全 文 ：林业科学研究
2006, 19( 2): 216~ 220
Forest R esearch


文章编号: 1001
1498( 2006) 02
0216
05
HaNPV病毒对寄主昆虫的持续作用研究
曲良建 1, 张永安1* , 王玉珠1, 郎杏茹 2
( 1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,国家林业局森林保护学重点实验室,北京
100091;
2. 宁夏森林病虫害防治检疫总站,宁夏 银川
750001 )
摘要: 用不同浓度的 H aNPV病毒感染 3龄棉铃虫幼虫并分别收集不同处理的存活试虫进行室内传代饲养。结果表
明, 病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用, 而且对蛹质量和化蛹均有明显的影响, 尤其是对亲代和子一代的寄主
昆虫。同时, 通过 PCR技术 ,从子一代的幼虫和蛹中成功检测到该病毒, 从而在分子水平上证明了病毒能够经过亲
代传递到子代的种群中。这对病毒的高效利用和害虫的持续控制具有重要的理论和实践意义。
关键词: 持续控制;棉铃虫核型多角体病毒; PCR
中图分类号: S763


文献标识码: A
收稿日期: 2005
11
09
基金项目: 国家 十五 攻关项目 林木病虫害环境协调性农药及其航空喷洒技术研究 ( 2004BA509B12 )
作者简介: 曲良建 ( 1977! ) ,男,河南南阳人,硕士,主要从事昆虫病毒的基础及开发应用研究.
通讯作者: 张永安,研究员,主要从事昆虫病原微生物及害虫的可持续控制研究.
Studies on Sustainable Effects forH elicoverpa arm igera Nuclear
Polyhedrosis V irus to Host Insects
QU Liang
jian1, ZHANG Yong
an1, WANG Yu
zhu1, LANG X ing
ru2
( 1. Research Inst itu te o fForest Eco logy, Environm ent and Protect ion, CAF, Key Laboratory of Forestry Protect ion, S tate
Fores try Adm inistrat ion , B eijing
100091, Ch ina; 2. C enter S tat ion of Contro l andQ uarant ine of Fores t
D iseases and Pests , Y inchuan
750001, N ingx ia, Ch ina)
Abstract: Third instars larvae of cotton bollworm, H elicoverpa arm igera, w ere infected w ith different concentrat ions ofH eli

coverpa arm igera nucleopolyhedrov irus(H aNPV ). Survivorswere co llected respectively and reared in laboratory room. M or

ta lity rate of the larvae, average w eight of the single pupa and pupation rate w ere observed in parental generation and suc

cess ive filial generations. T he results show ed that the v irus not on ly led to death of larvae in parental and folia l generat ion,
but also mi pacted the average we ight of the s ingle pupa and pupation rate, especially to the parental and the first fo lial gen

eration. T he expermi ental data ind icated that the virus could weaken the host in folial generations, wh ich could control
popu lations o f the host for a long tmi e. M eanwhile, polymerase cha in reaction ( PCR ) amplification of po lyhedrin gene se

quences demonstrated that the viruswas present in eggs and pupaewhose parentswere infected. T hismethodm ight provide
a better understand ing of nucleopolyhedrov iruswh ich could transm it from parental generat ion to folial generation. The re

search w ould play an mi portant role in utilizing the virus effectively to control the pest persistently.
K ey words: susta inable contro;l H aNPV; polymerase chain react ion( PCR )
利用昆虫病毒防治农、林和其他经济作物害虫,
是害虫可持续控制的重要方法之一。近些年来, 随
着人们生活水平的提高和环保意识的增强, 使用和
开发高效、低毒、无公害的农药已成为发展的必然趋
势,而昆虫病毒不仅具有寄主专一性、防治效果好、
不污染环境、对其他生物安全、不使害虫产生抗药性
等优点,而且病毒还能在环境中积累,可通过外界因
子的刺激或诱发等多种途径在害虫种群中形成流行
第 2期 曲良建等: H aNPV病毒对寄主昆虫的持续作用研究
病而长期控制虫口密度,在害虫的可持续控制中发
挥着越来越重要的作用 [ 1, 2]。
核型多角体病毒 ( nuclear po lyhedrosis v irus,
NPV)对鳞翅目 ( Lep idoptera)幼虫具有很高的致病
力,是昆虫病毒种类中最具潜力者, 也是研究应用最
广泛的一类 [ 1]。但在病毒的应用和研究中, 人们更
关注的是病毒对当代寄主昆虫的直接致死作用, 而
对寄主多方面的影响和持久的作用报道很少, 尤其
对带毒昆虫持续传代研究则更少。为了探讨病毒对
寄主的持续作用, 本实验测定了寄主接种不同浓度
的病毒后对其亲代和子代的蛹质量、化蛹率及幼虫
死亡率等生物学特性参数的持续影响, 并用分子生
物学的方法对病毒进行检测, 以期为今后病毒制剂
的应用和评价, 以及病毒施用后对寄主昆虫种群动
态的影响提供理论依据。
1
材料与方法
1. 1
供试病毒与寄主
棉铃虫核型多角体病毒 (H elicoverpa arm igera
nuc lear po lyhedrosis v irus, H aNPV )由中国林科院森
林生态环境与保护研究所生物防治研究室提供, 棉
铃虫 (H elicoverpa arm igera H
bner)由中国科学院动
物所提供,在室内饲养多代后做为供试虫源。试虫
的人工饲料由北京中林恩多威生物工程技术有限公
司提供。
1. 2
HaNPV病毒的增殖和多角体的纯化
取冰箱中保存的 H aNPV病毒在显微镜下重新
计数后,取适量病毒用蒸馏水稀释到 1. 0 ∀ 107 PIB
# mL- 1浓度感染棉铃虫 3龄幼虫,收集具有典型病
毒症状的病死虫尸置冰箱中冷冻保存, 然后研磨匀
浆冷冻虫尸,加水稀释后 3层纱布过滤,经差速和蔗
糖梯度离心后双蒸水悬浮沉淀, 即为纯化的病毒多
角体。用血球计数板方法计数后贴上标签置 4 ∃ 冰
箱中保存备用。
1. 3
HaNPV病毒的生物活性测定
取适量纯化后的 H aNPV病毒分别稀释成 1. 0 ∀
10
7、1. 0 ∀ 106、1. 0 ∀ 105、1. 0 ∀ 104、1. 0 ∀ 103 PIB#
mL
- 1
5个不同的浓度, 另设一组蒸馏水对照, 每个
处理 60头, 重复 3次。具体方法参照参考文献 [ 3]。
1. 4
亲代带毒虫源的获取及传代幼虫、蛹和成虫的
管理
1. 4. 1
亲代带毒虫源的获取
用 6. 25 ∀ 103
( LC90 )、3. 44 ∀ 104 ( LC70 ) 、1. 89 ∀ 105 ( LC50 )、2. 22
∀ 106 PIB# mL- 1 ( LC30 ) 4种不同浓度的 H aNPV病
毒感染健康的 3龄棉铃虫幼虫,具体方法同 1. 3, 分
别收集不同处理后的存活幼虫即为亲代带毒虫源。
1. 4. 2
亲代及传代蛹的管理
待不同处理的亲代
幼虫化蛹 2 d后分别称蛹质量,然后放入灭菌的湿
润沙土中置 25 % 0. 5 ∃ 培养箱中 (无光照处理 )待
其羽化。各传代蛹的管理方法与此相同。
1. 4. 3
传代成虫的管理
将不同处理羽化后的成
虫分别小心移入养虫笼中饲养, 笼的顶部覆盖灭菌
纱布供其产卵, 四周悬挂蘸有营养液的棉球以便成
虫补充营养,饲养室温度控制在 25∃ % 1 ∃ , 光照 16
h,具体饲养技术见参考文献 [ 4]、[ 5]。
1. 4. 4
传代幼虫的饲养及管理
将不同处理成虫
产的卵置于透明保鲜袋中, 待幼虫孵出后用灭菌的
毛笔轻轻接入放有人工饲料的养虫瓶中,每瓶 1头,
放入人工饲料 10 g左右于培养箱中饲养至化蛹, 饲
养温度为 27 % 0. 5 ∃ ,光照 16 h。饲养过程中记录
和统计不同处理的幼虫死亡率和化蛹率。
1. 5
饲养器具及接虫工具的处理
饲养试虫的器具都进行严格消毒。具体方法
为:养虫瓶、养虫笼和做人工饲料的器皿等塑料制品
用清水洗净后放入 5%的次氯酸钠溶液中消毒 30
m in,然后再用清水冲净后晾干备用; 接虫用的小毛
笔、镊子、切刀等工具或器皿先用 5%的甲醛消毒,
然后用清水冲洗, 最后进行高温湿热灭菌。
1. 6
子代幼虫和蛹的 PCR检测
分别以子一代 ( F1 )的幼虫和蛹提取的总
DNA为模板, 根据 H aNPV病毒的多角体蛋白基
因设计特异性引物进行 PCR扩增, 并以健康虫的
总 DNA为模板为对照,对子一代蛹和幼虫体内的
H aNPV病毒进行分子检测, 具体方法和步骤见参
考文献 [ 3]。
2
结果与分析
2. 1
HaNPV的 LC50测定结果
用不同浓度的 H aNPV感染棉铃虫 3龄末幼虫,
将各浓度的幼虫最终死亡率转换成机率值后求出浓
度对数值与死亡机率值的回归方程 (表 1)。从表中
可以看出,幼虫的感染浓度与死亡率之间存在明显
的正相关关系, 即幼虫死亡率随着感染浓度的增大
而增加,该病毒株系的致死中浓度为 3. 44 ∀ 104 PIB
# mL- 1。
217
林
业
科
学
研
究 第 19卷
表 1
HaNPV对棉铃虫 3龄幼虫的生测结果分析
处理 回归方程 相关系数 LC50 / ( PIB# mL- 1 ) 95%置信限
感染浓度 Y = 1. 788+ 0. 708x 0. 990 5 34 400 20 735~ 57 108


表中 Y为死亡机率值; x为浓度对数值
2. 2
HaNPV的 LT50测定结果
棉铃虫幼虫感染病毒后, 幼虫感染天数与死亡
率的关系见图 1,不同浓度的半致死时间见表 2。从
图 1中可以看出,幼虫被感染的浓度越高, 开始死亡
的时间越早,死亡高峰主要集中在感染后第 5~ 6 d,
且随着感染浓度的降低,死亡高峰有向后推迟的趋
势;不同处理的半致死时间也随着感染浓度的降低
而延长,当感染浓度为 1. 0 ∀ 107 PIB # mL- 1时, 其
半致死时间为 4. 77 d, 1. 0 ∀ 105 PIB# mL- 1时,半致
死时间延长为 6. 63 d。
图 1
不同浓度对棉铃虫幼虫的
感染时间与死亡率关系图
表 2
不同浓度 HaNPV感染棉
铃虫 3龄末幼虫的 LT50
处理浓度 /
( PIB# mL- 1 ) 回归方程
LT50 /
d
95%置信限
1. 0∀ 107 Y = 0. 259 4x - 0. 738 3 4. 77 2. 09~ 7. 15
1. 0∀ 106 Y = 0. 180 5x - 0. 534 3 5. 73 3. 65~ 7. 61
1. 0∀ 105 Y = 0. 138 6x - 0. 418 7 6. 63 4. 81~ 8. 45


表中 Y为死亡机率值; x为浓度对数值
2. 3
HaNPV对寄主持续作用的研究结果
根据 2. 1中的回归方程, 可求出使 3龄末棉
铃虫幼虫死亡 90%、70%、50% 和 30% 的理论浓
度依次为 2. 22 ∀ 106 ( LC90 )、1. 89 ∀ 105 ( LC70 )、
3. 44 ∀ 104 ( LC50 )、6. 25 ∀ 103 P IB # mL- 1
( LC30 )。用上述浓度分别感染 3龄末棉铃虫幼
虫, 统计幼虫死亡率、化蛹率和蛹质量, 并分别收
集不同浓度感染未致死幼虫的蛹进行传代饲养,
实验结果见表 3和表 4。
表 3看出, 幼虫死亡率和预期理论结果基本
吻合。亲代被感染后, 幼虫死亡率和化蛹率随着
感染浓度的增加而降低, 蛹的平均质量以处理
3 44 ∀ 104 PIB# mL- 1 ( LC5 0 )最小, 为 199. 6 mg,
远远低于对照的 266. 0 mg。各处理在幼虫死亡
率、化蛹率和蛹质量等方面均与对照存在极显著
差异, 这表明病毒对亲代寄主的作用明显。
表 3
亲代 ( F0 )被感染后的试验结果
处理
/ ( PIB# mL- 1 )
试虫
数 /头
死亡
数 /头
死亡
率 /%
平均单头
蛹质量 /m g
化蛹
率 /%
LC90 540 495 91. 67
* * 235. 6* * 45. 14* *
LC70 360 263 73. 06
* * 241. 3* * 61. 37* *
LC50 180 89 49. 44
* * 199. 6* * 87. 36*
LC30 180 59 32. 77
* * 260. 0* * 87. 05*
CK 120 7 5. 83 303. 6 96. 63


注: * * 与对照差异极显著, P < 0. 01; * 与对照差异显著, P <
0. 05,下同。
表 4
子代垂直传递的试验结果
传递
代数
处理 /
( PIB # mL- 1 )
试虫
数 /头
幼虫
死亡率 /%
平均单头
蛹质量 /m g
化蛹
率 /%
LC70 240 50. 42
* * 255. 4* * 72. 28* *
子一代 LC50 240 47. 95* * 242. 9* * 77. 31* *
( F1 ) LC30 180 34. 44* * 282. 6 79. 49* *
CK 120 8. 33 299. 2 93. 09
LC70 240 15. 00* * 245. 8* * 93. 09
子二代 LC50 240 21. 67* * 231. 2* * 96. 01
( F2 ) LC30 180 12. 22* * 271. 8 96. 34
CK 120 7. 50 272. 4 96. 50
LC70 240 4. 16 267. 1 92. 52
子三代 LC50 240 9. 58 261. 1* 93. 07
( F3 ) LC30 180 17. 78
* * 276. 3 90. 00
CK 120 8. 33 280. 6 97. 50
LC70 240 6. 67 256. 9 93. 24
子四代 LC50 240 4. 17 255. 2 91. 68
( F4 ) LC30 180 4. 44 256. 3 90. 89
CK 120 6. 67 255. 2 93. 94
218
第 2期 曲良建等: H aNPV病毒对寄主昆虫的持续作用研究


表 4表明,病毒对子代寄主昆虫化蛹后蛹质量、
化蛹率和幼虫死亡率等的影响总体上是随着传递代
数的增加而减弱的,结果如下:
子一代 ( F1 )寄主的幼虫死亡率随着感染浓度的
增加而增大, 最高死亡率为 50. 42% , 最低为
3444%, 但均远高于对照的 8. 33%。在蛹质量方
面,除对照 ( 299. 2 mg)比亲代 ( 303. 6 mg)略有下降
外,其他各处理与亲代相比均有不同程度的提高, 仍
以 LC50最小, 为 242. 9 mg, 明显低于对照的 299. 2
mg,但处理 LC30 ( 282. 6 mg )与对照却无明显差异。
在化蛹率方面,各处理与对照之间差异极显著,均明
显低于对照的 93. 09%。需要说明的是处理 LC90由
于亲代感染后残存的个体数较少, 再加上其化蛹率
和成虫的产卵量低而导致不能正常传代。
子二代 ( F2 )中各处理的幼虫死亡率均明显
低于 F1 代 , 最高为 21. 67% ( LC5 0 ) , 最 低为
12 22% , 但仍都明显高于对照的 7. 50%。在平
均单头蛹质量方面, 处理 LC70和 LC50与对照差异
极显著, 处理 LC30与对照无明显差异, 各处理中
仍以 LC5 0最小, 为 231. 2 m g。在幼虫化蛹率方
面, 各处理与对照已无明显差异。
在子三代 ( F3 )中, 除了处理 LC30的幼虫死亡率
( 17. 78% )和 LC50的平均单头蛹质量 ( 261. 1 mg )与
对照存在显著差异外,其他与对照均无明显差异。
在子四代 ( F4 )中,各处理与对照在幼虫死亡率、
平均单头蛹质量和幼虫化蛹率方面均无明显的差
异。值得注意的是,各处理在蛹质量、幼虫死亡率和
化蛹率等方面与对照无差异时, 并不等于病毒对寄
主不起作用。许多研究表明, 病毒是以某种未知的
或亚致死剂量方式存在昆虫体内, 等待环境或外界
中某些条件的刺激或诱发而导致病毒病的发生和流
行,因此,从某种意义上讲, 亚致死剂量的感染更有
意义 [ 9]
2. 4
对子一代 ( F1 )虫卵和蛹的 PCR检测结果
以子一代 ( F1 )棉铃虫卵、蛹的总 DNA为模板进
行 PCR扩增,扩增产物经 1. 2%琼脂糖电泳检测, 在
接近 400 bp处有一条明显的扩增带 (图 3)。对扩增
产物的克隆和测序证实片断大小为 389 bp (图 4) ,
与设计的大小完全一致。通过 BLASTN进行序列同
源性比较发现, 所测序列与中国科学院武汉病毒研
究所陈新文 [ 10]等的报道完全一致。所测的 389 bp
中仅有 1 bp不同,从而证明了扩增片断是棉铃虫核
型多角体病毒的多角体蛋白基因。
图 3
PCR扩增结果
M: M arker 1:卵
2:蛹
3:健康
5
GTTAAGCCCGACACAATGAAGCTTGTAGTTAA
CTGGAGCGGTCGCGAATTTCTTCGCGAAACTTGGA
CGCGTTTCATGGAAGACAGTTTTCCCATTGTAGACG
ACCAAGAAATTATGGACGTGTTTCTGTCTGTTAATA
TGCGACCAACCAAACCGAACCGTTGTTACCGATTC
TTAGCGCAACACGCTCTGCGTTGTGATCCCGACTA
TATTCCTCACGAAGTCATTCGTATTGTAGAACCTTC
CTATGTAGGCAGTAACAACGAGTACAGAATTAGTT
TAGCCAAAAAATACGGCGGTTGTCCCGTTATGAACT
TGCACGCTGAATACACTAATTCCTTTGAAGATTTCAT
TACCAACGTAATTTGGGAGAACTTTTACAAACCAAT
3
图 4
H aNPV多角体蛋白基因 PCR扩增片段的测序结果

3
结论和讨论
( 1) 对 HaNPV的毒力测定结果表明该病毒株
系的毒力较高,以 3龄末的棉铃虫为试虫, 其 LC50为
3. 44 ∀ 104 PIB# mL- 1; LT50随着感染浓度的增大而
减小,当感染浓度为 1. 0 ∀ 107 PIB # mL- 1时, 其半
致死时间为 4. 77 d,当感染浓度为 1. 0 ∀ 105 PIB#
mL
- 1时,半致死时间延长为 6. 63 d。采用人工饲料
代替天然饲料的办法来测定病毒株系的毒力, 具有
简单易行、便于操作等优点,而且可避免其它不稳定
因素的干扰, 但由于人工饲料块太小容易干燥而影
响供试幼虫的取食, 最终将影响结果的可靠性, 因
此,采用该方法时,一定要让试虫经过预饥饿处理并
适当延长虫龄, 使试虫尽可能在短的时间内取食完
饲料,从而获得准确可信的结果。
( 2) 亲代被感染后, F1代中各处理的幼虫死亡
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林
业
科
学
研
究 第 19卷
率非常明显 ( 34. 44% ~ 50. 42% )且随着最初感染浓
度的增大而增加。在 F2代中,处理 LC50的幼虫死亡
率最大 ( 21. 67% ), 而 F3代中则以低浓度处理 LC30
的幼虫死亡率最大 ( 17. 78% ), F4代中各处理和对
照差异不显著。由此可见, 以高浓度的病毒防治害
虫,可有效降低亲代和 F1代的虫口密度但不利于病
毒在种群中的持续扩散,而低浓度的处理虽有利于
病毒的持久传递却不能有效控制当代的虫口密度,
因此在重要食叶害虫的综合治理中, 可考虑采用既
能有效降低当代虫口密度、又有利于病毒持久传递
的适宜浓度,这样既节约了成本,又有利于保持生态
系统的稳定性。
( 3) 在蛹质量方面,以处理 LC50最为明显,在继
F0代后的连续三代中均明显低于对照,高浓度的处
理 LC70只有在 F1和 F2代中明显低于对照, 而低浓
度的处理 ( LC30 )对子代的蛹质量则没有影响。席景
会等 [ 10]在研究八字地老虎核型多角体病毒 (Amathes
c
n igrum nuc lear po lyhedrosis virus, AnNPV )对寄主昆
虫繁殖潜势的影响中发现, 雌蛹质量和成虫的产卵
量有显著的相关性,蛹质量越低,成虫卵量越少。至
于蛹质量和羽化率是否有关, 在蛹质量方面是否存
在某个临界值,只有高于该阈值的蛹才能正常羽化,
而低于该数值则不能羽化, 以及寄主接毒后对子代
成虫的飞翔能力是否有影响等, 这些问题仍有待于
进一步研究验证。
( 4) 从化蛹率方面看,亲代和 F1代中各处理与
对照差异显著, 尤其是亲代的高浓度处理与对照差
异极显著,但其他各代则与对照无显著差异;与幼虫
死亡率、蛹质量参数相比,病毒对寄主化蛹率的持久
影响相对较小。
( 5) 在试虫的传代饲养过程中, 并没有发现病
毒流行病的大发生而导致传代失败, 因此可以说明,
病毒的垂直传递仅是流行病发生条件之一。
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