全 文 ：收稿日期: 20030512
基金项目: 国家林业部指南项目 竹类植物遗传多样性研究和遗传连锁图谱的构建 (项目编号 190)
作者简介: 邢新婷( 1972 ) ,女,河北藁城人,博士.
* 本实验得到了亚热带林木培育实验室吴开云老师的指导,特致谢意!
林业科学研究 ! 2003, 16( 6) : 655~ 660 !
Forest Research
! ! 文章编号: 10011498( 2003) 06065506
撑篙竹遗传变异的 RAPD分析*
邢新婷, 傅懋毅, 费学谦, 姜景民
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 ! 311400)
摘要: 采用随机扩增多态 DNA( RAPD)方法对 6 个群体 30 丛撑篙竹个体进行了遗传变异的研究。28
个随机引物共检测到 173个位点, 其中 85个是多态位点, 平均每个引物提供 618 个 RAPD信息量, 扩
增出的 DNA片段大小一般在 200~ 2 000 bp 范围之间; 用POPGENE 1 31版软件进行遗传多样性分析:
平均 Nei∀ s 基因多样性为 0211 4, Shannon∀ s 信息指数为0327 7,基因分化系数 0185 3, 表明群体间有
一定的分化; 各群体平均遗传距离 0035 0,表明群体亲缘关系较近; 试用 UPGMA 方法对不同产地的
撑篙竹群体作聚类分析,初步可将 6 个群体聚为 3类。
关键词: 撑篙竹; RAPD; 竹类群体;遗传变异
中图分类号: S795! ! ! 文献标识码: A
撑篙竹( Bambusa pervariabilis McClure)主要分布于广东、广西等地的丘陵山麓及平原河滩
的疏松、肥沃沙质土壤上, 海南、福建也有分布。其竹秆挺直,竹壁厚而坚韧, 可作棚架、撑篙、
农具、家具及建筑用材,是我国华南地区人工栽培的重要用材竹种之一。
近年来,竹类植物的遗传多样性及分子系统学研究已有不少报道[ 1~ 3] 。在各种 DNA 分子
标记中,随机扩增多态性 DNA( Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)技术可以在对物种没
有任何分子生物学研究的情况下, 对其 DNA片段进行多态性分析, 因此在竹类植物群体遗传
结构、多样性和系统分类、进化研究中具有独特的优势[ 4~ 10]。本文从保护生物多样性的角度,
利用 RAPD分子标记技术对 6个产地的撑篙竹群体进行遗传多样性分析, 为进一步开展撑篙
竹种质资源的收集、保存、评价和利用提供科学依据。
1 ! 材料与方法
11 ! 样品采集
供试撑篙竹取自广东增城、怀集、封开、高州和广西桂林、南宁, 根据分子标记取样要求以
及实验室的经验采集了 6个产地 30丛的叶片,每一产地 5丛,每一丛各取 10 g 新鲜嫩叶片,除
去灰尘等杂物和露珠,然后密封于干燥硅胶瓶中带回实验室备用。
12 ! 撑篙竹 DNA提取
采用 SDS方法提取DNA[ 11] ,并略加修改。
13 ! RAPD分析
试验在亚热带林木培育实验室进行。10碱基随机引物和琼脂糖均购自上海生物工程公
司,反应缓冲液、Taq酶、dNTP 以及标准 DNA均购自上海华美生物工程公司。PCR反应在美国
PE公司生产的GeneAmp PCR System PE9600 DNA 扩增仪上进行。先优化反应条件直至扩增带
数清晰重复性好为止。PCR反应体系为 20 L, 2 L 10倍反应缓冲液,模板含量为 50 ng, 15
mmol#L- 1的Mg2+ , 12U的Taq酶, dNTP为 10 mmol#L- 1 , 引物浓度为 375 mol#L- 1。反应程
序为: 94 ∃ 3 min% [ 94 ∃ 1 min%375 ∃ 1 min% 72 ∃ 1 min 20 s] 40个循环 %72 ∃ 8 min %4
∃ 保持。扩增后的产物按常规的方法在 15%琼脂糖凝胶中电泳分离产物, 电泳和制胶缓冲
液用 05倍的TBE。于紫外灯下观察拍照。
14 ! 数据处理及分析
将每个清晰可重复的 DNA电泳带记录下来并将其作为一个位点, 带谱按 10标记,若某
个扩增产物在一个样品中出现就记作 1,未出现记作 0。利用 POPGENE131( Tools for Popu
lation Genetic Analysis )软件( version 131)进行数据的遗传分析, 计算群体间的遗传距离、相似
系数、有效等位基因数Ne,基因多样度H 和 Shannon 信息指数 I、基因分化系数 Gst ; 基于地理
群体间 Nei∀ s[ 12]无偏遗传距离(Unbiased Genetic Distance)估算, 用非加权成组配对法( UPGMA)
对6个群体进行聚类分析。
2 ! 结果与分析
21 ! 引物筛选
采用预备试验中所确立的 PCR扩增程序,各群体随机选取 1丛提取的 DNA 共计 6个模
板,从 112个随机引物中筛选了 28个扩增条带清晰、具多态的引物用于所有模板的扩增, 并对
28个引物的扩增结果进行了RAPD分析。表 1列出了 28个引物的序列及扩增的位点。根据
胶板梳孔数,每个群体有 4个个体,因此图 1和图 2列举了 S32和 S37两个引物对 6个群体 24
个个体扩增的单态和多态标记。
表 1! 28 个 RAPD引物在 6 个撑篙竹地理群体中扩增出的 DNA片段
编号 引物名称
序列
( 5&~ 3&)
扩增总谱带
(多态谱带) 编号
引物
名称
序列
( 5&~ 3&)
扩增总谱带
(多态谱带)
1 S012 CCTTGACGCA 5(1) 15 S063 GGGGGTCTTT 8( 7)
2 S013 TTCCCCCGCT 4(3) 16 S064 CCGCATCTAC 6( 4)
3 S016 TTTGCCCGGA 6(5) 17 S066 GAACGGACTC 4( 1)
4 S020 GGACCCTTAC 7(4) 18 S067 GTCCCGACGA 7( 6)
5 S025 AGGGGTCTTG 4(1) 19 S070 TGTCTGGGTG 6( 5)
6 S032 TCGGCGATAG 8(6) 20 S072 TGTCATCCCC 5( 2)
7 S034 TCTGTGCTGG 4(0) 21 S076 CACACTCCAG 4( 1)
8 S035 TTCCGAACCC 6(1) 22 S094 GGATGAGACC 7( 2)
9 S036 AGCCAGCGAA 5(0) 23 S101 GGTCGGAGAA 6( 4)
10 S037 GACCGCTTGT 9(6) 24 S142 GGTGCGGGAA 9( 3)
11 S052 CACCGTATCC 6(1) 25 S299 TGAGGGTCCC 7( 1)
12 S057 TTTCCCACGG 5(3) 26 S2083 TGGACTCGGT 7( 2)
13 S059 CTGGGGACTT 6(6) 27 S2084 CCCAAGCGAA 7( 3)
14 S061 TTCGAGCCAG 5(2) 28 S2093 TCGGTGAGTC 10(5)
总计 173(85)
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! ! 从表 1中可以看出28个引物扩增出的谱带表现较丰富的多态性。各引物检测到的 RAPD
位点数介于4~ 10之间,平均每个引物提供 618个 RAPD标记的信息量。在 6个群体中 28个
引物共扩增出 173个位点,其中 85个多态位点,占 4913%。这个结果表明在 6个群体之间具
有较丰富的DNA序列多态性。
1~ 4广东高州; 2~ 8 广东封开; 9~ 12 广西桂林;
13~ 16广东增城; 17~ 20 广东怀集; 21~ 24 广西南宁
图 1 ! 随机引物 S32扩增 6个产地部分撑篙竹无性系的 DNA电泳结果
1~ 4广东高州; 2~ 8 广东封开; 9~ 12 广西桂林;
13~ 16广东增城; 17~ 20 广东怀集; 21~ 24 广西南宁
图 2 ! 随机引物 S37扩增 6个产地部分撑篙竹无性系的 DNA电泳结果
22 ! 群体的遗传多样性与分化
遗传多样度和香农( Shannon)信息指数是衡量生物遗传多样性的两个重要指标。基于 28
条RAPD引物所扩增出的多态条带, 利用 POPGENE131软件计算的有效等位基因数 Ne、基因
多样性指数 He和 Shannon 信息指数 I 等指标列于表 2中。撑篙竹群体基因多样度和 Shannon
信息指数 I 分别为 0211 4和 0327 7, 说明其遗传多样性是比较高的;群体间基因分化系数
Gst 值为0185 3,说明撑篙竹群体间变异分量平均占总变异量的 19%左右, 81%左右的遗传变
异存在于群体内。
657第 6 期 邢新婷等: 撑篙竹遗传变异的 RAPD分析
表 2! 6 个产地撑篙竹地理群体的遗传多样性与分化
指标 观测等位基因数 Na
有效等位
基因 Ne
基因多样
度 He
Shannon
信息指数 I
总群体基因
多样性Ht
群体内基因
多样性 Hs
群体间基因分化
系数 Gst
平均数 1720 9 1343 2 0211 4 0327 7 0211 4 0172 2 0185 3
标准差 0449 9 0337 3 0179 6 0254 1 0032 2 0023 5
23 ! 群体间的遗传相似度及聚类图
基因分化系数只能对群体分化的程度作出评价,却不能判定群体间相互关系的远近,而遗
传相似系数和遗传距离的度量则可以说明每个群体间彼此关系的远近。故进一步计算出各群
体间的遗传相似系数和遗传距离(表3) , 群体间遗传相似系数由 0940 5变化到 0994 2,说明
群体间的亲缘关系较近。撑篙竹各群体的遗传距离在 0005 8~ 0061 3范围内变动, 平均为
0035 0,遗传距离较小。
表 3! 撑篙竹 6 个产地群体的 Nei∀ s非偏差遗传距离和遗传相似系数
地点 广东高州 广东封开 广西桂林 广东增城 广东怀集 广西南宁
广东高州 0971 0 0947 8 0940 5 0942 1 0941 7
广东封开 0029 5 0971 7 0956 7 0967 5 0962 4
广西桂林 0053 6 0028 7 0978 7 0982 5 0983 7
广东增城 0061 3 0044 3 0021 6 0994 2 0969 5
广东怀集 0059 6 0033 0 0017 6 0005 8 0976 2
广西南宁 0060 0 0038 4 0016 4 0031 0 0024 1
! ! 注:左下角为遗传距离,右上角为遗传相似系数。
为了衡量群体间和群体内遗传变异的程度, 再一次利用AMOVA 软件对 6个撑篙竹群体
进行遗传变异分析。从表 4可以看出群体间的分化达到显著性差异,约 82%的遗传变异是由
于个体之间的差异造成的,而有 18%的遗传变异是由于群体的不同造成的。这也进一步证实
了对于撑篙竹这样分布范围较窄又常用无性繁殖的物种其群体间可供利用的遗传变异不大。
表 4 ! 6 个产地撑篙竹地理群体 30 丛材料基于 RAPD的 AMOVA分析
变异来源 自由度 平方和 均方 PHIst 均方比 显著性检测
群体间 5 100900 20180 0068 2084( 176% ) < 005
群体内 24 234192 9758 9758( 824% )
总计 29 335092
! ! 注: PHIst 表示估算系统演化亚分类水平上基因型多样性相关程度的指数。
根据遗传距离利用UPGMA聚类法得出了 6个撑篙竹群体的亲缘关系树状图(图 3)。利
用RAPD 标记将 6个产地的撑篙竹群体划分为 3类。广东增城与怀集群体最先聚在一起为第
1类, 因为增城地处广州东部, 为粤东粤西的交通要道, 且增城与怀集都具有丰富的森林资源,
加之交通便利, 有利于林木资源的调运;广西桂林和南宁群体聚在一起,划为第 2类;广东封开
与高州群体聚在一起,划为第 3类;第 1、2两个分支聚在一起后再与第 3分支聚在一起, 广西
的群体与广东增城和怀集群体之间有较近的亲缘关系,因为怀集毗邻广西,故其群体间可能相
互引种;而广东封开、高州位于粤西南部靠近南海,而且其地形较为复杂,森林资源也有别于其
它县市,撑篙竹群体与其它群体亲缘关系也相对较远。
658 林 ! 业 ! 科 ! 学 ! 研 ! 究 第16卷
图 3! 撑篙竹 6个产地群体 UPGMA 聚类法得出的树状图
3 ! 结论与讨论
( 1)关于 RAPD技术在竹类植物品种鉴定和纯度分析上应用的可靠性, 虽有不少报道认
为,由于其重复性较差和非特异性扩增,使得其稳定性较差,但同时许多研究也表明,只要反应
条件严格控制, 重复结果是可以得到的。本研究结果进一步表明, RAPD技术在竹类植物种质
鉴定上应用的可靠性关键在于引物的筛选及标准模式的建立,但对于不同的材料,尚需进行深
入探索,才能筛选到合适的引物并建立起多态性扩增的标准模式与图谱,使鉴定手段快速简
便,结果准确可靠。
( 2)植物群体的遗传结构对其进化进程、引种驯化和基因保存的重要性已受到普遍的重
视。Gst 是遗传分化的衡量指标, Ellstand & Elam[ 13] 认为 Gst > 01意味着群体间变异程度较
高。本研究利用 28个不同随机引物对撑篙竹 6个产地群体的 DNA序列进行了分析, 其群体
间基因分化系数 Gst 值为 0185 3, 大于 01, 说明撑篙竹是群体间分化较大的一类丛生竹种。
方差分析的结果也表明撑篙竹群体分化较明显, 但群体间变异量仅占总变异量的 18%左右,
82%左右的遗传变异存在于群体内个体间。建议对广东、广西撑篙竹遗传资源进行全面考察,
以确定广东、广西地区在中国撑篙竹起源与进化中的地位并确定中国撑篙竹遗传资源的开发
目标和策略。鉴于本文所取群体和无性系数较少,应该增加试验及样本数,才能使得结果更加
可靠。
( 3)由于竹类植物特殊的生物学特性,过去所采用的分类方法很难对其进行准确的分析和
鉴定, 因而限制了竹类植物种质资源的获得、保护和充分利用,降低了竹类植物育种效率。目
前,各种 DNA分子标记均可用于指纹图谱分析,但 RAPD标记在竹类植物上发表最多、应用最
广。撑篙竹的分布范围相对较狭小,而且从形态上比较难以区分, 本研究利用 RAPD技术对 6
个产地的撑篙竹种质资源进行了聚类分析,虽然所取群体样本数相对较少,但不同产地的撑篙
竹群体也可以明显地被区分开来。可见,结合分类学上竹类植物的分类现状, RAPD技术作为
一种遗传标记, 用于鉴定竹类品种及竹子无性系等是很有价值的,并能对分类上有争议的问题
提供一种很好的解决办法。
659第 6 期 邢新婷等: 撑篙竹遗传变异的 RAPD分析
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RAPD Analysis on Genetic Variation of Bambusa pervariabilis McClure
XING Xinting , FU Maoyi, FEI Xueqian , JIANG Jingmin
( Research Institute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang! 311400,Zhejiang, China)
Aberstract: Thirty clumps of six populations of Bambusa pervariabilis were analyzed by random amplified poly
morphicDNA ( RAPD) markers to determine the genetic variations among and within the populations. A total of
173 loci including 85 polymorphic loci were amplified using 28 random primers, with an average of 6. 18 frag
ments each primer. The length of fragments was between 200 bp and 2 000 bp. As analyzed by POPGENE ver
sion 1. 31, the data from six populations had an averageNei∀ s gene diversity of 0. 211 4, and Shannon∀ s genet
ic diversity of 0. 327 7, coefficient of gene differentiat ion( Gst ) of 0. 185 3, indicat ing that there was some dif
ferentiation among the populations. The average genet ic distance among populations was 0. 035 0, indicating
that there was close relative relations among populat ions. The six populations were clustered to three categories
by cluster analysis (UPGMA) based on Nei∀ s unbiased genetic distance.
Key words: Bambusa pervariabilis; RAPD; population; genetic variation
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