全 文 ：　　收稿日期 : 2001212225
基金项目 : 国家自然科学基金 (39970532) ,948 项目 (96204206)资助
作者简介 : 余义勋 (19732) ,男 ,河南新县人 ,华中农业大学博士生.
　　文章编号 : 100121498 (2002) 0320256205
香石竹 ACC 氧化酶基因的克隆
与植物表达载体构建
余义勋1 , 张俊卫1 , 孙振元2 , 包满珠1
(1. 华中农业大学林学系 ,武汉　430070 ; 2. 中国林业科学研究院花卉中心 ,北京　100093)
摘要 : 根据已发表的 ACO 核苷酸序列 ,设计一对引物 ,以香石竹品种‘American’基因组 DNA 为模板 ,
扩增出香石竹 ACC氧化酶基因 ,将其连接到 pMD18 加 T质粒载体上 ,通过中间载体 pBluescript SK,构
建了 ACO 基因正向和反向插入的植物表达载体 ,并将其导入了农杆菌。酶切检测表明该片段已插入
表达载体 ,序列测定结果显示所克隆基因片段含 3 个外显子 ,2 个内含子 ,其中 3 个外显子序列与已
发表的 ACO 基因 cDNA 序列完全一致。
关键词 : 香石竹 ;ACC氧化酶 ; 基因克隆 ; 测序 ; 重组载体构建
中图分类号 : S72213 　　　　　文献标识码 :A
香石竹 ( Dianthus caryophyllus L. ) 是世界四大切花之一 ,在花卉市场中占有重要地位。就
商业观点而言 ,瓶插寿命是切花植物品质优劣的主要因素之一。乙烯是高等植物中促进器官
衰老和果实成熟的激素。香石竹是典型的乙烯致衰植物 ,也是研究乙烯代谢的花卉之一。
ACC氧化酶 ,又称乙烯合成酶 ( EFE) ,是植物乙烯合成途径中的关键酶 ,催化乙烯合成的最后
一步 (即催化 ACC生成乙烯) 。应用 ACC 氧化酶基因的反义 RNA 技术 ,可望有效抑制乙烯生
物合成 , 从而延长切花植物的瓶插寿命 [1 ] 。目前国外已从番茄 ( Lycopersicon esculentum
Mill . ) [2 ] 、苹果 ( Malus pumila Mill . ) [3 ] 、豌豆 ( Pisum satium Linn. ) [4 ] 、桃 ( Amygdalus persica L. ) [5 ] 、
矮牵牛 ( Petunia hybrida Vilm. ) [6 ] 、香石竹[7 ] 、猕猴桃 ( Actinidia sp . ) [8 ]等植物中克隆到 ACC 氧
化酶基因 cDNA ,1995 年澳大利亚花卉基因有限公司将香石竹ACC氧化酶基因 cDNA 导入香石
竹后 ,使香石竹花瓣衰老明显延迟[1 ] ,而在国内利用基因工程获得抗衰老香石竹品种的研究尚
未见报道。本研究以香石竹品种‘American’基因组为模板 ,成功地克隆了 ACC 氧化酶基因 ,并
构建起其正义和反义基因的植物表达载体。
1 　材料和方法
1. 1 　材 　料
香石竹品种‘American’组培苗由云南省农科院提供 ,大肠杆菌 ( Escherichia coli (Migula)
Castellani and Chelmers) DH5α、根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens ( Smith et Townsend) Conn)
LBA4404 菌株为本实验室保存 ,中间载体 pBluescript SK( + ) 、二元载体 pMOGMON 为荷兰自由
林业科学研究　2002 ,15 (3) :256 　260
Forest Research
大学馈赠 ,其余分子生物学试剂均购自华美生物工程公司。
1. 2 　植物 DNA的提取和纯化
植物总 DNA 的提取参照张俊卫等[9 ]的微量提取法 ,取 0. 2 g 植物叶片 ,放入 1. 5 mL 的离
心管中 , 置液氮中片刻 ,捣碎组织至粉末状 ;加入 600μL 提取缓冲液 ,65 ℃水浴 20 min ,中间颠
倒 1 次 ,12 000 r·min - 1离心 5 min ,上清液转入另一离心管 ,加等体积氯仿 :异戊醇 (24∶1)抽提 ,
重复抽提 3 次 ;上清液转入另一离心管 ,加 0. 6 倍体积异丙醇 ( - 20 ℃)放置 30 min ,沉淀DNA ;
12 000 r·min - 1离心 2 min 弃上清 ,沉淀用 70 %酒精漂洗 ;干燥 DNA ,加 100μL TE溶解 DNA ,并
保存于 4 ℃。
1. 3 　PCR扩增及其产品的回收
参照 Wang 等[7 ]报道的香石竹 ACC氧化酶基因 cDNA 序列 ,设计一对引物 (由上海博亚生
物技术工程公司合成) ,反应体系和反应条件参照林荣呈等[10 ]的做法。PCR 产品用上海生工
DNA 回收试剂盒进行回收。
1. 4 　目的片段的克隆、酶切分析
将回收的目的DNA 条带与pMD18 - T载体连接 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,在x2gal/ IPTG
培养基上挑取白色菌落 ,用碱法小批量抽提质粒 ,并作电泳鉴定和限制性内切酶分析。
图 1 　含 ACO 基因的植物重组表达载体的构建
1. 5 　含 ACC氧化酶基因的中间载体的构建、序列测定和植物重组表达载体构建和鉴定
将含有 ACC氧化酶基因的 pMD182T载体用 Pst Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切 ,回收小片断克隆到
经 Pst Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切的 pBluescript SK( + ) 载体上 ,并对该重组载体进行测序。将含有
ACC氧化酶基因的 pBluescript SK( + )载体用 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切 ,回收小片断克隆到经
EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切的 pMOGMON 载体 (含 35S 启动子的二元表达载体) 上 ,构建成正义
植物表达载体。将含有 ACC氧化酶基因的 pBluescript SK( + )载体用 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ酶切回
收小片断克隆到经 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ双 酶切的 pMOGMON 载体上 ,构建成反义植物表达载体 ,
如图 1。
1. 6 　含 ACC 氧化酶基因的植物重组表达载体
转化根癌农杆菌
用碱法大量制备质粒 DNA ,经 RNase 消化
RNA ,然后用氯仿 :异戊醇 (24∶1) 抽提 3 次 , 上
清液转入另一离心管 ,加 0. 6 倍体积异丙醇 ( -
20 ℃)放置 30 min ,沉淀 DNA ;12 000 r·min - 1离
心 2 min 弃上清 ,沉淀用 70 %酒精漂洗 ;干燥
DNA ,加 50μL TE溶解 DNA ,用冻融法导入根癌
农杆菌。
2 　结果
2. 1 　PCR产物的克隆、酶切分析和序列测定
ACC 氧化酶基因已在番茄[2 ] 、桃[5 ] 、苹
果[3 ] 、矮牵牛[6 ] 、香石竹[7 ]等植物上有报道 ,不
同植物 ACC 氧化酶基因氨基酸同源性在 70 %
752第 3 期 余义勋等 :香石竹 ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建
第 1 行为已发表的香石竹 ACO cDNA 序列 ,第 2 行为测序结果。划横线部分为引物序列 ,
划波纹线部分为内含子。
图 2 　测序结果与已发表的香石竹 ACO 基因 cDNA 序列比较
左右。根据 Wang 等[7 ]报道的”White”香石竹品种 ACC 氧化酶基因 cDNA 序列 ,设计一对特异
引物 ,5’> GCAAACATTGTCAACTTCCC < 3 ’和 5’> TCAAGCAGTTGGAATGGGAC < 3’,以
‘American’香石竹品种基因组 DNA 为模板进行 PCR ,扩增出一长度约为 1. 2 kb 的片段 ,将该片
段克隆到 pMD182T载体上 ,初步筛选到 5 个插入片段在 1. 2 kb 左右的克隆 ,对其中一个克隆
pMD4 进行酶切鉴定、PCR 分析。pMD4 经 Pst Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切后与用 Pst Ⅰ和 BamH Ⅰ双
酶切的 pBluescrip SK( + )载体 ,定名为 pBS2ACO1。对 pBS2ACO1 的酶切和 PCR 分析表明 : PCR
片段已插入 pBluescrip SK( + )载体中。
852　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 15 卷
对重组载体 pBS2ACO1 中插入片段的序列测定 (图 2)表明 :所克隆片段全长 1 205 bp (含引
物)含 3 个外显子 ,2 个内含子 ,外显子全长 953 bp 内含子全长 242 bp ,外显子部分与 Wang
等[7 ]所报道的 cDNA 序列完全一致。
　1. EcoR Ⅰ+ BamH Ⅰ酶切 pMACO1 ; 2.
EcoR Ⅰ+ Xba Ⅰ酶切 pMACO 2 ; 3. 以
pMACO1 为模板 PCR 扩增 ; 4. 以 pMA2
CO2 为模板 PCR 扩增 ; 5、6. 以根癌农杆
菌转化子为模板 PCR 扩增 ; 7. 以香石竹
基因组为模板 PCR 扩增 ; 8. λDNA/ Hind
III 分子量标记。
图 3 　pMACO1 和 pMACO2 的
酶切和 PCR 鉴定
2. 2 　植物重组表达载体构建和鉴定
pBS2ACO1 经 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切后的较小片断
回收插入经 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切的 pMOGMON 载体
上 ,为正义植物表达载体 , 定名为 pMACO1。pBS2ACO1 经
EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切后的较小片断回收插入经 EcoR Ⅰ
和 Xba Ⅰ双酶切的 pMOGMON 载体上 ,为反义植物表达载
体 , 定名为 pMACO2。两重组表达载体都经酶切鉴定、PCR
分析。
2. 3 　根癌农杆菌的转化与鉴定
用冻融法将正义和反义重组表达载体转化到根癌农杆
菌中 ,分别得到 10 多个转化子。以根癌农杆菌中纯化的质
粒为模板 ,用ACC氧化酶基因的特异引物进行 PCR ,结果表
明 :大多数转化子的 DNA 中均能扩增出与 ACC氧化酶基因
片段大小相同的片段 ,而阴性对照未能扩增出相应条带 ,如
图 3。
3 　讨论
乙烯在高等植物中的合成途径为 :MET(蛋氨酸)2SAM
(腺苷蛋氨酸)2ACC2乙烯 ,ACC氧化酶催化 ACC 生成乙烯。最新研究表明 , IAA 能够促进乙烯
产量的增加是通过乙烯自身诱导了 ACC氧化酶基因的转录 ,ACC 氧化酶可能也是乙烯合成的
一个限速酶[11 ] ,利用 ACC 氧化酶基因反义 RNA 技术抑制乙烯合成已先后在番茄[2 ]和香石
竹[1 ]上获得成功。另外 ,根据同源依赖性基因沉默 ( HDGS) 原理 ,导入正义基因和反义基因均
可实现内源基因沉默[12 ] 。最近 ,Angel [13 ]和 Hamilton[14 ]等的研究表明 ,重复DNA 片段能够引起
内源基因 100 %的转录后沉默 (Posttranscriptional silence)频率 ,为转基因沉默内源基因提供了更
加高效的方法。目前 ,正义和反义基因转化香石竹以及重复基因的载体构建工作正在进行
之中。
参考文献 :
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Cloning of ACC Oxidase Gene of Carnation and Construction
of Its Plant Expression Vectors
YU Yi2xun1 , ZHANG Jun2wei1 , SUN Zhen2yuan2 , BAO Man2zhu1
(1. Central China Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei , China ; 2. Flower Center , CAF , Beijing 100091 , China)
Abstract : A pair of primers were designed according to the 12aminocyclopropone212carboxylic acid
(ACC) oxidase gene of carnation and the primers were used to amplify the genomic DNA fragment of
about 1. 2 kb by polymerase chain reaction ( PCR) by taking genome DNA from‘American’carnation
leaves as template. The PCR product was cloned into T2tailing pMD18 vector. Sequencing indicated that
the ACC oxidase gene included three exons interrupted by 2 introns with identical positions as they are in
tomato. ACC oxidase gene were respectively cloned into plant expression vector pMOGMON in sense and
antisense orientation. Recombinant expression vectors were identified by restriction enzyme and PCR
analysis. PCR indicated plant expression vectors were transferred into A . tumef aciens .
Key words : carnation ( Dianthus caryophus L. ) ; ACC oxidase gene ; cloning ; sequencing ; construction
of plant expression vector
062　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 15 卷