全 文 ：林业科学研究 2009, 22( 3): 397~ 400
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2009) 030397 04
松材线虫与拟松材线虫分泌的纤维素酶系研究
马海宾1, 2, 梁 军 1, 吕 全 1, 张星耀 1*
( 1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,国家林业局森林保护学重点实验室,北京 100091;
2. 中国林业科学研究院热带林业研究所 广东广州 510520)
摘要: 采用羧甲基纤维素钠 ( CMC)、微晶纤维素 (M C)和水杨素 ( SC )三种底物, 用刚果红染色法和 DNS法分别定性
和定量分析了松材线虫和拟松材线虫分泌物中纤维素酶系组分和酶活力。结果表明, 松材线虫和拟松材线虫分泌
物中存在完全降解纤维素所需的 3种酶系组分:内切1, 4葡聚糖酶、外切1, 4葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶, 松材
线虫分泌物中三种酶活力明显高于拟松材线虫酶活力。研究结果为更好的解释松材线虫致病机理提供了科学
数据。
关键词: 松材线虫;拟松材线虫; 纤维素酶系; 酶活力
中图分类号: S763 文献标识码: A
收稿日期: 20080504
基金项目: 国家 十一五 科技支撑项目 ( 2006BAD08A191 ), 科技部国际合作项目 ( 2007DFB30270 ) , 国家重点基础研究发展计划
( 2002CB111404 )
作者简介: 马海宾 ( 1976! ) ,男,回族,助理研究员,博士,研究方向为分子 生态森林病理学.
* 通讯作者:张星耀,男,研究员,博士生导师. Em a i:l xyzhang@ ca.f ac. cn
Study on Cellulase and D ispersalAbility from Bursaphelenchus
xy lophilus and B . mucronatus
MA H aibin1, 2, LIANG Jun1, L Quan1, ZHANG X ingyao1
( 1. Research Inst itu te of Forest Eco logy, Environm ent and Protect ion, CAF, Key Laboratry o fForest Protection, S tate Forestry Adm in istrat ion,
B eijing 100091, Ch ina; 2. R esearch In stitute ofT rop ical Forestry, CAF, Guangzhou 510520, Guangdong, Ch ina)
Abstract: The secretion ce llu lase o fBursaphelenchus xy lophilus and B. mucronatus was ana lyzed while CMC, MC
and SC w ere used to be the celllose resouces for the nematodes secretion degrading. The cellu lase activ ities w ere
tested w ith sta in ing and DNS methods from Bursaphelenchus xy loph ilus and B. mucronatus. The resu lts showed that
therew ere 3 cellulase component in bo thB. xylophilus andB. mucronatus secretion: endo1, 4g lucanase、exo1,
4g lucanase and g lucosidase. The cellulase activity from B. xylophiluswas h igher than that from B. mucronatus. It
w as in ferred that the pathogen icity ofB. xy loph ilus was more serious than that ofB. mucrona tus for the reason of the
ce llulase act iv ity.
Key words:Bursaphelenchus xyloph ilus; Bursaphelenchusmucronatus; cellulose; enzym e activ ity
松材线虫病, 又称松树萎蔫病、松树枯萎病, 是
由松材线虫 ( Bursaphelenchus xy lophilus ( Ste iner&
Buhrer) N ickle)引起的一种毁灭性松林病害。该病
最早于 1905年在日本发现。 20世纪 80年代初, 我
国在南京中山陵首次发现松材线虫病, 迄今成为我
国最为严重的林业外来有害生物 [ 1] , 给松材线虫发
生区造成了严重的经济损失和生态环境压力。松材
线虫病害系统存在复杂的互作关系, 包括松材线虫、
寄主松树、媒介天牛、伴生细菌、树栖真菌及环境因
素,目前尚无有效的病害控制措施。松材线虫病树
体内的病程反应和致病机理尚不清楚, 存在 酶学
说 、毒素 和 空洞化 等致病机理的争议 [ 2 ]。其
林 业 科 学 研 究 第 22卷
中,对纤维素酶在松材线虫病害发生中的作用研究
报道较多 [ 3- 5] , 松材线虫分泌蛋白和纤维素酶免疫
学检测以区别近似种拟松材线虫 (B. mucronatus
M am iya& K iyohera)也取得进展 [ 6- 7]。上述松材线
虫的研究,均把松材线虫分泌的纤维素酶作为一种
致病相关酶对待,而纤维素的完全降解,需要多种酶
系组分共同作用 [ 8] ,以往的研究未见报道。
本研究在此前松材线虫纤维素酶定性检测方法
的基础上,分别用不同酶系组分对应的底物,检测松
材线虫分泌物中的纤维素酶系组分酶活力, 意图为
解释纤维素酶在松材线虫病害中的作用提供科学
证据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
松材线虫和拟松材线虫来源见表 1, 线虫繁殖
用灰葡萄孢 ( Botry tis cinerea Pers. )菌株 CXY1201。
线虫和真菌菌株保存在中国林科院森环森保所病
理室。
1. 2 主要试剂
羧甲基纤维素纳 ( CMC, 汕头西泷化工厂 ), 微
晶纤维素 (M C,进口分装 ), 水杨素 ( SA,北京天佑达
生物工程公司 ) 3, 5二硝基水杨酸 ( DNS, 进口分
装 ) ,其他试剂均为分析纯。
表 1 供试线虫株系
编号 种名 采集地 寄主树种
Bx01 B. xy lophi lu s 浙江 黑松 (P inus thunberg ii Par.l )
Bx02 B. xy lophi lu s 浙江舟山 马尾松 ( P. ma ssoniana Lam b. )
Bx03 B. xy lophi lu s 广东 马尾松 ( P. ma ssoniana Lam b. )
Bx04 B. xy lophi lu s 广州 马尾松 ( P. ma ssoniana Lam b. )
Bx05 B. xy lophi lu s 台湾 木质包装
Bx06 B. xy lophi lu s 云南畹町 思茅松 (P. kesiya Royle ex Gordn. var. langbian en sis Gau ssen )
Bm 01 B. mu cruna tu s 安徽 马尾松 ( P. ma ssoniana Lam b. )
Bm 02 B. mu cruna tu s 广州花都 马尾松 ( P. ma ssoniana Lam b. )
Bm 03 B. mu cruna tu s 辽宁大连 木质包装
Bm 04 B. mu cruna tu s 法国 木质包装
1. 3 试验方法
1. 3. 1 线虫及真菌准备 供试菌株选用本研究室
分离保存的灰葡萄孢接种在马铃薯葡萄糖琼脂
( PDA )平板培养基上, 待菌丝长满平板后备用。供
试线虫选用本研究室收集保存的松材线虫和拟松材
线虫株系。用混合消毒法对线虫进行表面消毒 [ 2] ,
贝尔曼漏斗法分离, 2 000 r∀ m in- 1离心 5 m in或静
止 3~ 4 h,弃上清, 浓缩收集线虫;以无菌水为介质
配成松材线虫液。线虫纯化后于室内用真菌培养繁
殖。用无菌水调整线虫液浓度为 1. 0 # 106 条 ∀
mL
- 1
, 5 ∃ 保存备用。
1. 3. 2 线虫分泌物纤维素酶液制备及测定 取上
述调整好浓度的线虫液,室温下放置 48 h,期间不时
摇动, 置于 4∃ 下冰箱保存备用。用 0. 1mo l∀ L- 1的
乙酸乙酸钠缓冲液 ( pH 值 4. 6 )制备分别含有
0. 1%羧甲基纤维素钠 ( CMC )、0. 1%微晶纤维素
(MC )和 0. 1%水杨素 ( SA ) , 0. 5% 琼脂糖的平板培
养基, 凝固后分别滴加松材线虫和拟松材线虫悬液
上清液 25 L, 25 ∃ 下放置 3 h,恒温培养箱中 45 ∃
温育6 h。用 0. 1%刚果红溶液染色 30 m in, 再分别
用 1mo l∀ L- 1氯化钠漂洗 15 m in, 5% 乙酸漂洗
15 m in。自然晾干,拍照观察 [ 9]。
吸取待测酶液 200 L于 2 mL离心管中, 分别
以 1%的羧甲基纤维素钠 ( CMC)、微晶纤维素 (M C)
和水杨素为底物 (均用乙酸缓冲液 ( pH 值 4. 6)配
制 ) ,加入底物 400 L, 50 ∃ 水浴保温 1 h, 再加入
3 mol∀ L- 1 NaOH 溶液 400 L, DNS试剂 800 L。
颠倒混匀,置沸水浴中 8 m in, 设空白对照,每处理重
复 3次, 取平均值。 490 nm下测定吸光度, 并计算
还原糖的含量。在以上反应条件下, 以每分钟每毫
升酶液产生 1 g葡萄糖的量为一个酶活性单位 [ 9]。
2 结果与分析
2. 1 松材线虫和拟松材线虫分泌物中纤维素酶系
组分
分别以 0. 1%羧甲基纤维素钠 ( CMC )、0. 1%微
晶纤维素 (M C)和 0. 1%水杨素 ( SA )为底物,定性检
测内切 1, 4葡聚糖酶、外切1, 4葡聚糖酶和
葡萄糖苷酶。酶促反应后刚果红染色 0. 5%琼脂糖平
板培养基,漂洗后观察拍照,结果如图 1、2、3所示。
398
第 3期 马海宾等: 松材线虫与拟松材线虫分泌的纤维素酶系研究
A:松材线虫 B:拟松材线虫
图 1 松材线虫和拟松材线虫分泌内切 1, 4葡聚糖酶的染色图
A:松材线虫 B:拟松材线虫
图 2 松材线虫和拟松材线虫分泌外切 1, 4葡聚糖酶的染色图
A:松材线虫 B:拟松材线虫
图 3 松材线虫和拟松材线虫分泌外切 葡萄糖苷酶的染色图
结果表明,松材线虫和拟松材线虫在人工培养
条件下,其分泌物在三种底物上反应后,经刚果红染
色后均出现典型的透明圈, 说明松材线虫和拟松材
线虫均能分泌纤维素酶的三种组分: 内切1, 4葡
聚糖酶、外切 1, 4葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶。
2. 2 松材线虫和拟松材线虫分泌物中纤维素酶
活力
供试的 6个松材线虫株系分泌物中三类酶活性
检测结果见图 4。结果表明, Bx01株系的内切1,
4葡聚糖酶活性为供试 6个松材线虫株系中最高,
为 9. 36 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1, Bx03株系内切 1, 4
葡聚糖酶活性最低,为 6. 76 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1; 外
切 1, 4葡聚糖酶活性分析结果, Bx01株系酶活性
最高, 达到 6. 67 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1, Bx04株系酶活
性最低,为 4. 10 g∀ mL- 1∀ m in- 1;在 葡萄糖苷酶
活性中, Bx02株系酶活性最高,为 7. 35 g∀ mL- 1∀
m in
- 1
,酶活性最低的松材线虫株系是 Bx06, 仅为
3. 61 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1。酶活性方差分析和多重比
较结果见表 2和表 3,结果表明部分松材线虫株系间
酶活性达到极显著差异。
图 4 松材线虫分泌物中纤维素酶活性
图 5 拟松材线虫分泌物中纤维素酶活性
供试的 4个拟松材线虫株系分泌物中三类酶活
性检测结果见图 5。结果表明,酶活性总体趋势同松
材线虫相近,内切 1, 4葡聚糖酶活性最高, 外切
1, 4葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶活性低于前者。其中
Bm03株系的内切1, 4葡聚糖酶活性是供试 4个拟
松材线虫株系中最高, Bm02株系内切1, 4葡聚糖
酶活性最低,为 5. 25 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1;外切1, 4
葡聚糖酶活性分析结果, Bm03株系酶活性最高,达到
4. 22 g∀ mL- 1∀ m in- 1, Bm02株系酶活性最低,为 3.
32 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1;在 葡萄糖苷酶活性中, Bm01
株系酶活性最高,为 4. 63 g∀ mL- 1 ∀ m in- 1, 酶活性
最低的松材线虫株系是 Bm03,仅为 3. 10g∀ mL- 1 ∀
m in
- 1。酶活性方差分析和多重比较结果见表 2和 3,
结果表明,仅拟松材线虫株系 Bm02内切1, 4葡聚
糖酶酶活性同 Bm03和 Bm04间达到显著差异,外切
1, 4葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶活性各拟松材线虫
株系间差异均不显著。
表 2 不同线虫株系分泌纤维素酶活性的方差分析
比较指标 变异来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平
内切 1, 4葡聚糖酶 处理间 0. 126 1 9 0. 014 1 22. 62 < 0. 01
外切 1, 4葡聚糖酶 处理间 0. 048 1 9 0. 005 4 5. 31 < 0. 01
葡萄糖苷酶 处理间 0. 096 2 9 0. 010 7 11. 13 < 0. 01
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林 业 科 学 研 究 第 22卷
表 3 不同线虫株系分泌纤维素酶活性的多重比较
线虫株系
酶活性 ( g∀ mL1∀ m in- 1 )
内切 1, 4
葡聚糖酶
外切 1, 4
葡聚糖酶
葡萄糖
苷酶
5%显著水平
内切 1, 4
葡聚糖酶
外切1, 4
葡聚糖酶
葡萄糖
苷酶
1%显著水平
内切 1, 4
葡聚糖酶
外切 1, 4
葡聚糖酶
葡萄糖
苷酶
B x01 9. 36 6. 67 5. 86 a a b c A A ABC
B x02 9. 29 6. 02 7. 35 ab a a A A A
B x03 6. 76 5. 27 5. 02 cd ab cd CD AB BCD
B x04 8. 68 4. 72 6. 29 ab ab c ab A ABC AB
B x05 8. 30 4. 10 4. 34 b bcd de AB BC CD
B x06 7. 33 4. 74 3. 61 c ab c e BC ABC D
Bm 01 5. 48 3. 60 4. 63 ef cd cde DE BC BCD
Bm 02 5. 25 3. 32 3. 36 f d e E C D
Bm 03 6. 32 4. 22 3. 10 de bcd de CDE ABC D
Bm 04 6. 26 3. 75 3. 59 de cd e CDE BC D
注:平均值后带有相同字母表示差异不显著。
3 讨论
纤维素是植物细胞壁的主要成分, 对植物具有
支持和保护作用, 在木材中大约占 40% ~ 45% [ 10]。
前期研究表明,松材线虫可向体外分泌多种酶,其中
纤维素酶作为导致松树萎蔫的重要酶, 在松材线虫
致病过程中发挥重要作用, 并且曾经有对松材线虫
组织提取液中纤维素酶研究报道 [ 5, 11]。纤维素的完
全降解, 需要内切1, 4葡聚糖酶、外切1, 4葡
聚糖酶和 葡萄糖苷酶三类酶的协同作用。以往
研究集中于对松材线虫分泌的纤维素酶定性分析,
没有对纤维素完全降解所需的三类酶组分分别进行
分析。本研究是建立在线虫离体培养基础上的初步
结果, 是否在罹病松树体内松材线虫分泌纤维素酶
的特征同离体条件下完全一致, 有待于今后进一步
研究。
传统观点一度认为动物自身不能产生纤维素
酶,而是依赖于与其共生的微生物产生纤维素酶, 降
解食物中的纤维素 [ 12]。然而,随着白蚁和线虫可以
分泌内源性的内切1, 4葡聚糖酶的报道, 及相关
基因的分离和克隆, 上述问题已被科学家重新认
识 [ 13- 14 ]。因此,作者提出类似的问题: 松材线虫分
泌的纤维素酶是否是完整降解纤维素的酶系呢? 从
试验结果来看, 一方面证实了前人研究松材线虫和
拟松材线虫均能分泌纤维素酶, 另一方面说明松材
线虫和拟松材线虫分泌的纤维素酶包括了完整的三
类酶, 不过拟松材线虫分泌的纤维素酶活力低于松
材线虫的纤维素酶活力。这为合理解释拟松材线虫
弱性提供了科学依据。
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