52 30
46 11
41 45
50 00
50 00
55 00
52 30
52 30
52 30
52 20
49 00
44 30
52 30
49 00
45 47
40 00
46 10
45 45
52 20
45 45
50 40
44 41
40 00
52 30
52 30
52 20
52 30
40 30
47 30
50 40
52 30
50 00
40 30
52 30
45 45
55 00
41 45
44 46
45 33
45 05
36 30
38 15
38 42
37 22
37 35
37 22
36 51
37 22
37 30
37 28
11 39
38 00
38 00
38 00
10 13
10 13
23 20
04 20
00 00
13 20
13 20
13 20
12 46
12 30
14 30
14 30
39 50
13 20
13 20
04 45
20 00
26 10
13 20
20 00
09 49
20 30
12 14
16 00
04 45
16 00
04 20
10 06
20 30
13 20
13 20
04 45
13 20
03 40
19 00
04 20
13 20
14 30
03 40
13 20
11 52
85 00
13 16
08 21
11 09
11 36
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
44
33
34
114
126
117
127
149
111
113
110
145
150
162
164
169
147
123
124
122
115
146
166
167
168
102
104
98
100
103
180
181
186
190
185
96
E1
E5
E3
W8
W9
W5
W6
W7
W2
W1
E2
E4
W3
W10
W4
79
184
188
189
182
183
41
27
85
意大利
意大利
意大利
德国
德国
德国
德国
荷兰
匈牙利
匈牙利
匈牙利
荷兰
荷兰
荷兰
荷兰
荷兰
荷兰
德国
德国
德国
德国
荷兰
荷兰
荷兰
荷兰
匈牙利
匈牙利
匈牙利
匈牙利
匈牙利
比利时
比利时
比利时
比利时
比利时
匈牙利
新疆额河
新疆额河
新疆额河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
新疆额河
新疆额河
新疆乌河
新疆乌河
新疆乌河
俄罗斯
比利时
比利时
比利时
比利时
比利时
意大利
德国
俄罗斯
45 24
45 45
45 40
52 30
52 30
52 30
52 30
52 20
47 30
47 30
47 30
52 20
52 20
52 20
52 20
52 20
52 20
52 30
52 30
52 30
52 30
52 20
52 20
52 20
52 20
47 30
47 30
47 30
47 30
47 30
50 40
50 40
50 40
50 40
50 40
47 30
48 00
48 00
48 00
47 00
47 00
47 00
47 00
47 00
47 00
47 00
48 00
48 00
47 00
47 00
47 00
55 00
50 40
50 40
50 40
50 40
50 40
41 45
52 30
55 00
11 53
11 25
08 09
13 20
13 20
13 20
13 20
04 45
19 00
19 00
19 00
04 45
04 45
04 45
04 45
04 45
04 45
13 20
13 20
13 20
13 20
04 45
04 45
04 45
04 45
19 00
19 00
19 00
19 00
19 00
04 20
04 20
04 20
04 20
04 20
19 00
87 48
87 48
87 48
88 00
88 00
88 00
88 00
88 00
88 00
88 00
87 48
87 48
88 00
88 00
88 00
85 00
04 20
04 20
04 20
04 20
04 20
12 30
13 20
85 00
974
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
表 2　SSR引物序列及退火温度
引物 重复序列 序　　列
产物长
度 / bp
退火温
度 /℃
PMGC93
PMGC108
PMGC649
PMGC2501
W PMS01
W PMS03
W PMS04
W PMS05
W PMS07
W PMS08
W PMS09
W PMS010
W PMS011
　
CTT
CTT
GA
GA
( GA) 20
( GT) 26
( GT) 25
( GT) 27
( GT) 24
( GT) 25
( GT) 21 ( GA) 24
( GT) 23
( GT) 26
　
5′2ATCATGCGTTCGGCTACAGC23′
5′2CTCAAACTCCAACTGTTATAAC23′
5′2TGCAGGTGATGTCATCACCG23′
5′2AACCGAATCCATGCGTCACC
5′2CATCCATGATATCAAACCAAATTAG
5′2TGTAATCCAAACATAAAATCCCAAG
5′2CACAGGACGTTTTGGAGCAG
5′2AATTCGGACAGTCAGTCACC
5′2AACCACTATGCCACCTTCTT23′
5′2AACTAACTCCATTCATTGCTAAA23′
5′2TTTACATAGCATTTAGCCTTTAGA23′
5′2TTATGATTTGGGGGTGTTATGGTA23′
5′2TACACGGGTCTTTTATTCTCT23′
5′2TGCCGACATCCTGCGTTCC23′
5′2TTCTTTTTCAACTGCCTAACTT23′
5′2TGATCCAATAACAGACAGAACA23′
5′2ACTAAGGAGAATTGTTTGACTAC23′
5′2TATCTGGTTTCCTCTTATGTG23′
5′2TAACATGTCCCAGCGTATTG23′
5′2TTTTTAGAGTGTGCATTTAGGAA23′
5′2CTGCTTGCTACCGTGGAACA23′
5′2AAGCAATTTGGGTCTGAGTATCTG23′
5′2GATGAGAAACAGTGAATAGTAAGA23′
5′2GATTCCCAACAAGCCAAGATAAAA23′
5′2TAAAGATGATGGACTGAAAAGGTA23′
5′2TAAAGGAGAATATAAGTGACAGTT23′
350
330
115
283
141
297
213
300
258
244
295
258
217
　
60
61
60
60
50
60
50
60
60
55
55
55
55
图 1　120份欧洲黑杨 PCR扩增产物凝胶电泳图 (引物 W PMS09)
2. 2 SSR标记揭示的资源间遗传距离
根据 SSR标记计算样品间的遗传距离为 0～
01456 4 (图 2 )。来自俄罗斯的 63、64、65号遗传
距离最小 ,来自德国、意大利、俄罗斯的 27、41、85
号与其它材料的遗传距离最远。利用 13对引物基
本能将 120份欧洲黑杨绝大部分的基因资源分开 ,
且差异性很大 ,表明收集的欧洲黑杨基因资源多态
性很高 ,说明收集引进的这批欧洲黑杨基因资源有
很高的保存价值 ,对今后的杨树育种亲本的选择具
有很高的参考价值。
084
第 4期 张香华等 :欧洲黑杨育种基因资源 SSR多态性比较研究
图 2　欧洲黑杨 UPGMA聚类图
184
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
表 3 SSR引物、等位基因数和多态信息量
SSR引物编号 等位基因 多态信息量
PMGC93
PMGC108
PMGC649
PMGC2501
W PMS01
W PMS03
W PMS04
W PMS05
W PMS07
W PMS08
W PMS09
W PMS10
W PMS11
7
7
8
8
15
16
15
15
10
19
16
15
17
01758
01678
01396
01655
01908
01893
01908
01903
01805
01902
01909
01893
01893
平均值 1312 01808
213　欧洲黑杨资源间的遗传关系
在图 2中 ,可从距离 0138处将 120个样品划分
为 8类 :第 1类包括来自土耳其的 10份材料和意大
利的 1份材料 ;第 2类包括俄罗斯 3份材料 ;第 3类
包括意大利 7份、保加利亚 1份、比利时 2份、英国 1
份、德国 6份、捷克 2份、俄罗斯 1份、荷兰 2份、斯
洛伐克 2份、罗马尼亚 1份、南斯拉夫 1份、克罗地
亚 2份 ;第 4类包括南斯拉夫 1份、德国 7份、荷兰 1
份、西班牙 2份、匈牙利 1份、比利时 1份、捷克 1
份、俄罗斯 1份、意大利 8份 ;第 5类 52份材料 ,分
为 3个亚类 :第 1亚类包括来自德国 6份、荷兰 11
份、匈牙利 3份 ,第 2亚类有匈牙利 6份、比利时 5
份、中国新疆乌河 10份、额河 5份 ,第 3亚类包括俄
罗斯 1份、比利时 5份 ,第 6、7、8类分别只有意大
利、德国、俄罗斯的 1个样品。
第 3、4类较杂 ,聚类结果在一定程度上与材料
的地理分布相一致 ,地理分布越近的材料 ,基本可聚
在一起。
利用 13对 SSR引物检测出 171个等位基因变
异 ,能将收集的绝大部分欧洲黑杨区分开 (表 1) ,如
土耳其、德国、荷兰等 ;还有一些资源没有完全区分
开 ,表明它们遗传距离很小 ,有较强的亲缘关系。来
自我国新疆的 2个群体单独聚在一起 ,多态性相对
较差 ,遗传变异较低。表明我国的欧洲黑杨有单独
的地理起源 ,与欧洲的欧洲黑杨分属不同的地理生
态型。本研究中可看出同一地区资源间多态性相对
较低 ,不同地区的资源间的遗传分化大 ,多态性
较高。
3　讨论与结论
SSR标记在基因组中的多态性很高 ,克服了
RFLP、RAPD等标记的不足 ,越来越被广泛应用 [ 18 ]。
不同的 SSR引物多态信息量有一定差异 ,一般来说
SSR引物在属内是保守的 ,因此在遗传多样性检测
中最好选择多态信息量高 ,且具有物种自身特异性
的 SSR核心引物。来自于同一种源的无性系之间的
遗传差异较低 ,而来自不同种源间的无性系的遗传
差异较大。从聚类结果来看 ,来自更小范围的同一
区域内的资源更容易被聚为一类 ,如来自土耳其、我
国新疆的材料被单独聚在一起 ,说明地理分布越近
的品种 ,基本聚在一起 ,但也有交叉现象 ,推断其原
因可能由于所用的引物数量少或它们的亲缘关系较
近造成的。本研究分析供试欧洲黑杨的平均遗传多
态性指数为 01808,表明收集的欧洲黑杨所建立的
基因库遗传差异较大 ,具有丰富的遗传多样性 ,为合
理地利用欧洲黑杨基因资源提供了重要参考。在选
择杂交亲本时 ,可根据聚类结果避免遗传距离过近
的品种间的杂交。
由聚类结果可以看出 ,来自意大利、德国种源的
无性系出现了分离 ,分别聚到不同类群 ,可能有如下
三个方面的原因 : (1)引种时虽然来自这些国家 ,但
某些无性系可能来自其它国家 ,作为欧洲黑杨基因
库保存 ; ( 2 )由于自然、人为等因素造成的基因流
动 ,使种源内的无性系出现了变异 ; (3)由于 SSR标
记依赖自身的重组 ,种源内无性系或种源间无性系
之间发生相同的突变可能性很大 ,都会导致一些无
性系聚类的变化。
采用分子标记分析育种材料的遗传多样性 ,可
以明确亲本之间的可能亲缘关系 ,并与收集的欧洲
黑杨育种基因资源在不同区域建立基因库的表型特
征相结合 ,对于杂交育种的亲本选择将有一定的指
导意义。当然 ,不同目的良种选育需要考虑不同的
目标性状 ,在充分考虑目标性状的同时 ,要尽量避免
选择遗传距离近的亲本材料 ,才有可能取得更大杂
种优势 ,使选育的杂交品种更有潜力。
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