全 文 ：林业科学研究 2009, 22( 5): 672~ 676
F orest R esearch
文章编号: 10011498( 2009) 05067205
落叶松扦插生根过程抑制消减杂交文库构建及分析
冯 健 1, 2, 齐力旺1, 孙晓梅1, 韩素英 3, 张守攻 1*
( 1. 中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室,北京 100091;
2.辽宁林业科学研究院, 辽宁沈阳 110032; 3.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091)
摘要:以落叶松扦插生根率存在显著差异的 2个全同胞优良无性系茎和根为材料,应用抑制消减杂交技术构建了扦
插生根过程中 2个差异表达 cDNA文库,酶切效率检测、连接效率检测、差减效率检测结果表明: 这 2个落叶松扦插
生根过程差异表达 cDNA文库构建成功。利用 PCR扩增和点杂交试验筛选阳性克隆, 将阳性克隆测序,并经生物信
息学分析,最终获得 521个 Un iEST。
关键词:落叶松; 抑制消减杂交文库;扦插
中图分类号: S791. 22 文献标识码: A
收稿日期: 20080307
基金项目: 国家 863 计划 高产优质多抗林木花草分子与细胞高效育种技术及品种创制 ( 2006AA100109 ) 和国家转基因与产业化专
项 优质、杂种落叶松抗旱基因工程育种研究 ( J2002B005)
作者简介: 冯健 ( 1978! ) ,男,辽宁沈阳人,博士,主要从事林木生物技术和微生物生态学研究.
* 通讯作者
Construction and Analysis of the Suppression Subtractive
Hybridization L ibrary ofLarix Cuttings during Rooting
FENG J ian
1, 2
, QI L iwang 1, SUN X iaom ei1, HAN Suy ing3, ZHANG Shougong1
( 1. Group of Trees Cell B iology, Research Inst itu te of Forestry, CAF, B eijing 100091, Ch ina; 2. Liaon ing A cademy of Forestry,
Shenyang 110032, L iaon ing, Ch ina; 3. Research Inst itu te o fForest Eco logy, Environm ent and Protect ion, CAF, Beijing 100091, Ch ina)
Abstract: Taking the stem s and roots of tw o fu llsib clones w ith significant d ifference in roo ting rate as test
materials, tw o differential expression cDNA librar ies o f Larix cutting during root ing w ere established by PCR
se lect
TM
cDNA subtract ion k i.t The resu lts of analysis of Rsa I d igest ion, ligat ion and subtraction eff iciency show ed
tha t the tw o libraries w ere established successfully. The posit ive clones w ere screened by PCR and dot blots. 521
UniEST w ere obta ined by sequenc ing and b io informat ics ana lysis.
Key words: Larix; suppression subtract ive hybrid izat ion library; cutting
落叶松 (Larix spp. )是落叶松属植物, 为我国北
方主要造林树种之一。扦插作为林木良种选育和优
良品种扩繁的重要技术手段,同样适用于落叶松育
种工作。由于落叶松扦插生根率低, 且不同无性系
间生根率存在明显差异等问题,严重制约了落叶松
的育种繁育工作。先前的研究多是从解剖学和生理
学角度探讨落叶松生根问题, 如,落叶松扦插生根的
部位、内外源激素对落叶松扦插生根的影响、插穗部
位及母树年龄对扦插生根率的影响等; 从基因水平
探讨落叶松扦插生根问题还未见报道 [ 1- 5]。探讨落
叶松扦插生根的分子机理,提高落叶松扦插生根率
对于落叶松遗传改良具有重要意义。为获得落叶松
扦插生根过程中差异表达基因, 本实验选择了抑制
消减 杂交 ( Suppression Subtractive H ybridization,
SSH )技术 [ 6- 12 ] ,构建落叶松扦插生根过程差异表达
cDNA文库, 并对文库进行了初步分析。
第 5期 冯 健等:落叶松扦插生根过程抑制消减杂交文库构建及分析
1 材料与方法
1. 1 材料
本试验所用材料均取自辽宁大孤家国营林场,
为杂种落叶松 (日永 85 ∀长 4C ) 31- 6和 15 - 4两
个全同胞无性系, 其中无性系 31 - 6的生根率 >
90% ,无性系 15 - 4的生根率 < 20%。取材分 3个
时期,分别为插穗茎段、插穗形成愈伤组织且有根原
基形成、不定根生长初期。取材后迅速液氮冷冻,带
回实验室后 - 70 # 保存。在文库构建时, A库以无
性系 31- 6三个时期总 RNA等量混合合成 cDNA
为 Tester; B库以无性系 15 - 4三个时期总 RNA等
量混合合成 cDNA为 Tester。
1. 2 试剂
O ligotex mRNA SpinCo lumn Protoco l( For iso la
tion o f poly
A +
mRNA from total RNA )购自 Q iagen公
司; C lon tech PCRSelectTM cDNA Sub traction K it购自
C lontech公司; Teasy载体购自 Promega公司; DH5
和 Taq DNA聚合酶购自天根生化科技 (北京 )有限
公司。D IG H igh Prim e DNA Labeling and Detection
StarterK it∃ 购自 Roche公司。其它试剂为国产分
析纯试剂。
1. 3 方法
1. 3. 1 落叶松 mRNA分离 总 RNA提取参照 Da
v id L等 [ 6]的方法并作适当修改; mRNA分离纯化采
用 Q iagen mRNA分离试剂盒提供的方法。获得的
总 RNA和 mRNA用 1%琼脂糖凝胶检测质量,同时
用紫外分光光度计测定 OD260和 OD280的值进一步检
测质量,并计算含量。
1. 3. 2 抑制消减杂交文库构建 获得足量 mRNA
后, 按照 C lontech PCRSe lectTM cDNA Subtract ion K it
操作手册获得 cDNA片段。获得的 cDNA片段与
Teasy载体连接; 然后转化大肠杆菌菌株 DH5, 构
建落叶松抑制消减杂交文库。细菌培养参考 %分子
克隆实验指南 &[ 13]的方法进行。
1. 3. 3 PCR检测阳性菌落和点杂交试验 经过蓝
白斑筛选后, 挑取白色菌落摇菌, 并用 PCR扩增检
测是否含有插入片段, PCR所用引物为抑制消减杂
交试剂盒所用的 Nested PCR primer 1和 N ested PCR
primer 2R, 反应体系为细菌菌液 1. 0 L, 10 ∀ PCR
反应缓冲液 2. 5 L, dNTP( 10 mmol∋ L- 1 ) 1. 0 L,
Nested PCR primer 1和 N ested PCR primer 2R各 1. 0
L, Taq DNA聚合酶 0. 5 L, 无菌水 18. 0 L,合计
25 L。反应循环参数为 94 # 预变性 3 m in; 94 #
变性 10 s, 68 # 退火 30 s, 72 # 延伸 1m in, 35个
循环; 72 # 延伸 10m in; 4 # 保存。
N ested PCR pr imer 1: 5(TCGAGCGGCCGC
CCGGGCAGGT3(
N ested PCR pr imer 2R: 5(AGCGTGGTCGCGGC
CGAGGT3(
经 PCR检测为阳性的菌落进一步进行点杂交
检测,探针为文库构建中第 2轮 PCR产物, 操作步
骤按 DIG H igh Prime DNA Labeling and Detection
StarterK it∃操作手册提供的方法进行。
1. 3. 4 生物信息学分析 采用 NCB I的 BLAST软
件对所测序列与 GenBank中的非冗余数据库 ( non
redundant database, NR )比对。
2 结果与分析
2. 1 mRNA分离和检测
从试验结果 (图 1)看:经 1%琼脂糖凝胶电泳法
检测, 28S和 18S条带清楚, 且 28S亮度基本上是
18S亮度的 1. 5~ 2. 0倍; 同时, 无其它杂带。经分
光光度计检测,所有样品的 D260 /D280值均为 1. 8~ 2.
1,表明 RNA样品含酚类物质和蛋白质等杂质少。
利用 mRNA纯化试剂盒,分离纯化 2个总 RNA混合
物,获得 mRNA,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,呈现弥
散条带,且看不到 28S和 18S两条主带,表明所获得
mRNA质量较高,完全符合 cDNA合成要求。
图 1 总 RNA电泳质量检测
2. 2 抑制消减杂交及质量分析
抑制消减杂交主要过程包括双链 cDNA合成、
R sa∃酶酶切、接头连接、2轮杂交和 2轮 PCR。为了
监测抑制消减杂交的效果,需要对主要过程进行检
验,以最终确定文库构建质量。主要建库过程和监
控结果见图 2~ 5。
673
林 业 科 学 研 究 第 22卷
M: 1Kb DNA Ladder; 1: R sa∃酶酶切前落叶松无性系 31- 6双链
cDNA; 2: R sa∃酶酶切后落叶松无性系 31- 6双链 cDNA; 3: R sa
∃酶酶切前落叶松无性 15- 4双链 cDNA; 4: R sa∃酶酶切后落
叶松无性系 15- 4双链 cDNA
图 2 R sa∃酶切分析
M: 1KbDNA Ladder; 1、3:以 act in特异引物和接头引物为引物
组扩增产物; 2、4:以一对 act in特异引物为引物组扩增产物
图 3 接头连接效率检测
M: 1Kb DNA Ladder; 1:正向差减 cDNA第 1轮 PCR产物; 2:正
向未差减 cDNA第 1轮 PCR产物; 3:反向差减 cDNA 第 1轮
PCR产物; 4:反向未差减 cDNA第 1轮 PCR产物; 5: 正向差减
cDNA第 2轮 PCR产物; 6:正向未差减 cDNA第 2轮 PCR产物;
7: 反向差减 cDNA第 2轮 PCR产物; 8:反向未差减 cDNA第 2轮
PCR产物
图 4 PCR产物分析
M: 1Kb DNA Ladde; 1 ~ 4:以 A库双链 cDNA片段为模板, 18、
23、28和 33个循环时 PCR产物; 5 ~ 8:以正向未差减双链 cDNA
片段为模板, 18、23、28和 33个循环时 PCR产物
图 5 差减效率检测
图 2所示: 反转录后的双链 cDNA呈现一个很
好的弥散谱带, 经过 R sa∃酶完全酶切后, 双链 cD
NA片段大小在 500 bp左右, 这表明 mRNA反转录
为双链 cDNA和 R sa∃酶酶切都获得比较满意的结
果。接头连接效率分析试验表明 (图 3) : 以 actin
内部特异引物和接头引物组成的引物组扩增产物亮
度是以 actin 2个特异引物为引物组扩增产物亮度
的 1 /3,说明连接效果良好 (连接效率至少要在 25%
以上,否则差减效率会大大降低 ) , 完全可以进行下
一步试验。2轮 PCR结果如图 4,第 1轮扩增后以正
向和反向差减 cDNA为模板都不能看到明显的弥散
条带,经过第 2轮 PCR扩增后才可以看到明显的弥
散条带,此即 A库 (生根率高的落叶松无性系 31- 6
为 Tester)和 B库 (生根率低的落叶松无性系 15- 4
为 Tester)。以上试验是对抑制消减杂交过程进行
监控,试验结果完全符合 SSH 技术要求。最后对所
获得差异表达 cDNA文库进行差减效率分析,如图 5
所示,以 A库双链 cDNA片段为模板的 PCR反应,
在 18个循环时没有可见 actin特异条带,在 23个
循环后开始出现非常弱的 actin特异条带, 至 33
个循环时 actin特异条带仍然很弱;而以正向未差
减双链 cDNA片段为模板的 PCR循环中,第 18个循
环就可以看到清楚的 actin特异条带, 且亮度非常
大。此结果说明,经过差减杂交后, A库中持家基因
actin片段已经被降低到很低的水平, 均一化效果
明显。
2. 3 差减 cDNA文库的构建及鉴定
以单菌落的菌液为模板, 使用 N ested PCR prim
er 1和 N ested PCR prim er 2R引物组进行 PCR扩增,
鉴定含有差减双链 cDNA片段插入的阳性克隆。由
图 6看出: 绝大部分单菌落可以扩增出整齐、亮度大
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第 5期 冯 健等:落叶松扦插生根过程抑制消减杂交文库构建及分析
的单一条带,且条带大小分布在 500 bp左右。图中
单一条带分布不一, 说明差减后的 cDNA片段呈现
多态性和重复率低的特点,表明经过差减后高丰度
基因的均一化效果很好。
M: 1Kb DNA Ladder; 1~ 23:差减文库插入片段
图 6 PCR筛选阳性克隆
采用随机引物法标记 2个探针,分别与 2套 cD
NA拷贝膜杂交,选取: ( 1)与 A库探针有杂交信号,
与 B库探针不能杂交; ( 2)与 A、B库探针均杂交,但
与 A库探针的杂交信号高于与 B库探针的杂交信
号 3倍的克隆, 作为特异或增强表达基因的候选克
隆。从点杂交结果 (图 7)看, 差减文库的阳性率在
85%以上, 符合差减文库构建要求。
A 为与 A库探针杂交结果; B为与 B库探针杂交结果
图 7 部分克隆斑点杂交筛选结果
2. 4 差异表达 cDNA片段的生物信息学注释和
归类
为了注释所有获得序列的可能生物学功能, 采
用 B lastx和 B lastn的方法进行相似性比对分析。通
过与本地化的 NCB I的 NR库、dbEST库及拟南芥数
据库比对,对每个 Un iEST进行最可能的功能注释,
A库中有 161条序列, B库中有 182条序列与数据
库中的序列具有同源性 (分值) 80, 相似性) 78%,
同源序列长 100 bp以上 )。所获得的 521条序列分
别属于不同的类别,具体统计情况见表 1。
表 1 落叶松扦插生根过程差别表达 cDNA文库
所获得的 UniEST分类
基因类别 A库序列条数 B库序列条数
新陈代谢 25 66
信号途径 41 33
物质运输 15 7
抗性相关 27 23
生长发育 29 20
亚细胞组成 5 4
功能未知 22 26
无比对结果 108 70
合计 272 249
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林 业 科 学 研 究 第 22卷
3 结论
构建一个好的差异表达 cDNA文库对起始 mR
NA的完整性和纯度要求非常高。本试验的结果表
明, 试验获得的总 RNA含量高, 完整性好, 28S与
18S带型亮度比达到 2∗1。mRNA的完整性和纯度
也完全达到文库构建要求。在本文抑制消减杂交试
验中,从反转录合成 cDNA的监控、加接头后的接头
连接效率分析到差减 cDNA片段的差减效率分析试
验,都随时监控着各个试验环节,保证最终获得高质
量的差异表达 cDNA文库。单菌落 PCR扩增电泳图
谱呈现很好的多态性, 点杂交试验结果为阳性率在
85%以上。这些结果直接说明获得了高质量的 A、B
差异表达 cDNA文库。
通过生物信息学分析, 在 A库获得的 272条
UniEST中, 无同源序列的 Un iEST占 39. 70%, 加上
功能尚未确定的序列, 占到所获得 UniEST 的
47. 70%;在有同源性的序列中, 以信号途径占的比
例最大, 达到 15. 07%, 其次是生长发育和抗性相
关, 分别达到 10. 66%和 9. 93%。这些结果表明,在
落叶松扦插生根过程中, 与生长发育和新陈代谢相
关的基因大量表达, 这些基因的表达产生相应的蛋
白和信号,最终促使插穗形成不定根及不定根和侧
根的生长发育。在 B库获得的 249条 U niEST中,无
同源序列的 UniEST占 28. 11% ,加上功能尚未确定
的序列, 占到所获得 Un iEST的 38. 15% ; 在有同源
性的序列中, 新陈代谢类序列占的比例最大, 达到
26. 51%,其次是信号途径、抗性相关、生长发育类序
列。在生根率低的落叶松无性系插穗中大量表达新
陈代谢类基因,这些基因的表达会在插穗中产生大
量次生代谢物,这些物质的产生是否影响插穗生根,
还有待进一步研究。
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