全 文 ：书林业科学研究 ２０１２，２５（２）：１１１ １１６
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０１１１０６
基于芭蕉属 ＥＳＴ序列的地涌金莲 ＳＳＲ引物开发
李文娟，马 宏，李正红，万友名，刘秀贤，周翠丽
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 ６５０２２４）
收稿日期：２０１１１１０２
基金项目：林业公益性行业科研专项（２００９０４０５３）；云南应用基础研究面上项目（２００９ＺＣ１８８Ｍ）
作者简介：李文娟（１９８７—），女，陕西榆林人，硕士，主要从事园林植物分子遗传育种研究．
通讯作者．
摘要：对３１３０８条来自ＮＣＢＩ的芭蕉属（Ｍｕｓａ）ＥＳＴ序列进行拼接得到全长为１３．５１Ｍｂ的２１１２９条无冗余ＥＳＴ序列
（含３８１８条ｃｏｎｔｉｇｓ及１７３１１条ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ），其中，４９４４条（２３．４０％）ＥＳＴ序列含有５４１６条ＳＳＲｓ，ＳＳＲ的出现频率
为２５．６３％，平均分布距离２．４９Ｋｂ，有２３４条（１．１１％）含有１个以上的ＳＳＲ。在所检测的ＳＳＲ中，二、三、四核苷酸
重复是主导重复类型，分别占ＥＳＴＳＳＲ总数的２１．８０％（１１８１条）、５２．５５％（２８４６条）和１４．５５％ （７８８条）。ＡＧ／
ＣＴ、ＡＡＧ／ＣＴＴ与ＡＧＧ／ＣＣＴ和ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ与ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ分别是二、三、四核苷酸的优势重复基元。随机设计了
２３８对ＥＳＴＳＳＲ引物在２４个地涌金莲个体中进行筛选，１１６对有扩增产物，其中，７８对ＥＳＴＳＳＲ引物扩增出清晰稳
定的目的片段，４９对引物表现出多态性。本研究检测的１５对引物扩增等位基因数范围是２～７个，平均３．０６７个；
表观杂合度（Ｈｏ）范围是０．０４２ ０．７５０，平均０．２５０；期望杂合度（Ｈｅ）范围是０．２３２～０．８２３，平均０．５２２。
关键词：地涌金莲；ＥＳＴＳＳＲ；多态性引物；分子标记
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳＳＲＭａｒｋｅｒｓｏｆＭｕｓｅｌａｌａｓｉｏｃａｒｐａｂｙ
ＤａｔａＭｉｎｉｎｇｉｎＭｕｓａＥＳＴＳｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＬＩＷｅｎｊｕａｎ，ＭＡＨｏｎｇ，ＬＩＺｈｅｎｇｈｏｎｇ，ＷＡＮＹｏｕｍｉｎｇ，ＬＩＵＸｉｕｘｉａｎ，ＺＨＯＵＣｕｉｌｉ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：２１１２９ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔｃｌｕｓｔｅｒｓ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ３８１８ｃｏｎｔｉｇｓａｎｄ１７３１１ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ，ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍａ
ｔｏｔａｌｏｆ３１３０８ｐｕｂｌｉｃｌｙａｖａｉｌａｂｌｅＭｕｓａＥＳＴｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．４９４４（２３．４０％）ｏｆｔｈｅｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ５４１６（２５．６３％）ＳＳＲ
ｍｏｔｉｆｓ，ａｎｄｔｈｅｄｉ（２１．８０％），ｔｒｉ（５２．５５％）ａｎｄｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１４．５５％）ａｒｅｔｈｅｍａｉｎｍｏｔｉｆｓｏｆａｌＳＳＲｓｏｂ
ｔａｉｎｅｄ．ＡＧ／ＣＴｒｅｐｅａｔｓｗｅｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｉｎｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｔｉｆ，ＡＡＧ／ＣＴＴａｎｄＡＧＧ／ＣＣＴｒｅｐｅａｔｓｗｅｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｉｎ
ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｔｉｆ，ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴａｎｄＡＡＡＴ／ＡＴＴＴｒｅｐｅａｔｓｗｅｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｉｎｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｔｉｆ．２３８ＥＳＴｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙ
ｓｉｓｉｎＭｕｓｅｌａｌａｓｉｏｃａｒｐａ．Ｏｆｗｈｉｃｈ，１１６ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｎｄ７８ｐａｉｒｓｇａｖｅ
ｃｌｅａｒｂａｎｄｓ．４９ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ａｓｅｔｏｆ１５ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｒｏｍａｂｏｖｅ４９ＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓｓｅｌｅｃｔｅｄｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇ２４ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｆｒｏｍ４ｗｉｌｄＭ．ｌａｓｉｏｃａｒｐａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅａｌｅｌｅｎｕｍ
ｂｅｒｏｆ３．０６７ｐｅｒｌｏｃｕｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｒａｎｇｅｆｒｏｍ２ｔｏ７．Ｔｈｅｏｂｓｅｒｖｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｉｅｓｐｅｒｍａｒｋｅｒｗｅｒｅｒａｎｇｅｄ
ｆｒｏｍ０．０４２ｔｏ０．７５０（ｍｅａｎ０．２５０）ａｎｄｅｘｐｅｃｔｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｉｅｓｗｅｒｅ０．２３２ｔｏ０．８２３（ｍｅａｎ０．５２２）．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｕｓｅｌａ；ＥＳＴＳＳＲ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｐｒｉｍｅｒ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ
林 业 科 学 研 究 第２５卷
微卫星标记（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）以其
特异性好、多态性高、共显性标记、分布广泛和操作
简便等优点而迅速成为分子生物学研究的重要手
段，但传统的ＳＳＲ引物开发的周期长、费用高且效率
低［１－２］。表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ，ＥＳ
Ｔｓ）是通过大规模ｃＤＮＡ随机测序产生，１个 ＥＳＴ代
表生物个体的某种组织或细胞在某一时期的１个表
达基因。利用ＥＳＴ开发 ＳＳＲ引物相对简单快速、成
本低，且在不同种、不同属甚至在不同科的物种间具
有良好的通用性［３－５］，同时，急剧上升的ＥＳＴ数目为
ＳＳＲ的开发提供了可能。１９９１年各公共数据库中的
ＥＳＴ数目不足２０００条，而截止到２０１１年１１月，ＮＣ
ＢＩ上小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）有 １０７万条，玉米
（ＺｅａｍａｙｓＬ．）２０２万条，水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）１２６
万条，芭蕉科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）植物的 ＥＳＴ序列超过３万
条，且仍在不断更新。ＥＳＴ反映了基因的编码部分，
可以直接获得基因表达的信息，与基因组ＳＳＲ相比，
ＥＳＴＳＳＲ可提供基因表达信息，为功能基因的直接
鉴定提供了可能性。目前，ＥＳＴＳＳＲｓ被广泛应用于
遗传连锁图谱的构建、群体遗传学研究、分子辅助育
种、品种鉴定和系谱分析［６－９］等方面的研究。
地涌金莲（Ｍｕｓｅｌａｌａｓｉｏｃａｒｐａ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｃ．Ｙ．
ＷｕｅｘＨ．Ｗ．Ｌｉ）属芭蕉科地涌金莲属（Ｍｕｓｅｌａ），是
中国特有单属种，多年生大型草本植物［１０］，主要分
布在我国云南、四川等地，其除具有极高的观赏价值
外，可食用、入药［１１］。目前，涉及地涌金莲分子标记
的研究很少见，潘庆杰利用１０对ＲＡＰＤ引物对地涌
金莲栽培和野生种群进行了遗传多样性分析［１２］；
Ｙａｎｇ利用传统测序的方法开发出 １７对地涌金莲
ＳＳＲ引物［１３］，这远不能满足对其从分子遗传层面
进行研究所需。随着新的地涌金莲变异类型和野
生种群被发现［１１］，对其种群遗传结构的研究迫切
需要更多的分子标记；然迄今为止，在公共数据库
中还未能搜索到地涌金莲 ＥＳＴ序列，本文利用生
物信息学手段，对数据库中芭蕉属 ＥＳＴ序列进行
分析并开发适用于地涌金莲的 ＳＳＲ引物，为后续
地涌金莲遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的研究
奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
选取４个地涌金莲野生种群的共２４个个体，全
部表现为绿色叶中脉及纯黄色苞片。取未展开的幼
叶，用ＣＴＡＢ法［１４］提取总 ＤＮＡ，浓度调至 ５０ｎｇ·
μＬ－１，于－２０℃中保存备用。
１．２ ＥＳＴＳＳＲ信息分析
２０１０年９月１０日从 ＮＣＢＩ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｅｓｔ）以 ＦＡＳＴＡ格式获取３１３０８条
芭蕉属ＥＳＴ序列，主要来自于叶片及根部组织，其
中，１１１５５条属 ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（１１０７０条为 ＡＢＢ类
型），５２８９为 Ｍ．ｂａｌｂｉｓｉａｎａ，１４８６４为 Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ
（７０５１为ＡＡＡ类型）。用 ｓａｒａｆｅｒ１．３（ｈｔｐ：／／ａｃｅｐｈ
ｐｘ．ｃｒｏｐｄｂ．ｏｒｇ／ｓｅｒａｆｅｒ．ｐｈｐ）软件包的 ＣＡＰ３［１５］剔除
冗余序列，重叠一致百分比９５％，最小序列长度２０
ｂｐ，其余参数默认；ＳｅｑＣｌｅａｎ去除长度小于 １５０ｂｐ
的序列和劣质序列；ＬｅａｐＳＳＲ程序搜寻 ＳＳＲ，ＳＳＲ搜
寻条件为：ｄｉ，ｔｒｉ，ｔｅｔｒａ，ｐｅｎｔａ和 ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
（ＤＮＲｓ，ＴＮＲｓ，ＴｅＮＲｓ，ＰＮＲｓ和ＨＮＲｓ）最小重复单元
分别为６，４，３，３和 ３，同时搜索复合 ＳＳＲ（间隔序列
不大于２０ｂｐ）。
１．３ 引物设计
利用Ｐｒｉｍｅｒ３［１６］对含有ＳＳＲ位点的 ＥＳＴ序列进
行引物设计，设计参数：引物长度１８ ２５ｂｐ（最适
２０ｂｐ）；引物Ｔｍ值５７℃（最大６３℃，最小５２℃，上
下游引物 Ｔｍ值相差不超过 ５℃）；预期产物大小
１００ ５００ｂｐ，ＣＧ％含量为３５％ 至６５％。引物由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。
１．４ ＰＣＲ扩增程序
ＰＣＲ反应体系（２０μＬ）：２５ｎｇ模板ＤＮＡ，０．７５Ｕ
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１×ＰＣＲｂｕｆｅｒ（１０ｍｍｏｌＴｒｉｓ
ＨＣｌｐＨ８．０，５０ｍｍｏｌＫＣｌ），１．８ｍｍｏｌＭｇＣｌ２，０．１３
ｍｍｏｌｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ），上下游引物各０．２５μｍｏｌ，去
离子水补足２０μＬ。ＰＣＲ反应在 ＰＴＣｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ
（ＢＩＯＲＡＤ）上进行：９５℃预变性４ｍｉｎ，９５℃变性
４５ｓ，引物以各自的 Ｔｍ值复性 ４５ｓ，７２℃延伸 １
ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．５ 检测及数据分析
ＰＣＲ产物用８％ （２９∶１ａｃｃｌａｉｍｅｄ∶ｂｉｓ）非变性
聚丙烯酰胺凝胶进行分离，电压设定 １２０Ｖ，时间
１４０ｍｉｎ，在１５ｍｇ·ｍＬ－１的ＥＢ（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）中
染色３ ５ｍｉｎ，凝胶成像仪拍照。产物片段大小用
ｐＵＣ１９ＤＮＡ／ＭｓｐＩｍａｒｋｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）进行标定。
以ＰｏｐＧｅｎ３２（ｖｅｒｓｉｏｎ１．３１，ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕａｌｂｅｒ
ｔａ．ｃａ／ ｆｙｅｈ／）进行等位基因数 （ＮＡ）、ＬｉｎｋａｇｅＤｉｓ
ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ（ＬＤ）、表观杂合度 （Ｏｂｓｅｒｖｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙ
ｇｏｓｉｔｙ，Ｈｏ）和期望杂合度 （Ｅｘｐｅｃｔｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，
２１１
第２期 李文娟等：基于芭蕉属ＥＳＴ序列的地涌金莲ＳＳＲ引物开发
Ｈｅ）的分析以及ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｇｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ（ＨＷＥ）
的计算。
２ 结果与分析
２．１ 芭蕉属ＥＳＴＳＳＲ发生频率
对ＮＣＢＩ上公开的３１３０８条芭蕉属ＥＳＴ序列进
行分析，去除劣质序列并进行拼接，得到２１１２９条
非冗余序列（包括３８１８条 ｃｏｎｔｉｇｓ和１７３１１条 ｓｉｎ
ｇｌｅｔｏｎｓ），序列总长度 １３．５１Ｍｂ，其中，４９４４条
（２３．４０％）ＥＳＴ序列含有５４１６条 ＳＳＲ，ＳＳＲ的出现
频率为２５．６３％，平均每隔２．４９ｋｂ就有一个 ＳＳＲ，
有２３４条（１．１１％）含有１个以上的ＳＳＲ。在所检测
的 ＳＳＲ中，三核苷酸所占比例最多，为 ５２．５５％
（２８４６条），其次为二核苷酸，占 ２１．８０％（１１８１
条），四核苷酸占１４．５５％ （７８８条），三者共占全部
ＳＳＲ的８８．９０％，其余五核苷酸（３．８６％）和六核苷
酸 （７．２４％）数量相近（表１）。
ＳＳＲｓ长度在１２ ８３个核苷酸之间，重复次数
范围为３至３８，绝大多数的 ＳＳＲ（７３．０６％）为 ３、４
、５或６个重复单元（图１）。
表１ ＳＳＲ在芭蕉属ＥＳＴ中的分布
重复类型 数目
所占比例
／％
出现频率
／％１）
平均距离
／ｋｂ２）
二核苷酸 １１８１ ２１．８０ ５．５９ １１．４４
三核苷酸 ２８４６ ５２．５５ １３．４７ ４．７５
四核苷酸 ７８８ １４．５５ ３．７３ １７．１４
五核苷酸 ２０９ ３．８６ １．００ ６４．６４
六核苷酸 ３９２ ７．２４ １．８６ ３４．４６
总计 ５４１６ １００．００ ２５．６３ ２．４９
注：１）出现频率 ＝检出 ＳＳＲ数目／无冗余 ＥＳＴ总数；２）平均距
离＝无冗余ＥＳＴ总长度／ＳＳＲ数目。
图１ ＳＳＲｓ重复次数分布
表２ 芭蕉属主要重复基元的分布
Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ
基元 数量 比例／％
Ｍ．ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ
基元 数量 比例／％
Ｍ．ｂａｌｂｉｓｉａｎａ
基元 数量 比例／％
ＡＧ／ＣＴ ４１０ ７６．３５ ＡＧ／ＣＴ ３７３ ８７．９７ ＡＧ／ＣＴ １８９ ８５．９１
ＡＣ／ＧＴ ４２ ７．８２ ＡＣ／ＧＴ ２３ ５．４２ ＡＣ／ＧＴ ９ ４．０９
ＡＴ／ＡＴ ８４ １５．６４ ＡＴ／ＡＴ ２８ ６．６１ ＡＴ／ＡＴ ２０ ９．０９
ＣＧ／ＣＧ １ ０．１９ ＣＧ／ＣＧ ０ ０．００ ＣＧ／ＣＧ ２ ０．９１
合计 ５３７ １００．００ 合计 ４２４ １００．００ 合计 ２２０ １００．００
ＡＡＣ／ＧＴＴ ４４ ２．９４ ＡＡＣ／ＧＴＴ １６ １．９１ ＡＡＣ／ＧＴＴ ８ １．５７
ＡＡＧ／ＣＴＴ ３１７ ２１．１９ ＡＡＧ／ＣＴＴ ２４７ ２９．４４ ＡＡＧ／ＣＴＴ １２３ ２４．０７
ＡＡＴ／ＡＴＴ ３５ ２．３４ ＡＡＴ／ＡＴＴ ６ ０．７２ ＡＡＴ／ＡＴＴ ４ ０．７８
ＡＣＣ／ＧＧＴ １０６ ７．０９ ＡＣＣ／ＧＧＴ ６７ ７．９９ ＡＣＣ／ＧＧＴ ４９ ９．５９
ＡＣＧ／ＣＧＴ ７４ ４．９５ ＡＣＧ／ＣＧＴ ２４ ２．８６ ＡＣＧ／ＣＧＴ ２０ ３．９１
ＡＣＴ／ＡＧＴ ４６ ３．０７ ＡＣＴ／ＡＧＴ ２９ ３．４５ ＡＣＴ／ＡＧＴ １６ ３．１３
ＡＧＣ／ＧＣＴ １９８ １３．２４ ＡＧＣ／ＧＣＴ １０８ １２．８７ ＡＧＣ／ＧＣＴ ６６ １２．９２
ＡＧＧ／ＣＣＴ ３３５ ２２．３９ ＡＧＧ／ＣＣＴ ２０１ ２３．９６ ＡＧＧ／ＣＣＴ １７１ ３３．４６
ＡＴＣ／ＧＡＴ １１０ ７．３５ ＡＴＣ／ＧＡＴ ７３ ８．７０ ＡＴＣ／ＧＡＴ ４３ ８．４２
ＣＣＧ／ＣＧＧ ２３１ １５．４４ ＣＣＧ／ＣＧＧ ６８ ８．１０ ＣＣＧ／ＣＧＧ １１ ２．１５
合计 １４９６ １００．００ 合计 ８３９ １００．００ 合计 ５１１ １００．００
ＡＡＡＣ／ＧＴＴＴ １８ ４．６０ ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ ４８ ２２．５４ ＡＡＡＣ／ＧＴＴＴ ８ ４．３５
ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ ４８ １２．２８ ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ １３ ６．１０ ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ １６ ８．７０
ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ １８ ４．６０ ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ ２１ ９．８６ ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ ３２ １７．３９
ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ ２５ ６．３９ ＡＡＧＣ／ＧＣＴＴ １６ ７．５１ ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ ９ ４．８９
ＡＧＧＧ／ＣＣＣＴ ２２ ５．６３ ＣＣＡＴ／ＡＴＧＧ １１ ５．１６ ＡＧＧＴ／ＡＣＣＴ １９ １０．３３
ＡＣＣＣ／ＧＧＧＴ １４ ３．５８ ＡＧＧＧ／ＣＣＣＴ １２ ５．６４ ＡＧＧＧ／ＣＣＣＴ ９ ４．８９
ＮＮＮＮ ２４６ ６２．９２ ＮＮＮＮ ９２ ４３．１９ ＮＮＮＮ ９１ ４９．４５
合计 ３９１ １００．００ 合计 ２１３ １００．００ 合计 １８４ １００．００
ＡＡＡＡＧ／ＣＴＴＴＴ １２ １０．６２ ＡＡＧＡＧ／ＣＴＣＴＴ １７ ２８．３３ ＡＡＡＡＴ／ＡＴＴＴＴ ４ １１．１１
ＮＮＮＮＮ １０１ ８９．３８ ＮＮＮＮＮ ４３ ７１．６７ ＮＮＮＮＮ ３２ ８８．８９
合计 １１３ １００．００ 合计 ６０ １００．００ 合计 ３６ １００．００
ＮＮＮＮＮＮ １７３ １００．００ ＮＮＮＮＮＮ １０９ １００．００ ＮＮＮＮＮＮ １１０ １００．００
总计 ２７１０ 总计 １６４５ 总计 １０６１
３１１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
２．２ 芭蕉属３个种ＥＳＴＳＳＲ的特点
在３个种 Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ，Ｍ．ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ和 Ｍ．
ｂａｌｂｉｓｉａｎａ中，分别搜索到 ＳＳＲｓ为 ２７１０、１６４５和
１０６１条，其二核苷酸重复基元均是以 ＡＧ／ＣＴ为主
导重复类型，分别占７６．３５％、８７．９７％和８５．９１％；三
核苷酸重复基元以 ＡＡＧ／ＣＴＴ与 ＡＧＧ／ＣＣＴ占优势，
分别占三核苷酸 ＳＳＲｓ的 ４３．５８％、５３．４０％和
５７．５３％；四核苷酸优势重复基元在Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ和
Ｍ．ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ中是 ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ（分别 １２．２８％和
２２．５４％），而 Ｍ．ｂａｌｂｉｓｉａｎａ则是以 ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ为
主（１７．３９％）；其它二、三、四、五和六核苷酸重复基
元类型出现频率较低，分布也相对分散（表２）。
２．３ 地涌金莲ＥＳＴＳＳＲ多态性引物筛选
在包含有 ＳＳＲ的 ＥＳＴ序列中，随机挑选 ２３８
对进行 ＳＳＲ引物设计以开发地涌金莲多态性 ＳＳＲ
引物。共有１１６对（４８．７４％）引物有扩增产物，７８
对扩增出条带清晰的目的片段，有效扩增率为
３２．７７％，４９对引物显示出多态性，多态率为
６４．１０％。用１５对多态性引物对来自４个地涌金
莲野生种群的２４个个体进行多态性检测（图２），
扩增出的等位基因数范围是２ ７个，平均３．０６７
个，其表观杂合度（Ｈｏ）范围是０．０４２ ０．７５０，平
均０．２５０；期望杂合度（Ｈｅ）范围是０．２３２ ０．８２３，
平均０．５２２。这些引物中，有８对在 Ｐ＜０．０１时偏
离 ＨＷＥ平衡，占所检测多态性引物的 ５３．３３％
（表３）。
表３ 地涌金莲多态性ＥＳＴＳＳＲ引物信息
位点 重复基元 引物序列（５’３’） 等位基因／个 退火温度／℃ 产物大小／ｂｐ Ｈｏ Ｈｅ ＨＷＥ
ｓｍｕ２７ （ＡＧＣＴＧＡ）４ Ｆ：ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＴＡ ２ ５６ ２３８ ２５０ ０．２６１ ０．２３２ ０．５１５
Ｒ：ＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧ
ｓｍｕ１５０ （ＡＧＡＴＣＡ）４ Ｆ：ＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣ ２ ６２ ２０２ ２０８ ０．０００ ０．４７４ ０．０００
Ｒ：ＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＣＡＡＧ
ｓｍｕ２２４ （ＧＧＡ）５ Ｆ：ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＡＴ ２ ５５ ２４４ ２４７ ０．０００ ０．３８３ ０．０００
Ｒ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧ
ｓｍｕ２２５ （ＡＡＧ）５ Ｆ：ＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣ ２ ５９ １８２ １８７ ０．０４２ ０．３６１ ０．０００
Ｒ：ＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＧＡＣＡＣ
ｓｍｕ２３３ （ＧＣＣ）７ Ｆ：ＡＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧ ２ ６２ １８７ １９０ ０．０００ ０．４７４ ０．０００
Ｒ：ＡＣＡＡＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＡＴＡＡＣＧ
ｃｍｕ２４ （ＴＣＴ）５ Ｆ：ＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＣ ４ ５９ ２５０ ２６２ ０．１３０ ０．７１４ ０．０００
Ｒ：ＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＴＧＣ
ｃｍｕ３５ （ＡＡＧ）１３ Ｆ：ＡＣＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＧＣＧＧ ３ ６１ ２７７ ２８６ ０．０００ ０．５５７ ０．０００
Ｒ：ＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＴ
ｃｍｕ５２ （ＧＴＧ）４ Ｆ：ＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＧＡＧ ２ ５１ ２３５ ２３８ ０．２５０ ０．３８３ ０．０７８
Ｒ：ＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＣＴＧＣ
ｃｍｓ３ （ＣＴ）１０ Ｆ：ＴＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＧＴＣ ４ ５３ １６６ １７８ ０．５２２ ０．７４３ ０．０１５
Ｒ：ＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＣＡ
ｃｍｓ４ （ＣＴ）１９ Ｆ：ＡＧＧＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＴ ３ ５６ １５６ １６４ ０．６６７ ０．５４７ ０．０９５
Ｒ：ＡＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＡ
ｍｍｓ７ （ＧＡＴＡＣＴ）３ Ｆ：ＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡ ２ ５６ ２１２ ２１５ ０．０００ ０．４５４ ０．０００
（ＣＡＧ）４ Ｒ：ＴＧＣＧＧＧＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡ
ｍｍｓ１４ （ＴＣＡ）５ Ｆ：ＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＡＴ ７ ５７ ２３２ ２６２ ０．３３３ ０．８２３ ０．０００
（ＴＴＣ）６ Ｒ：ＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡ
ｍｍｓ２５ （ＴＣ）１９ Ｆ：ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣ ５ ６０ １３６ １６０ ０．７５０ ０．７４３ ０．２７３
（ＴＧ）１３ Ｒ：ＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＡ
ｍｕｓｆ３２ （ＣＴ）１３ Ｆ：ＴＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＧ ２ ５７ ２６６ ２７４ ０．１３０ ０．２６４ ０．０１０
Ｒ：ＡＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＡＣＣＴＣＧＡＴＡ
ｍｕｓｆ４３ （ＣＡ）１３ Ｆ：ＣＡＡＣＣＧＡＣＡＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴ ４ ６２ １９７ ２０７ ０．６６７ ０．６７９ ０．０４３
Ｒ：ＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴ
平均 ３．０６７ ０．２５０ ０．５２２
注：Ｈｏ：表观杂合度；Ｈｅ：期望杂合度；偏离哈迪温伯格平衡（Ｐ＜０．０１）。
４１１
第２期 李文娟等：基于芭蕉属ＥＳＴ序列的地涌金莲ＳＳＲ引物开发
图２ 引物ｃｍｕ２４扩增带谱
３ 讨论
在芭蕉属植物２１１２９条无冗余 ＥＳＴ序列中，检
测到ＳＳＲ位点５４１６个，检出率是２５．６３％，平均每隔
２．４９ｋｂ就有１个ＳＳＲ，检出率远高于小麦（３．２％）、
水稻（４．７％）、玉米（１．５％）、高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｓｐｐ．，
３．６％）和甘蔗（Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｐｐ．，２．９％）［３，１７－１９］，同时
也高于在香蕉（ＭｕｓａｎａｎａＬｏｕｒ．）ＥＳＴ序列中 ＳＳＲ
（５．３％）的检出率［２０］。这些差异可能是物种间真实
的ＳＳＲ差异或各物种在 ＧｅｎＢａｎｋ中可用来分析的
ＥＳＴ数量不同，也可能是搜寻 ＳＳＲ时所用软件或所
设定最低重复数不同所致。Ｖａｒｓｈｎｅｙ等［２１］认为，高
的ＥＳＴＳＳＲｓ检出率可能与该物种基因组较小有关。
研究表明，三核苷酸在多数植物中分布几率较
高［２１］。在芭蕉属植物中，三核苷酸重复序列占ＳＳＲｓ
的５２．５５％，处于主导地位，这与前人对多种植物
ＥＳＴＳＳＲｓ分析结果一致［１７，２２－２３］。
当４种不同的碱基随机组合时，若ＥＳＴＳＳＲｓ数
目足够大且无偏倚性，将可能分别产生２、４、１０、３３、
１０２和３５０种单、二、三、四、五、六核苷酸重复［２４］。
本研究显示，在芭蕉属３个物种 Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ，Ｍ．
ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ和Ｍ．ｂａｌｂｉｓｉａｎａ中，二、三和四核苷酸重
复基元均表现出明显的偏倚性，ＡＡＧ／ＣＴＴ与 ＡＧＧ／
ＣＣＴ是三核苷酸重复的主要类型，分别占 ＳＳＲｓ的
４３．５８％、５３．４０％和５７．５３％，这与王静毅［２０］对香蕉
ＥＳＴＳＳＲｓ分析结果略有差异。此外，ＧＧＣ／ＣＣＧ和
ＡＣＧ／ＴＣＧ在水稻、玉米、高粱和大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌ
ｇａｒｅＬ．）中是主要三核苷酸重复类型，而小麦中是
ＡＡＣ／ＴＴＧ［１７］。产生这种差异的原因除所用 ＥＳＴ数
目不同或ＳＳＲ最小长度设定不同之外，也可能是由
于不同物种自身ＥＳＴＳＳＲ的特点及不同研究所选用
的ＥＳＴ来源有差异所致。与多数植物相似［１７－１８，２５］，
芭蕉属３个种的二核苷酸重复基元均是以 ＡＧ／ＣＴ
为主导重复类型，而ＣＧ／ＣＧ重复数量最少。
ＥＳＴＳＳＲ来自编码区，侧翼序列在物种之间高
度保守，在物种间具有良好的通用性［３－５］。本研究
中，随机挑选并设计的２３８对芭蕉属 ＥＳＴＳＳＲ引物
中，共有１１６对引物在地涌金莲中有扩增产物，其中
７８对可以扩增出清晰、稳定的目的产物，占合成引
物的３２７７％，处于中等水平［２６］。１６０对引物无扩
增产物或引物扩增产物与预期目的片段大小不符，
可能是因为对应 ＤＮＡ扩增区间有内含子导致产物
大于预期片段大小，或是引物位于转座子或重复
ＤＮＡ区域内而产生偏离目的片段的产物，也可能是
由于该位点在不同属的植物间具有较大的变异，这
也印证了ＥＳＴＳＳＲ具有序列保守性。经初步检测，
４９对具有多态性，占有扩增产物引物的 ６４．１０％。
每对多态性引物检测出的等位基因为２ ７个，平
均３．０６７个，低于地涌金莲基因组ＳＳＲ引物［１３］。研
究表明，通常ＥＳＴＳＳＲ基元重复次数较ｇｅｎｏｍｉｃＳＳＲ
少，因此，其多态性也低［３，２７－２８］，此外，基因编码区
序列高度保守也是 ＥＳＴＳＳＲ多态性较低的原因
之一。
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