全 文 ：收稿日期: 20021219
基金项目: 国家林业部指南项目 竹类植物遗传多样性研究和遗传连锁图谱的构建 (项目编号 190)
作者简介: 邢新婷( 1972 ) ,女,河北藁城人,博士生.
林业科学研究 ! 2003, 16( 5) : 554~ 559
Forest Research
! ! 文章编号: 10011498( 2003) 05055406
麻竹 RAPD反应条件的优化
邢新婷, 傅懋毅
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 ! 311400)
摘要: 以麻竹 DNA 为模板, 对影响麻竹 RAPD 扩增的重要参数进行了优化试验 ,以期建立麻竹 RAPD
反应的最适体系。最终得出的麻竹 RAPD反应体系为: 20 L 反应体系, 2L 10倍反应缓冲液,模板含
量为 50 ng, 25 mmol∀L- 1的 Mg2+ , 15 U的Taq 酶, dNTP为 175 mmol∀L- 1, 引物浓度为 04mol∀L- 1。
优化后的 RAPD反应程序为: 94 # 3 min∃ [ 94 # 1 min∃ 375 # 1 min∃ 72 # 1 min 20 sec] 40 个循环
∃ 72 # 8 min∃ 4 # 保持。
关键词: 麻竹; DNA; RAPD; PCR;优化
中图分类号: S7959 ! ! ! 文献标识码: A
麻竹( Dendrocalamus latif lorus Munro)是我国主要笋材两用竹种之一,分布在福建、台湾、广
东、海南、广西、贵州、云南等省。麻竹笋期长、产量高、笋味美,是夏秋季的优良蔬菜。在福建、
广东南部和台湾溪流两岸、村旁、路旁排水良好的沃土上, 麻竹的笋用林相当普遍。经过长期
栽培经营, 形成了许多栽培类型,这些栽培类型该如何区分,不同栽培类型之间的遗传变异与
产量是否相关有待研究。
目前在林木遗传研究中, RAPD标记是使用最广泛的一种分子标记。根据竹子的分子生
物学研究基础, 可供选择的主要为没有种属特异性、可通用的分子标记技术, 如 RAPD和AFLP
等。Gielis等[ 1]对刚竹属( Phyllostachys )的竹种进行了 RAPD分析, Lao 等[ 2]将 RAPDPCR技术
应用于台湾重要经济竹种的无性系鉴定及遗传分析上, Loh等[ 3]利用 AFLP 技术对 15个竹种
的遗传变异和种的相互关系作了有益的尝试。方伟等[ 4]、师丽华等[ 5]分别对雷竹 ( Phyl
lostachys praecox CD Chu et CS Chao ) 不同栽培类型和毛竹 ( Phyllostachys heterocycla
varpubescens (Mazel) Ohwi)种下等级变型或栽培类型进行了 RAPD研究,李淑娴等[ 6]尝试利用
水稻( Oryza sativa L. )微卫星( SSR)引物对竹子分子系统学进行研究,而对于南方诸省普遍栽
培的笋材两用丛生经济竹种麻竹的分子标记研究还未见报道。
RAPD标记技术虽然原理简单,操作方便,但随着 PCR条件的变化,会出现不同的扩增结
果,且一些实验也发现 RAPD反应的不稳定性[ 7]。这些问题可以通过控制实验条件而加以避
免[ 8]。本研究对麻竹 DNA的RAPD反应条件优化作一探讨,以期建立麻竹 RAPD反应的稳定
体系,为从分子水平深入研究麻竹不同地理群体的亲缘关系、遗传多样性和无性系鉴定提供技
术手段。
1 ! 材料与方法
11 ! 实验材料
供试麻竹材料取自福建连江、泉州、南靖,
广东揭东、清新、广宁、封开, 广西凭祥、田林,
贵州兴义,云南弥勒,共计 11个地点 155丛野
生麻竹叶片(见表 1)。每一丛各取 10 g 新鲜
嫩叶片,除去灰尘等杂物和水分, 然后密封于
干燥硅胶瓶中带回实验室备用。
12 ! 实验方法
121 ! 麻竹 DNA 提取 ! 采用 SDS 方法提取
DNA。称取麻竹干叶片15 g于预冷研钵中 ,
表 1 ! 麻竹材料来源
采集地点 胸径/ cm 秆长/m 采集数量/丛
福建连江
福建泉州
福建南靖
广东揭东
广东清新
广东广宁
广东封开
广西凭祥
广西田林
贵州兴义
云南弥勒
870
973
667
769
724
847
880
1158
1103
938
1013
1192
1475
1030
1262
1129
1546
1301
1774
1734
1382
1414
15
10
12
15
15
15
15
13
15
15
15
加入液N迅速磨成粉末, 装入 100 mL 离心管内, 加入提取缓冲液( 1 000 mmol∀L- 1TrisHCl, 50
mmol∀L- 1EDTA, w= 15%SDS,w= 1%C2H5SH, w= 2%PVP) 20 mL, 65 # 水浴保温提取至少 2
h,提取过程中摇动数次。取出后加入 20 mL 氯仿%异戊醇( 24%1)抽提液,在震荡器上振荡 20
min(混匀) , 4 000 r∀min- 1离心15 min,吸取上清液,加入等体积预冷异丙醇缓缓摇匀,置冰箱内
冷藏过夜,次日用玻璃钩捞出絮状沉淀物, 用 70%乙醇冲洗, 晾干放入装有 2 mL 1 倍TE( 10
mmol∀L- 1 TrisHCl, 1 mmol∀L- 1EDTA, pH 80)溶液的 10 mL 离心管, 待完全溶解后加入等体积
的氯仿%异戊醇( 24%1) , 摇匀后, 3 000 r∀min- 1离心10 min。吸取上清液,加入 1/ 10体积的 3mol
∀L- 1乙酸钠溶液, 2倍体积的无水乙醇,摇匀并置冰箱中过夜。捞出沉淀晾干, 放入 3 mL 离心
管内,加入适量 1倍TE使之完全溶解。
122 ! DNA纯度检测方法 ! 取 15 L 左右 DNA溶液,加入 5 L 溴酚蓝混匀后, 在 15%的琼
酯糖凝胶上加入样品,于 5 V∀cm- 1下电泳, EB染色, 利用 FR200紫外可见分析成像系统观察
拍照,记录 DNA降解和 RNA消化情况。
取100 L DNA 溶液, 用 1倍 TE 稀释 20 倍, 用日本岛津 UV2401PC 紫外分光光度计在
260、280 nm处测定光吸收值, 若 OD260/ OD280&17~ 18时, 即表明DNA纯度符合要求。
DNA质量浓度计算: DNA质量浓度(g∀mL- 1) = OD260 ∋ 50 ∋稀释倍数
DNA提取率(g∀g- 1) = DNA浓度∋ 体积/取材量( g)
123 ! RAPD条件优化 ! 退火温度:为了确定最佳的退火温度,设 350、355、360、365、370、
375、380、385、390、395、400、420、450、480、500、550 # 共 16个退火温度值。
Mg
2+ 浓度: Mg2+ 浓度是影响 PCR 反应的重要因子, 设定 15、20、25、30、35、40
mmol∀L- 1 6个浓度梯度。
Taq酶的含量:为确定Taq酶最佳含量, 设定 7个用量: 060、075、090、105、120、135、
150 U。
dNTP的浓度: 050、075、100、125、150、175、200、225、250、275 mmol∀L- 110个浓度。
不同的引物浓度: 分别设定为 0075、0100、0125、0150、0175、0200、0250、0300、
0350、0400、0450、0500 mol∀L- 1。
DNA模板含量: 设定每反应体系中分别加入 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、
555第 5 期 邢新婷等:麻竹 RAPD反应条件的优化
90、100、110、120 ng的梯度来确定DNA模板用量。
上述 PCR反应体系为20 L, PCR反应在GeneAmp PCR System PE9600 DNA扩增仪上进行。
反应程序为: 94 # 3 min∃ [ 94 # 1 min∃ ( 35~ 55 # ) 1 min ∃72 # 1 min 20 sec] 40个循环 ∃72
# 8 min ∃4 # 保持。
2 ! 结果与分析
21 ! DNA纯度的检测
图 1 ! 部分模板电泳检测
211 ! DNA 提取物凝胶电泳检测 ! 对 11个地点提取
的DNA随机进行电泳检测, 其琼脂糖凝胶电泳图谱如
图1所示。本实验所提取的 DNA成白色絮状沉淀,电泳
显示 DNA模板有一定的降解, 且含有一定量的杂质,如
RNA,这可以通过使用 RNA 降解酶除去, 但亦可进行
RAPD分析,因在大多数RAPD反应中,对DNA模板的要
求并不十分严格,这与Wilkie 等[ 9]对葱属的研究和彭锁
堂等[ 10]对水稻的研究结果一致。
212 ! DNA提取物质量的比较 ! 从实
验结果(表 2) 可以看出, DNA 在紫外波
长260 nm 和 280 nm处的光吸收值比值
基本都在 18~ 20 之间,可以直接用来
做 RAPD 分析。DNA 提取率变动在
8238~ 1 4480 gg- 1之间,提取率还是
很高的。
22 ! 麻竹 RAPD反应条件的优化
221 ! 不同退火温度对麻竹 RAPD的
影响 ! 在 PCR循环条件中,以退火温度
最为重要。本实验从 35~ 55 # 分别设
定了 16个退火温度,利用两个引物分别
表 2 ! SDS法提取麻竹 DNA 的质量
采集地点 A260 A280 A260/ A280 DNA 浓度/
(g∀mL- 1)
DNA提取率/
(g∀g- 1)
福建连江
福建泉州
福建南靖
广东揭东
广东清新
广东广宁
广东封开
广西凭祥
广西田林
贵州兴义
云南弥勒
2117
2172
1825
1780
1531
1236
1243
1456
1606
1269
1908
1101
1126
0945
0997
0857
0683
0676
0792
0863
0715
1046
192
193
192
178
179
180
183
184
186
178
183
2 11711
2 17203
1 82502
1 77951
1 53080
1 23576
1 24316
1 45647
1 60599
1 26921
1 90792
1 4114
1 4480
1 2167
1 1863
1 0205
! 8238
! 8288
! 9710
1 0707
! 8461
1 2719
对麻竹叶片DNA进行RAPD扩增。结果见图 2、3。可见2个引物在 36~ 375 # 之间扩增的条
带较多,在 375 # 时扩增效果最好,条带清晰, 多态性丰富,重复性好。
图 2 ! 退火温度优化(引物 S76)
556 林 ! 业 ! 科 ! 学 ! 研 ! 究 第 16卷
图 3 ! 退火温度优化(引物! S88)
222 ! Mg2+ 浓度的影响 ! PCR反应体系中 2价阳离子的存在至关重要,其中 Mg2+ 浓度对反
应的特异性和 PCR产率影响较大。本实验设定了 6个浓度梯度, 结果发现(图 4) ,从 15 mmol
∀L- 1到 40 mmol∀L- 1扩增结果基本一致, 但在浓度为 25 mmol∀L- 1时扩增的最好。
223 ! 随机引物浓度的影响 ! 随机引物是 PCR反应中的影响因素。本实验设置了 12个浓度
梯度,结果如图 5。随着引物浓度的提高特异性增加, 但当浓度超过 045 mol∀L- 1时特异性又
降低,引物浓度在 040 mol∀L- 1时扩增条带较清晰, 确定为本实验的最佳浓度。
图 5 ! 引物浓度的优化图 4 ! Mg2+浓度优化
224 ! DNA模板含量的影响 ! DNA 模板含量是 PCR扩增的重要影响因素, 含量过高会出现
非特异性扩增,过低则得不到所需的扩增产物。从图 6可以看出, DNA含量在一个较大的范
围内均能扩增出清晰的条带,说明对于麻竹来说模板含量对扩增结果影响不大, 微量的 DNA
便可扩增,为了保证每个模板均能扩增出清晰的条带, 参考普遍用量( 25 L 反应体积中有 50
ng) ,根据本实验结果,每个反应体系以加 50 ng 为宜。
图 6 ! DNA模板含量的优化(M为标准 DNA 即Marker)
225 ! dNTP浓度的影响 ! dNTP 作为 PCR反应的原料, 其量的多少直接影响产物的多少。实
557第 5 期 邢新婷等:麻竹 RAPD反应条件的优化
验结果(图 7)表明, 随着 dNTP浓度的提高, 扩增条带数和亮度增加,但扩增效果几乎没有明显
差异, 说明在麻竹 PCR反应中 dNTP不是一个非常重要的因素,考虑满足 PCR要求与经济成
本,本实验选定 175 mmol∀L- 1为较佳浓度。
图 8 ! Taq酶含量对扩增的影响图 7 ! dNTP 浓度的优化
226 ! Taq酶含量的影响 ! Taq酶的种类和含量会影响 PCR扩增反应。本实验设置了 060,
075, 090, 105, 120, 135, 150 U共6个梯度, 从图8中可以看出, 随着Taq酶含量的提高,扩
增条带亮度增强,在 15U 时带型较丰富,条带也较清晰。
3 ! 结论与讨论
尽管 RAPD对模板 DNA质量要求不高,但高质量DNA是实验结果可靠并具有良好重复性
的保证。一般的 SDS法、CTAB法制备的 DNA 均可满足实验要求,但在 DNA制备过程中需防
止样品间的交叉污染。本实验提取的 DNA有少量的降解,可能原因是在干燥过程中叶片内一
些成分发生变化造成的, 建议有条件可以尝试新鲜叶片来提取 DNA或着进行限制酶酶切,另
外还可以考虑采用 CTAB法。
模板浓度是 PCR反应的一个制约因子, 其浓度过低扩增产物无或不稳定, 其浓度过高会
相应增加非专一性扩增产物。本实验每一反应体系中 DNA 模板含量在 10~ 120 ng 范围内均
扩增出清晰条带,说明麻竹模板含量的高低在相当大的范围内不会影响 RAPD反应结果。引
物浓度低时,与模板碰撞机会减少, 不足以扩增出供EB染色的 DNA,引物浓度过高时,又会引
起错配,因此应根据需要加入适量为好。Mg2+ 是Taq酶不可缺少的辅助因子, 它不仅影响Taq
酶的活性, 还会影响引物与DNA模板的结合效率、模板与 PCR产物的解链温度以及产物的特
异性和引物二聚体的形成[ 11]。如果 Mg2+ 不足时, Taq酶作用效率低, 产物减少;而过量的Taq
酶,会使非特异性扩增产物增加,出现带纹模糊现象,本实验结果表明Mg2+ 在 25 mmol∀L- 1时
扩增最好, 带型没有变化。dNTP 是合成 DNA的原料[ 12] ,其浓度可以略高一些, 保证 PCR扩增
反应的完全,因在浓度低于 125 mmol∀L- 1时可以看出扩增的条带明显减少。
退火温度在 PCR扩增程序中是最重要的影响因素,本实验采用单引物对设定的 16个退
火温度进行了重复扩增, 同一引物扩增的结果是一致的, 而且不同的引物均在 375 # 时扩增
效果最好,具有一定的稳定性,因此将该温度作为最佳的退火温度;温度超过 40 # 时特异性降
低,在 55 # 时均未扩增出条带,说明较高的温度不适合进行麻竹 PCR的扩增。由于 PCR扩增
程序也受到变性温度、延伸温度和相应时间的影响,应该同时对这些条件进行进一步的摸索。
本实验采用单引物进行 PCR扩增,可以获得较好的结果, 在预实验中曾采用双引物进行
558 林 ! 业 ! 科 ! 学 ! 研 ! 究 第 16卷
了重复扩增,但结果较差。以本实验建立的 PCR 扩增程序及反应体系进行麻竹引物筛选和扩
增,可以有较高的稳定性。
参考文献:
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Study on the Optimization of RAPD Conditions of
Dendrocalamus latif lorus Munro
XING Xinting, FU Maoyi
( Research Institute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang! 311400,Zhejiang, China)
Abstract:Based on the genomic DNA of Dendrocalamus latif lorus, some essential factors that might affect the re
sults of RAPD were compared and the optimal RAPD reaction system for D. latif lorus was established. The opti
mized condition for 20L reaction system were 2 L 10 diploid buffer, 50 ng templateDNA, 25 mmol∀L- 1Mg
Cl2 , 15 U Taq DNA polymerase, 175 mmol∀L- 1dNTP and 04 mol∀L- 1Random primer. The optimized reac
tion program was initially at 94 # for 3 min, followed by 40 cycles at 94 # for 1 min, at 375 # for 1 min,
at 72 # for 1 min 20 sec, and then held at 72 # for 8 min, and finally kept at 4 # .
Key words:Dendrocalamus latif lorus; DNA; RAPD; PCR; optimization
559第 5 期 邢新婷等:麻竹 RAPD反应条件的优化