全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿袁圆远渊缘冤院缘源圆 缘源苑云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤园缘鄄园缘源圆鄄园远
毛白杨 源鄄香豆酸院辅酶 粤连接酶渊源悦蕴猿冤的
酶学特征研究
饶国栋员袁圆袁 张永卓圆袁 魏弘宜圆袁 蒋湘宁圆袁 陆摇 海圆袁 张建国员鄢
渊员郾 国家林业局林木培育重点实验室袁中国林业科学研究院林业研究所袁北京摇 员园园园怨员曰 圆郾 北京林业大学袁北京摇 员园园园愿猿冤
收稿日期院 圆园员圆鄄园猿鄄员怨
基金项目院 北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目鄄学科建设鄄森林培育渊圆园员圆园远员愿冤
作者简介院 饶国栋渊员怨愿猿要冤袁男袁助理研究员袁博士援 耘鄄皂葬蚤造院则葬燥早怎燥凿燥灶早园圆岳 员远猿援 糟燥皂援
鄢 通讯作者院男袁研究员袁博士袁博士生导师援 耘鄄皂葬蚤造院扎澡葬灶早躁早岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶援
摘要院为了进一步研究杨树 源悦蕴基因袁以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨 源悦蕴猿 基因遥 生物信息学分析结果显
示院该基因和其他 源悦蕴基因一样含有 源悦蕴基因家族 圆 个保守框 月燥曾 陨和 月燥曾 陨陨遥 将 源悦蕴猿 基因连接至原核表达载体
责匝耘猿园袁表达纯化后测定其蛋白的比活力袁结果显示院源悦蕴猿 基因对不同底物表现出了不同的催化效率遥 对该基因的
最适温度和最适 责匀值测定后发现院源悦蕴蛋白的最适温度为 源园 益袁最适 责匀 值为 愿援 缘袁且在 责匀 越 怨援 园 时有 远园豫的活
力遥 采用 匀孕蕴悦鄄酝杂的方法袁分析了 源悦蕴猿 蛋白对混合底物的催化情况袁结果显示院在混合底物下袁源悦蕴猿 蛋白对 源鄄香
豆酸尧阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力袁而对芥子酸和咖啡酸没有活力遥
关键词院源鄄香豆酸院辅酶 粤连接酶曰匀孕蕴悦鄄酝杂曰 原核表达曰毛白杨
中图分类号院杂苑员愿郾 源远 文献标识码院粤
耘灶扎赠皂葬贼蚤糟 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽 燥枣 源鄄糟燥怎皂葬则葬贼藻院 糟燥藻灶扎赠皂藻 粤 蕴蚤早葬泽藻
渊源悦蕴猿冤 枣则燥皂 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬
砸粤韵 郧怎燥鄄凿燥灶早员袁圆袁 在匀粤晕郧 再燥灶早鄄扎澡怎燥圆袁 宰耘陨 匀燥灶早鄄赠蚤圆袁 允陨粤晕郧 载蚤葬灶早鄄灶蚤灶早圆袁 蕴哉 匀葬蚤圆袁 在匀粤晕郧 允蚤葬灶鄄早怎燥员
渊员郾 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 栽则藻藻 月则藻藻凿蚤灶早 葬灶凿 悦怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶袁 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁
月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬曰 圆郾 月藻蚤躁蚤灶早 云燥则藻泽贼则赠 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园愿猿袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 粤 灶藻憎 源悦蕴 早藻灶藻 枣则燥皂 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬 悦葬则则援 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 葬灶凿 灶葬皂藻凿 葬泽 源悦蕴猿援 月蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤糟泽 皂藻贼澡燥凿
憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 葬灶葬造赠泽蚤泽 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 贼澡蚤泽 源悦蕴猿 早藻灶藻 葬造蚤早灶蚤灶早 憎蚤贼澡 贼憎燥 燥贼澡藻则 源悦蕴 责则燥贼藻蚤灶泽援 栽澡藻 葬怎贼澡燥则泽 枣燥怎灶凿
贼澡藻 糟燥灶泽藻则增藻凿 泽藻择怎藻灶糟藻 月燥曾 陨 葬灶凿 月燥曾 陨陨 藻曾蚤泽贼 蚤灶 贼澡藻 源悦蕴 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠援 孕则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 憎葬赠 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 则藻鄄
泽藻葬则糟澡 贼澡藻 藻灶扎赠皂藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡蚤泽 源悦蕴猿 责则燥贼藻蚤灶袁 贼澡藻 则藻泽怎造贼 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 源悦蕴 责则燥贼藻蚤灶 澡葬凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻灶扎赠皂葬贼蚤糟 葬糟鄄
贼蚤增蚤贼赠 贼燥憎葬则凿泽 贼澡藻 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 泽怎遭泽贼则葬贼藻援 栽澡藻 源悦蕴猿 责则燥贼藻蚤灶 澡葬凿 贼澡藻 遭蚤早早藻泽贼 藻灶扎赠皂葬贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬贼 贼澡藻 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 燥枣 源园
益袁 葬灶凿 蚤贼 澡葬凿 贼澡藻 遭蚤早早藻泽贼 藻灶扎赠皂葬贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬贼 责匀 愿援 缘袁 贼澡蚤泽 藻灶扎赠皂藻 澡葬泽 贼澡藻 葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 则藻泽蚤泽贼蚤灶早 葬造噪葬造蚤灶藻 藻灶增蚤则燥灶鄄
皂藻灶贼援 栽澡藻 缘 泽怎遭泽贼则葬贼藻泽 燥枣 源悦蕴 憎藻则藻 皂蚤曾藻凿 葬灶凿 贼澡藻 皂藻贼澡燥凿 燥枣 匀孕蕴悦鄄酝杂 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 泽怎则增藻赠 贼澡藻 糟燥灶泽怎皂责贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
泽怎遭泽贼则葬贼藻 葬枣贼藻则 责怎贼贼蚤灶早 源悦蕴 藻灶扎赠皂藻 贼燥 泽贼葬则贼 贼澡藻 则藻葬糟贼蚤燥灶援 陨贼 憎葬泽 枣燥怎灶凿 贼澡葬贼 遭藻泽蚤凿藻泽 泽蚤灶葬责蚤糟 贼澡藻则藻 憎葬泽 灶燥 糟燥灶泽怎皂责贼蚤燥灶
燥枣 糟葬枣枣藻蚤糟 藻蚤贼澡藻则援
运藻赠 憎燥则凿泽院 源悦蕴曰 匀孕蕴悦鄄酝杂曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬
木质素含植物干质量的 猿园豫以上袁在植物生长
发育过程中起着至关重要的作用遥 它能加固细胞壁
的机械强度咱员暂 袁改善畜草的营养成分而有利于食草
类牲畜消化和吸收袁并在抵御病虫类侵害中起着重
要作用咱圆暂 遥 源鄄香豆酸院辅酶 粤 连接酶渊源悦蕴冤为木质
素合成途径中的限速酶袁它催化羟基肉桂酸及其衍
第 缘 期 饶国栋等院毛白杨 源鄄香豆酸院辅酶 粤连接酶渊源悦蕴猿冤的酶学特征研究
生物到相应的硫酯化合物转化的反应咱猿暂 遥 由于 源悦蕴
基因在木质素合成途径中的关键作用袁现阶段对
源悦蕴的研究已经成为国内外的热点遥 在拟南芥渊粤则鄄
葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 匀藻赠灶澡援 冤 咱源 原 缘暂 尧大豆 渊 郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾
渊蕴援 冤 酝藻则则援 冤 咱远暂 尧杂交杨渊孕燥责怎造怎泽 贼则蚤糟澡燥糟葬则责葬 伊 孕燥责鄄
怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 冤 咱苑 原 愿暂 尧 桉 树 渊 耘怎糟葬造赠责贼怎泽 则燥遭怎泽贼葬
泽皂蚤贼澡冤 咱怨暂 尧棉花渊郧燥泽泽赠责蚤怎皂 葬则遭燥则藻贼怎皂 造蚤灶灶援 冤 咱员园暂 尧烟草
渊晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂 造蚤灶灶援 冤 咱员员暂 尧番茄渊 蕴赠糟燥责藻则泽蚤糟燥灶 藻泽鄄
糟怎造藻灶贼怎皂 皂蚤造造援 冤 咱员圆暂 尧 慈 竹 渊 晕藻燥泽蚤灶燥糟葬造葬皂怎泽 葬枣枣蚤灶蚤泽
噪藻灶援 冤 咱员猿暂 尧 象 草 渊 孕藻灶灶蚤泽藻贼怎皂 责怎则责怎则藻怎皂 杂糟澡怎皂鄄
葬糟澡冤 咱员源暂 尧水稻渊韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬 蕴援 冤 咱员缘 原 员苑暂等双子叶和单
子叶植物中袁都分离鉴定了不同功能的 源悦蕴基因曰而
在所研究的物种中袁源悦蕴 基因家族的大小以及成员
间的功能差异尚不完全明确遥
近 员缘 年来袁源悦蕴基因调控木本植物木质素的合
成成为研究的热点遥 之前的研究主要集中在 源悦蕴员
上袁而随着研究的深入袁发现 源悦蕴基因是以基因家族
的形式调控木质素尧类黄酮等次生代谢物质的形
成咱员愿 原 员怨暂 遥 悦燥泽贼葬等咱缘暂在拟南芥中已经发现有活性的
源悦蕴有 源 个袁李来根等咱员缘暂在水稻中发现了 缘 个功能
上存在分化的 源悦蕴 基因袁蕴蚤灶凿藻则皂葬赠则 等咱远袁 圆园暂在大豆
中也发现了 源 个有活性的 源悦蕴 基因遥 现在袁已经分
离鉴定的杨树 源悦蕴 基因只有 圆 个袁这 圆 个基因序列
的同源性很高袁但功能各异咱圆员暂 遥 杨树作为高等植物
中的乔木袁其维管系统发达袁木质素含量高袁而 源悦蕴
为木质素合成中的关键酶遥 不难推测袁杨树 源悦蕴 基
因家族的大小应该不会小于拟南芥尧大豆尧水稻等 员
年生草本和单子叶植物遥 木本植物袁如杨树中应该
还存在其他的除 源悦蕴员 和 源悦蕴圆 的基因遥
毛白杨渊孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬 悦葬则则援 冤作为我国特有
的乡土树种袁是重要的绿化和造纸用材树种遥 为了
进一步研究毛白杨 源悦蕴基因在木质素合成以及其他
代谢途径中的作用袁对毛白杨 源悦蕴 其他基因进行了
挖掘袁最终得到了一个异于之前所有报道的 源悦蕴 基
因袁将该基因命名为毛白杨 源悦蕴猿 基因袁并对该基因
的酶学特征进行了研究遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 材料尧主要试剂尧仪器
苑源员 毛白杨采自北京林业大学苗圃袁组培苗由
北京林业大学生物学院提供曰酝鄄酝蕴灾 反转录试剂盒
购买自 孕则燥皂藻早葬公司曰植物总 砸晕粤 提取试剂盒尧栽砸鄄
陨扎燥造 砸则葬早藻灶贼购买于 蚤灶增蚤贼则燥早藻灶公司曰孕灾孕孕尧氯仿尧异丙
醇尧无水乙醇和 阅耘孕悦 为国产分析纯曰琼脂糖凝胶
阅晕粤回收试剂盒购买自 栽陨粤晕郧耘晕 公司曰责酝阅员愿鄄栽尧
责匝耘猿园 载体试剂盒尧晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤 试剂盒尧耘援 糟燥则蚤尧酝员缘
渊责砸耘孕源冤试剂盒购买自 匝陨粤郧耘晕 公司遥 源鄄香豆酸尧
咖啡酸尧阿魏酸尧肉桂酸尧芥子酸购自 杂蚤早皂葬 公司遥
粤早蚤造藻灶贼公司的 匀孕员员园园 高效液相色谱仪袁色谱柱为
在韵砸月粤载 耘糟造蚤责泽藻 载阅月鄄悦员愿 柱曰热电公司的 匀孕蕴悦鄄
酝杂袁真空干燥器袁微量取样器袁玻璃毛细管遥
员援 圆摇 方法
员援 圆援 员摇 毛白杨 源悦蕴猿 基因的获得与鉴定摇 本实验所
用材料为毛白杨的全株组培苗遥 采用 栽则蚤扎燥造 法提取
植物总 砸晕粤遥 利用 酝鄄酝蕴灾反转录 皂砸晕粤获得杨树
总 糟阅晕粤第一链袁操作方法按照说明书常规操作遥
同时袁利用电子克隆和毛果杨基因组数据库咱苑暂比对
分析袁设计引物渊上游引物院缘鄄悦悦粤郧粤郧粤粤粤悦粤粤栽郧鄄
郧粤郧郧悦郧郧鄄猿曰 下 游引 物院 缘鄄悦粤栽郧栽悦悦栽粤悦粤粤栽粤悦鄄
悦悦栽郧粤郧悦鄄猿冤孕悦砸克隆了杨树 源悦蕴 基因全长 糟阅晕粤
并测序遥 将上述序列经过生物信息学分析和数据库
比对最终鉴定该序列为尚未发表的新的毛白杨 源悦蕴
基因遥
员援 圆援 圆摇 毛白杨 源悦蕴猿 基因的原核表达与蛋白纯化摇
采用 责匝耘猿园 原核表达载体和所克隆得到的 源悦蕴 全
长 糟阅晕粤相连接的方法构建重组原核表达载体袁通
过阳离子亲和层析的方法纯化原核表达蛋白遥 具体
操作如下院首先将凝胶回收的 孕悦砸 产物与克隆载体
责酝阅员愿鄄栽相连袁并通过转化感受态细胞渊允酝员园怨冤尧蓝
白斑筛选尧测序获得含 源悦蕴全长基因的克隆载体曰其
次袁通过设计酶切位点 孕泽贼 陨 和 月葬皂匀 陨 分别双酶切
责匝耘猿园 原核表达载体和含 源悦蕴猿 基因的克隆载体袁电
泳回收片段袁并利用 栽源 连接酶将 源悦蕴猿 基因和原核
表达载体 责匝耘猿园 相连构建重组 源悦蕴猿 原核表达载
体袁同时转化感受态细胞 酝员缘 而获得含重组毛白杨
源悦蕴猿 基因的原核表达菌株曰最后袁利用 陨孕栽郧 诱导原
核表达菌株的方法将 源悦蕴猿 蛋白原核表达袁并通过阳
离子亲和层析的方法纯化表达蛋白渊操作方法见
晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤试剂盒说明书冤遥
员援 圆援 猿 摇 毛白杨 源悦蕴猿 酶活性分析 摇 源悦蕴 是以肉桂
酸尧咖啡酸尧香豆酸尧芥子酸和阿魏酸这 缘 种酚酸为
底物袁按 运灶燥遭造燥糟澡法咱圆圆暂测定 源悦蕴酶活性袁略有修改遥
酶反应体系含有 圆援 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 粤栽孕尧园援 圆 皂皂燥造窑
蕴 原员 悦燥粤 和 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 酝早圆 垣 袁园援 圆 皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄
匀悦造袁一定量的底物袁责匀 值 苑援 愿袁加入适量的 源悦蕴员 蛋
白遥 空白对照为变性的酶袁其他同上遥 责匀 值 苑援 愿袁
猿源缘
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
反应温度均为室温曰而羟基肉桂酸辅酶 粤 的吸收波
长咱圆猿暂见表 员遥
表 员摇 羟基肉桂酸 悦燥粤衍生物的紫外吸收数据
悦燥粤衍生物 波长 辕 灶皂 消光系数 辕 渊蕴窑 皂燥造 原 员窑糟皂 原员冤
源鄄香豆酸 悦燥粤 猿猿猿 圆员 园园园
摇 阿魏酸 悦燥粤 猿源缘 员怨 园园园
摇 咖啡酸 悦燥粤 猿源远 员愿 园园园
摇 肉桂酸 悦燥粤 猿员员 圆圆 园园园
摇 芥子酸 悦燥粤 猿缘圆 圆园 园园园
员援 圆援 源摇 毛白杨 源悦蕴猿 酶的最适温度和最适 责匀 值的
测定摇 对毛白杨 源悦蕴酶的最适反应温度和最适反应
责匀值进行了测定遥 最适温度操作院温度设定为 圆园尧
圆缘尧猿园尧猿缘尧猿苑尧源园尧源缘尧缘园尧缘缘尧远园尧远缘 益遥 酶反应体系
为 圆援 缘 皂皂燥造窑蕴 原员粤栽孕袁园援 圆 皂皂燥造窑蕴 原员 悦燥粤袁缘 皂皂燥造
窑蕴 原员 酝早圆 垣 袁园援 圆 皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造袁一定量的底物
渊源鄄香豆酸冤袁责匀值 苑郾 愿袁加入适量的 源悦蕴猿 蛋白开始
反应遥 在反应开始前将除酶以外的反应缓冲液尧底
物尧悦燥粤和 粤栽孕 都放入水浴锅中预热渊或冰浴中预
冷冤遥 测定 韵阅猿猿猿的变化袁确定酶的最适反应温度遥
最适 责匀值测定操作院用盐酸调节反应缓冲液的 责匀
值分别为 远援 缘尧苑援 园尧苑郾 缘尧苑援 苑尧愿援 园尧愿援 圆尧愿援 缘尧愿援 愿尧怨援 园遥
酶反应体系院圆援 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 粤栽孕袁园援 圆 皂皂燥造窑蕴 原员
悦燥粤袁缘 皂皂燥造窑蕴 原员 酝早圆 垣 袁园援 圆 皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造袁一
定量的底物渊源鄄香豆酸冤加入适量的 源悦蕴猿 蛋白开始
反应遥 测定 韵阅猿猿猿的变化袁确定酶的最适反应 责匀值遥员援 圆援 缘摇 毛白杨 源悦蕴猿 蛋白对混合底物的反应摇 本实
验采用 匀孕蕴悦鄄酝杂的方法测定 源悦蕴猿 对混合底物的反
应遥 分别配制 员 皂皂燥造的物种底物渊芥子酸尧阿魏酸尧
咖啡酸尧肉桂酸尧源鄄香豆酸冤袁加入至 员援 缘 皂蕴 的离心
管袁于旋转真空干燥器上干燥至干粉袁注意避光曰然
后用色谱纯的甲醇 缘园 滋蕴 溶解袁再依次加入适量的
粤栽孕尧悦燥粤尧酶反应缓冲液袁最后加入相同量的酶袁猿苑
益反应 员缘 皂蚤灶遥
色谱条件院 粤早蚤造藻灶贼 公司的 匀孕员员园园 高效液相色
谱仪袁色谱柱为 在韵砸月粤载 耘糟造蚤责泽藻 载阅月鄄悦员愿 柱袁规格
为 源援 远 皂皂 伊圆缘园 皂皂袁缘 滋皂袁柱温为 猿园 益袁检测波长
为 猿园圆 灶皂袁谱带宽度为 员远 灶皂袁参比波长为 源远园 灶皂袁
参比谱带宽度为 员园园 灶皂遥 二极管阵列检测器记录
光谱范围为 员怨园 员园园 灶皂袁自动进样器进样每次为
员园 滋蕴遥 洗脱条件为院灾渊甲醇冤 颐 灾渊员豫醋酸冤分别为
猿颐 怨苑袁园 皂蚤灶曰 猿远颐 远源袁猿园 皂蚤灶曰源缘颐 缘缘袁缘园 皂蚤灶曰 圆颐 圆愿袁远园
皂蚤灶曰 员园园颐 园袁远员皂蚤灶曰 员园园 颐 园袁苑员 皂蚤灶曰 猿 颐 怨苑袁苑圆 皂蚤灶遥
流速为 员 皂蕴窑皂蚤灶 原员遥 热电公司的 匀孕蕴悦鄄酝杂 条件
为院样品分离柱为 在韵砸月粤载 耘糟造蚤责泽藻 载阅月鄄悦员愿 渊员缘园
皂皂 伊圆援 员 皂皂袁猿援 缘 滋皂渊粤早蚤造藻灶贼 栽藻糟澡灶燥造燥早蚤糟冤袁其他条
件同上述遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 毛白杨 源悦蕴猿 基因的鉴定
将获得的毛白杨全长 糟阅晕粤 序列通过软件
渊月蚤燥耘凿蚤贼冤翻译成蛋白袁并以翻译蛋白和杨树 源悦蕴员
和 源悦蕴圆 进行比对咱圆源暂 遥 图 圆 所示院所克隆基因
孕贼燥源悦蕴猿 和杨树的 源悦蕴员尧源悦蕴圆 的同源性较高渊在
愿园豫以上冤袁而 月燥曾 陨 和 月燥曾 陨陨 为 源悦蕴 基因的 圆 个
保守序列咱圆猿暂 袁这 圆 个保守序列为 源悦蕴基因所特有袁
也是鉴定 源悦蕴基因的重要依据袁所克隆的 源悦蕴猿 基
因含有这 圆 个保守序列袁所以初步断定该基因为毛
白杨 源悦蕴基因袁之后的酶活性分析也证明该基因
确为 源悦蕴基因遥
圆援 圆摇 毛白杨 源悦蕴猿 蛋白的比活力测定
为研究毛白杨的比活力袁首先将重组毛白杨蛋
白进行了原核表达并纯化袁图 员 为 源悦蕴猿 蛋白表达纯
化的 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳图遥 对照为未诱导表达的原始
表达菌株袁上清和沉淀分别为菌液富集尧破碎尧离心
后的上清液和沉淀袁而洗脱则为利用阳离子亲和层
析方法纯化蛋白的洗脱液遥 从图 员 可以看出院上清
摇 摇 酝院蛋白标准曰对照院未诱导菌株总蛋白曰诱导院诱导菌株总蛋
白曰沉淀院诱导菌株中不容于 遭怎枣枣藻则 的蛋白曰上清院诱导菌株中溶于
遭怎枣枣藻则的蛋白曰穿透院纯化过程中的穿透液曰造葬泽贼憎葬泽澡院最后洗完杂蛋
白的收集液曰洗脱 员 洗脱 缘院分别收集 缘 次洗脱
图 员摇 毛白杨 源悦蕴猿 的原核表达渊杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳和纯化冤
泳道的蛋白表达量大袁经富集可以作为活性测定的
酶蛋白曰而经蛋白纯度分析软件 匝怎葬灶贼蚤贼赠 韵灶藻 测定
后袁纯化泳道 源悦蕴猿 蛋白的总量占总蛋白的 怨缘豫以
上袁符合酶活性分析纯度遥
源源缘
第 缘 期 饶国栋等院毛白杨 源鄄香豆酸院辅酶 粤连接酶渊源悦蕴猿冤的酶学特征研究
将上述纯化得到的 源悦蕴猿 蛋白于 猿园豫甘油中保
存袁取适量的酶测定其比活力遥 表 圆 所示院香豆酸的
比活力最大袁其次是阿魏酸袁香豆酸和阿魏酸的比活
力是咖啡酸和肉桂酸 圆 倍以上袁咖啡酸和肉桂酸的
比活力相对较小袁芥子酸没有活性遥
表 圆摇 毛白杨 源悦蕴猿 蛋白的比活性和底物偏好性
项目 肉桂酸 香豆酸 阿魏酸 咖啡酸 芥子酸
比活力 辕
渊灶噪葬贼窑皂早 原员冤 猿愿援 远 依园援 园 愿猿援 猿 依园援 员 苑猿援 苑 依园援 员 猿园援 远 依园援 圆 园
底物减
少量 辕 皂皂燥造 员圆猿 依圆怨援 源 员苑苑 依员援 怨 员源怨 依圆援 圆 摇 园 依园援 园 园
图 圆摇 毛白杨 源悦蕴基因与家族成员的蛋白比对渊月韵载 玉和 月韵载 域为 源悦蕴蛋白的保守序列袁均用方框标注遥冤
圆援 猿摇 毛白杨 源悦蕴猿 蛋白的最适温度和最适 责匀值
毛白杨 源悦蕴猿 蛋白的最适温度曲线为典型的钟
形曲线袁图 猿粤所示院在 源园 益时其活性最大袁在低于
圆园 益和高于 远园 益时其活力不足最大活力的 猿园豫 曰
在 源园 益以前袁源悦蕴蛋白随着反应温度的增加其活力
逐渐增加曰而在高于 源园 益后袁随着温度的升高袁源悦蕴
蛋白的活力逐渐减小遥 与最适温度相似袁毛白杨
源悦蕴猿 蛋白的最适 责匀 值曲线也表现为钟形袁但不是
野均匀冶的钟形袁这种不均匀主要体现在袁当 责匀 值达
到 怨郾 园 时袁毛白杨 源悦蕴蛋白仍然保持 远园豫左右的活
性袁而其最适 责匀值为 愿郾 缘渊图 猿月冤遥 图 猿月所示院 在
责匀值为 远援 缘 愿援 缘 时袁随着 责匀 值的增加袁源悦蕴 蛋白
活性逐渐增强袁而 责匀 值为 愿援 缘 怨援 园 时袁源悦蕴 蛋白
表现出随着 责匀值增加而其活性减小的趋势遥
缘源缘
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
粤院最适温度曰月院最适 责匀
图 猿摇 毛白杨 源悦蕴猿 的最适温度和最适 责匀值
圆援 源摇 毛白杨 源悦蕴猿 蛋白对底物的偏好性
从上述比活力的结果可以看出院源悦蕴猿 蛋白对香
豆酸的比活力最强袁阿魏酸次之袁其对咖啡酸和肉桂
酸的比活力低于前二者袁对芥子酸没有活性遥 这说
明 源悦蕴猿 蛋白对不同底物有不同的催化效率遥 在
自然环境下袁杨树各个组织中不可能只含有 员 种或
圆 种酚酸袁而是多种酚酸共同存在于不同组织中袁
为了研究 源悦蕴蛋白会优先催化某一种底物或某几
种底物袁还是均匀的把所有能催化的酚酸作为底
物袁将 源悦蕴蛋白的 缘 种底物渊源鄄香豆酸尧阿魏酸尧咖
啡酸尧肉桂酸尧芥子酸冤混合袁采用 匀孕蕴杂鄄酝杂的方法
测定混合底物在一定量的酶作用下的减少量遥 图
源 表明院咖啡酸尧阿魏酸尧源鄄香豆酸尧芥子酸和肉桂
酸的裂解离子渊皂 辕 扎冤分别约为 员猿缘袁怨苑曰 员员怨袁员远猿曰
员源怨袁员苑远曰 员圆园袁苑愿曰圆园愿袁员苑怨曰云 为 缘 种酚酸的色谱
图袁葬 为咖啡酸袁遭 为 源鄄香豆酸袁糟 为阿魏酸袁凿 为芥
子酸袁藻为肉桂酸遥 这 缘 种酚酸都得到了很好的分
离遥 由表 圆 可以看出院香豆酸的减少量最大袁其次
是阿魏酸和肉桂酸袁而咖啡酸和芥子酸没有减少袁
在混合底物的情况下袁源悦蕴猿 选择性的选取了 源鄄香
豆酸袁肉桂酸和阿魏酸为底物袁而对咖啡酸和芥子
酸完全没有反应遥
粤 耘院缘 种酚酸质谱图曰云院缘 种酚酸色谱图袁葬为咖啡酸袁遭为 源鄄香豆酸袁糟为阿魏酸袁凿为芥子酸袁藻为肉桂酸
图 源摇 毛白杨 源悦蕴猿 的 缘 种底物的色谱图和质谱图
远源缘
第 缘 期 饶国栋等院毛白杨 源鄄香豆酸院辅酶 粤连接酶渊源悦蕴猿冤的酶学特征研究
猿摇 结论与讨论
本实验克隆得到的 源悦蕴猿 基因是异于之前所报
道的 源悦蕴员 和 源悦蕴圆袁如图 圆 所示袁和所有其他 源悦蕴 基
因一样袁该基因也存在保守序列 月燥曾 陨 和 月燥曾 陨陨袁这
进一步证明这两序列在 源悦蕴 基因家族中是保守的遥
源悦蕴猿 蛋白的比活力分析结果显示院源悦蕴猿 对香豆酸
表现出较高的活性袁而对芥子酸没有活性袁这也与
源悦蕴员 和 源悦蕴圆 相一致袁但 源悦蕴猿 蛋白的比活力有其自
身的特征袁表现在对阿魏酸的比活性为咖啡酸和肉
桂酸的 圆 倍以上袁且阿魏酸的活性和香豆酸的活性
相当遥 这证明 源悦蕴猿 基因是异于 源悦蕴员 和 源悦蕴圆 的新
基因成员袁且对不同的底物表现出不同的活性遥
在对该 源悦蕴猿 蛋白进行最适温度和最适 责匀 值
测定后发现袁源悦蕴猿 表现出和之前报道的 源悦蕴存在相
似的最适温度特性咱圆缘暂 遥 二者在 源园 益左右达到最大
催化效率曰但值得注意的是 源悦蕴猿 蛋白对碱性环境似
乎存在一定的耐受性袁在 责匀值为 愿援 缘 时达到了活性
的最大值袁而在 责匀 值为 怨 的情况下仍存在 远园豫的
活性袁这说明 源悦蕴猿 基因在抵御高碱环境中起到一定
的作用遥
利用 匀孕蕴悦鄄酝杂 的方法袁研究了 源悦蕴猿 在混合 缘
种底物时对底物的偏好性袁从表 圆 中可以看出袁在混
合底物经 源悦蕴猿 反应后袁咖啡酸完全没有变化袁这说
明在模拟的多底物环境下 源悦蕴猿 会优先催化 源鄄香豆
酸和阿魏酸而不会去催化咖啡酸遥 源悦蕴猿 在多底物
条件下没有催化咖啡酸袁说明 源悦蕴猿 在自然环境下会
选择性的催化某几种底物袁并最终生成相应的木质
素单体或类黄酮遥
参考文献院
咱员暂 魏建华袁 宋艳茹援 木质素生物合成途径及调控的研究进展咱 允暂 援
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咱圆暂 赵华燕袁 魏建华袁 宋艳茹援 木质素生物合成及其基因工程研究
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及反义表达载体的构建咱 允暂 援 安徽农业学报袁圆园园愿袁 猿愿 渊圆园冤院
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咱员园暂 倪志勇袁 王摇 娟袁 吕摇 萌袁 等援 棉花 源鄄香豆酸辅酶 粤连接酶基
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咱员员暂 范丙友袁 陆摇 海袁 蒋湘宁援 烟草 源悦蕴 蛋白免疫荧光定位研究
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咱员猿暂 胡尚连袁 曹摇 颖袁 黄胜雄袁 等援 慈竹 源悦蕴 基因的克隆及其生物
信息学分析咱允暂 援 西北农林科技大学学报院自然科学版袁圆园园怨袁
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咱员远暂 沈桂芳袁 赵摇 衍援 水稻香豆酸院辅酶 粤连接酶基因的分子克隆
及一级结构分析咱允暂 援 中国农业科学袁员怨怨员袁 圆源渊源冤院员 原 苑
咱员苑暂 王念捷袁 程摇 奇援 水稻 源悦蕴基因启动子引导的 郧哉杂在紫外诱导
下的组织特异性表达咱允暂援 中国农业科学袁员怨怨远袁 圆怨渊员冤院苑猿 原苑苑
咱员愿暂 饶国栋袁陆摇 海援 毛白杨 源悦蕴基因家族的克隆与进化分析咱允暂 援
广东农业科学袁圆园员圆袁 猿怨渊愿冤院员源员 原 员源源
咱员怨暂 贾彩红袁 王宏芝袁 杜克久袁 等援 抑制 源悦蕴 基因表达的转基因毛
白杨中木质素含量与茎杆颜色的关系咱 允暂 援 农业生物技术学
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咱圆缘暂 范丙友袁陆摇 海袁蒋湘宁援 重组毛白杨源 香豆酸院悦燥粤连接酶的
酶学特征研究咱允暂援 北京林业大学学报袁 圆园园苑袁 缘渊圆怨冤院远圆 原 远远
苑源缘