全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 293～ 297
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0293-05
ᆑ৊ᴰ佭৊ᶘݡ⫳ԧ㋏ᓎゟঞ⾡䋼⾏ԧֱᄬⷨお
ཷुࡹ, ڄԙᄻ* , ໰ඟଔ, ࠓཧࢌ
( 通化师范学院生物系 ,吉林 通化 134002)
݇䬂䆡 : 宽叶杜香 ; 种质试管保存 ; 均匀设计 ; 根皮苷
Ё೒ߚ㉏ো : S722.3 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-01-19
基金项目 : 吉林省科技厅资助项目 ( 200705C05)
作者简介 : 杨丽娟 ( 1965— ) ,女 ,吉林通化人 ,副教授 ,主要从事长白山区珍稀濒危植物和药用植物细胞生物学研究. E-mail: thpyjw@ 163. com
* 通讯作者 :顾地周 ( 1973— ) , 男 , 吉林通化人 . E-mail: gudizhou@ 163. com
Study on Plant Regeneration System of the Leafstalks and Germplasm
Conservation in vitro of Ledumpalustre Linn. var. dilatatum Wahlanberg
YANG Li-juan, GU Di-zhou, XINTian-peng, XIE Yan-jun
( Department of Biology, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, Jilin, China)
Abstract: The tender leafstalks of Ledumpalustre var. dilatatum were used as explants for the experiment. Uniform
design for the most suitable media for shoots regeneration immediately at base of tender leafstalks, rooting and
germplasm conservation in vitro was screened. The results showed that N6 + ZT 2. 65 mg·L
- 1 + IAA 0. 05 mg·
L- 1 was fits for shoots regeneration, the frequency of shoots induction was higher than 92. 5% ; MS( modified) +
IAA 0. 1 mg·L - 1 + Kt 0. 75 mg· L- 1 for rooting, the rate of rooting was 98% ; N-68 + B9 2. 5 mg· L
- 1
+
Phloridzin 1. 0 mg·L - 1 for germplasm conservation in vitro for 46 months. Stems each with one node were cut from
regenerated shoots and cultured for propagation, and a 90-fold proliferation rate was achieved within 30 days. The
method of “deferring growth with dwarfing”was utilized for germplasm conservation in vitro at normal temperature.
In vitro culture and germplasm conservation in vitro system of Ledum palustre var. dilatatum was established.
Key words:Ledum palustre var. dilatatum; germplasm conservation in vitro; uniform design; phloridzin
宽叶杜香 ( Ledum palustre Linn. var. dilatatum
Wahlanberg) 别名喇叭茶。属杜鹃花科 ( Ericaceae)
杜香属( Ledum L. ) 多年生木本植物。《吉林省野生
动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类重点保
护植物,为急需保护植物。杜香油中有 10 多种药用
化合物 [ 1] ,工业中,可用于制革、作香料等;医学上可
治疗皮肤病、咽喉炎、百日咳等疾病;其头状花序,花
色洁白,也可驯化为观赏植物。对研究植物区系也
具有十分重要的意义。还可开发为耐寒、抗寒及抗
病能力强的园艺新品种,作为高山植物育种的种质
资源。另外,其含有特殊的香气, 是很好的香料,可
用于日用化工、制药皂、脚气水、洗发香波等 [ 2] 。其
在长白山区数量稀少,分布区域十分狭窄,仅在长白
山国家级自然保护区内有较大种群分布。其种子、
扦插等常规繁殖成活率极低,开发及利用受到极大
的限制。因此,在保护好现有野生资源的同时,对这
一野生珍稀植物进行离体快繁和试管保存,以防物
种灭绝。同时,为缩短培养基配方的摸索周期,应用
均匀设计处理和分析数据,以期得到最佳培养条件。
与其同属的其他种植物的离体培养已有报道 [ 3 ]。但
宽叶杜香高效快繁体系和种质试管保存的系统性研
究在国内外迄今未见。
林 业 科 学 研 究 第 23卷
1 ϫॸူֺ֥
1. 1 ໪ỡԧᴤ᭭ⱘ໘⧚
4 月于长白山北坡海拔 1 250 m的针阔混交林
下采宽叶杜香休眠枝条在实验室内水培促使腋芽萌
发。将新生嫩叶柄( 完整 ) 剪下,在超净工作台上用
70%酒精涮洗 30 s, 用含 3% 青霉素的次氯酸钠
( 0. 5% ) 溶液浸泡 10 min,无菌水冲洗 8 次。用无菌
滤纸吸干表面水分,切除被灭菌剂损伤部分后作为
外植体备用 [ 4] 。
1. 2 Ⴝ৊ᶘ෎䚼Ⳉ᥹ݡ⫳㢑㢫ⱘ䇅ᇐ
以 N6 为基本培养基
[ 5]
,附加蔗糖 50 g·L - 1 ,琼
脂粉 9. 5 g·L - 1, pH 值 5. 8,温度( 25 ±2)℃, 光照
强度 1 800 lx,光照周期 14 h·d - 1。将经过处理的
外植体接种到附加不同浓度 ZT和 IAA 的 N6 培养
基上进行嫩叶柄基部直接再生芽苗诱导培养。筛选
最适宜的诱导培养基。统计并计算出芽苗诱导率。
1. 3 ỡ᷾ݡ⫳
以改良 MS( 1 /4 大量元素、1 /3 微量元素、1 /3
铁盐和 1 /2 有机成分 ) 为培养基, 加入蔗糖 15 g·
L
- 1
,琼脂 8. 0 g·L - 1 , pH值 5. 6,并附加不同浓度的
IAA、IBA 和 NAA, 同时加入 Kt 0. 75 mg·L - 1 ( 壮
苗) ,筛选最适宜的生根培养基。
1. 4 ݡ⫳ỡ᷾ᖿ㐕ԧ㋏ⱘᓎゟ
采用节培法进行快繁 [ 6 - 7 ] , 将生根的苗切割成
一叶一段转接到优化后的培养基中,同时进行腋芽
萌发、伸长及生根培养。统计并计算出增殖周期和
倍数。
1. 5 ⾡䋼䆩ㅵֱᄬ
以N-68 为基本培养基,采用“矮化延缓生长”的
方法,将基部含有少量芽锥的丛生芽团接种到不同
培养基上进行试管保存, pH 5. 8, 温度为 ( 20 ±2)
℃,光照强度 1 000 lx,光周期 7 h·d - 1 ,蔗糖 20 g·
L- 1 ,矮化素采用 B9 ,生长延缓剂采用根皮苷。筛选
最适宜的种质试管保存培养基。
1. 6 ᭄᥂ߚᵤ
数据分析与处理采用均匀设计 ( Uniform De-
sign) 软件 [ 8 ]。
2 ࠒڴူד๥
2.1 N6 ෍ݏ෎Ёϡৠ⌧ᑺ ZT੠ IAA 䜡↨ᇍᆑ৊
ᴰ佭Ⴝ৊ᶘ෎䚼Ⳉ᥹ݡ⫳㢑㢫ⱘᕅડ
将宽叶杜香嫩叶柄 ( 基部朝下) 斜插入不同培
养基中进行再生芽苗诱导培养,每个处理接种叶柄
数为 10,重复 3 次。为了提高宽叶杜香芽苗的再生
速度和诱导率,采用均匀设计法,选用 U10 ( 10
2
) 均匀
表( 见表 1) , 考察了细胞分裂素 ZT 和生长素 IAA
( 由预试验可知浓度范围分别为 1. 5 ～ 2. 8 mg·
L
- 1和 0. 05 ～ 0. 10 mg·L - 1 ,当 IAA浓度超过 0. 10
mg·L - 1时嫩叶柄基部有愈伤组织产生,为确保宽
叶杜香经组培快繁后的遗传稳定性, 不采取愈伤组
织再分化产生芽苗的方式。) 浓度交叉配比对诱导率
的影响( 在表和方程中, X1 为 ZT浓度, X2 为 IAA浓
度, Y为诱导率,即诱导出芽苗的叶柄数与接种总数
的比值,每个处理取平均值) ,结果见表 2。
㸼 1 U10( 10
2)಴㋴ঞ∈ᑇ䆒䅵
水平
因素 / ( mg·L - 1 )
X1 X2
1 1. 50 0. 05
2 1. 75 0. 06
3 2. 00 0. 07
4 2. 15 0. 08
5 2. 30 0. 09
6 2. 40 0. 10
7 2. 50 0. 05
8 2. 60 0. 06
9 2. 70 0. 07
10 2. 80 0. 08
㸼 2 U10( 10
2)ഛࣔ䆒䅵ᅲ偠ᅝᥦঞ㒧ᵰ
处理号
因素 / ( mg·L - 1)
X1 X2
Y / %
1 1. 50 0. 05 81. 0
2 1. 75 0. 07 79. 5
3 2. 00 0. 08 80. 0
4 2. 15 0. 10 77. 5
5 2. 30 0. 06 86. 0
6 2. 40 0. 07 85. 0
7 2. 50 0. 09 82. 0
8 2. 60 0. 05 90. 5
9 2. 70 0. 06 89. 0
10 2. 80 0. 08 86. 0
实验所得数据( 表 2) 经均匀设计软件分析处理
后( 表 7)可知,回归方程显著。根据回归方程求出 Y
的最优组合为: X1 =2. 8, X2 = 0. 05,在此组合基础上
求得最优解: y = 91. 8,此解为回归方程的解析解,需
按公式 Y= y±uα·s计算出优化值区间估计为 Y =
91. 8( ±0. 803) ,即 90. 997% ～92. 603%。通过实
验结果发现,当 ZT的浓度高于 2. 7 mg·L - 1诱导率
降低,说明过高的 ZT浓度对叶柄基部直接再生芽苗
起抑制作用,且芽苗非常细弱; 因此, 将最优组合进
492
第 2 期 杨丽娟等: 宽叶杜香叶柄再生体系建立及种质离体保存研究
行改良,即 ZT 2. 65 mg·L - 1和 IAA 0. 05 mg·L - 1 ,
叶柄接种到附加 ZT 2. 65 mg·L - 1和 IAA 0. 05 mg·
L
- 1的 N6 培养基上进行验证试验,培养 30 天, 发现
基部产生锥形突起,继续培养至 55 天锥形突起伸长
为芽苗(图 1a) ,培养至 70 天再生芽苗可伸长至 3. 0
cm以上,且苗壮而整齐,诱导率达 92. 5%以上,在估
计区间内,且比所有实验 Y值都大。因此,宽叶杜香
嫩芽基部直接再生芽苗的最佳诱导培养基为: N6 +
ZT 2. 65 mg·L - 1 + IAA 0. 05 mg·L - 1。
2.2 ᬍ㡃 MS෍ݏ෎Ёϡৠ⌧ᑺ⫳䭓㋴䜡↨ᇍᆑ
৊ᴰ佭㒘෍㢫⫳ḍⱘᕅડ
采用改良 MS并附加生长素 IAA、IBA 和 NAA,
由预试验可知: 3 种生长素浓度分别控制在 0. 1 ～
0. 3、0. 05 ～ 0. 10、0. 01 ～ 0. 05 mg·L - 1之间,过高
的生长素导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤,继续培
养根从膨胀部或愈伤瘤上发出,这样的苗在移栽时,
根随愈伤瘤从苗基部脱落,移栽成活率几乎为零,可
能是根与苗茎的纤维输导组织连接不完整所致,在
培养基中附加 Kt 0. 75 mg·L - 1生根苗较未附加的
粗壮。为了提高宽叶杜香的生根率,采用均匀设计
法,每个处理接种苗数为 10, 重复 3 次, 选用 U1 0
( 10
3
) 均匀表( 见表 3) ,同时考察了生长素 IAA、IBA
和 NAA浓度交叉配比对生根率的影响( 在表和方程
中, X1 为 IAA 浓度, X2 为 IBA 浓度, X3 为 NAA 浓
度, Y为生根率,即生根苗数与接种总数的比值,每
个处理取平均值) ,结果见表 4。
㸼 3 U10( 10
3)಴㋴ঞ∈ᑇ䆒䅵
水平
因素 / ( mg·L - 1)
X1 X2 X3
1 0. 10 0 . 05 0. 01
2 0. 15 0 . 06 0. 02
3 0. 20 0 . 07 0. 03
4 0. 25 0 . 08 0. 04
5 0. 30 0 . 09 0. 05
6 0. 10 0 . 10 0. 01
7 0. 15 0 . 10 0. 02
8 0. 20 0 . 09 0. 03
9 0. 25 0 . 08 0. 04
10 0. 30 0 . 07 0. 05
实验所得数据(表 4)经均匀设计软件分析处理
后(表 7)可知,回归方程显著。根据回归方程求出
Y的最优组合为: X1 = 0. 1,在此组合基础上求得最
优解: y = 92. 1,按公式 Y = y±uα· s计算出优化值
区间估计为 Y= 92. 1( ±7. 98) ,即 84. 12 ～100. 08。
以最优组合做验证试验,待嫩芽基部再生的芽苗长
至 3. 0 cm以上时,将生长健壮的苗切下,然后将其
移入附加 IAA 0. 1 mg·L- 1 + Kt 0. 75 mg·L - 1的改
良 MS培养基中,培养 25 天苗基部开始出现根锥, 7
天后幼苗基部直接发出 3 ～ 5 条不定根( 图 1b) , 50
d后苗高可达 5. 0 cm以上,根和苗的形态、发育均
正常,生根率达 98%。在估计区间内,且比所有实
验 Y值都大。可见, 宽叶杜香最佳生根培养基为:
MS(改良) + IAA 0. 1 mg·L - 1 + Kt 0. 75 mg·L - 1。
㸼 4 U10( 10
3)ഛࣔ䆒䅵ᅲ偠ᅝᥦঞ㒧ᵰ
处理号
因素 / ( mg·L - 1)
X1 X2 X3
Y /%
1 0. 10 0. 09 0. 02 96. 0
2 0. 15 0. 07 0. 03 85. 5
3 0. 20 0. 08 0. 05 82. 0
4 0. 25 0. 08 0. 01 83. 0
5 0. 30 0. 07 0. 02 75. 5
6 0. 10 0. 09 0. 04 92. 5
7 0. 15 0. 06 0. 05 85. 5
8 0. 20 0. 10 0. 01 82. 0
9 0. 25 0. 05 0. 03 79. 0
10 0. 30 0. 10 0. 04 75. 5
2.3 ݡ⫳ỡ᷾催ᬜᖿ㐕ԧ㋏ⱘᓎゟ
因考虑到嫩茎基部直接分化的芽苗较细弱,剪
取生根时可操作性较难和遗传稳定性等因素, 采取
节培法进行植株增殖,待生根的苗伸长至 5. 0 cm以
上时,在超净工作台上打开培养瓶留一叶剪下苗干,
将其切割成一叶一段转接到附加 2. 0 mg·L- 1 GA3
( 有利于茎段腋芽的迅速萌发和伸长 ) 的生根培养
基中,同时进行节伸长及生根培养,培养 15 天苗基
部开始生根, 45 天后苗高可达 5. 0 cm以上,大多数
苗在基部又分化出多株粗壮的苗且伴有根产生 ( 图
1c) 。30 天为 1 个增殖周期, 每瓶增殖倍数平均达
90 以上。随着增殖次数的增加可适当降低生长素
浓度( 以免激素积累) 。因此,宽叶杜香再生植株增
殖培养基为 MS( 改良 ) + IAA 0. 1 mg· L - 1 + Kt
0. 75 mg·L - 1 + GA3 2. 0 mg·L
- 1。
2.4 ⚐㢫੠⿏ḑ
苗生根后,从培养瓶中取出试管苗,在含有 3 mg
·L - 1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂,植入经
200 倍液的多菌灵消毒过的泥炭土和细河砂 ( 3∶1)
混合的基质中,用薄膜覆盖以保湿保温,湿度保持在
80% ,温度控制在( 22 ±2) ℃,每天自然光照 8 h,适
时通风换气,待叶片变为红色后可揭膜,每天早晨喷
洒清水 1 次。成活率达 99% 以上( 图 1d) 。
592
林 业 科 学 研 究 第 23卷
2.5 N-68෍ݏ෎Ёϡৠ⌧ᑺ B9 ঞḍⲂ㣋ⱘѸঝ
䜡↨ᇍᆑ৊ᴰ佭㢑ಶ䆩ㅵֱᄬⱘᕅડ
以 N-68 为培养基, 并附加不同浓度的矮壮素
B9 和生长延缓剂根皮苷对基部含有少量芽锥的丛
生芽团进行试管保存。由预实验可知, B9 浓度控制
在 1. 5 ～ 2. 5 mg·L- 1之间,超过 2. 5 mg·L - 1时苗
叶出现卷曲和茎段缩节幅度极大, 低于 1. 5 mg·
L
- 1时苗趋于明显生长趋势。根皮苷浓度控制在
1. 0 ～3. 0 mg·L - 1之间,超过 3. 0 mg·L- 1时芽苗
很快变黄最终死亡,低于 1. 0 mg·L - 1保存 6 个月以
后恢复生长。为了摸索宽叶杜香试管保存时矮壮素
B9 及根皮苷浓度的最佳配比和降低生长率, 采用均
匀设计法,每个处理数为 60,选用 U1 0 ( 10
2
) 均匀表
(见表 5) ,同时考察了不同浓度的矮壮素 B9 及根皮
苷浓度交叉配比对生长率的影响(在表和方程中, X1
为 B9 浓度, X2 为根皮苷浓度, Y为生长率,即生长长
度与生长后总长度的比值) ,结果见表 6。
㸼 5 U10( 10
2)಴㋴ঞ∈ᑇ䆒䅵
水平
因素 / ( mg·L - 1 )
X1 X2
1 1. 50 1. 00
2 1. 60 1. 25
3 1. 70 1. 50
4 1. 80 1. 75
5 1. 90 2. 00
6 2. 00 2. 25
7 2. 10 2. 50
8 2. 20 2. 75
9 2. 30 3. 00
10 2. 50 1. 00
㸼 6 U10( 10
2)ഛࣔ䆒䅵ᅲ偠ᅝᥦঞ㒧ᵰ
处理号
因素 / ( mg·L - 1)
X1 X2
Y /%
1 1. 50 2 . 50 4. 00
2 1. 60 1 . 50 3. 86
3 1. 70 1 . 00 3. 72
4 1. 80 2 . 25 3. 78
5 1. 90 1 . 25 3. 67
6 2. 00 3 . 00 3. 73
7 2. 10 2 . 00 3. 60
8 2. 20 1 . 00 3. 50
9 2. 30 2 . 75 3. 52
10 2. 50 1 . 75 3. 32
实验所得数据( 表 6) 经均匀设计软件分析处理
后( 表 7) 可知,回归方程显著。根据研究目的 ( 反向
优化) 和回归方程求出 Y的最优组合为: X1 =2. 5, X2
= 1. 0,将其代入方程,求得 y =3. 28,按公式 Y= y±
uα·s计算出优化值区间估计为 Y = 3. 28 ( ±8. 24
e - 2 ) ,即 3. 197 6 ～ 3. 362 4。以最优组合 B9 2. 5 mg
·L - 1 +根皮苷 1. 0 mg·L - 1进行验证试验,结果表
明:将含有丛生芽团接种到附加 B9 2. 5 mg·L
- 1和
根皮苷 1. 0 mg·L - 1的 N-68 培养基上进行保存,保
存 12 个月丛生芽团上的苗平均生长率仅为 3. 15% ,
继续保存至 46 个月后,测其平均生长率为 3. 335%
以下,在估计区间内, 且比所有实验 Y值都小。因
此,宽叶杜香丛生芽团的最佳试管保存培养基为: N-
68 + B9 2. 5 mg·L
- 1 +根皮苷 1. 0 mg·L- 1。采用
此培养基,在常温条件下, 保存时间长达 46 个月以
上,芽苗的形态、质量等均无明显变化( 图 1e) 。
㸼 7 ᆑ৊ᴰ佭㒘෍ঞ䆩ㅵ㢫ֱᄬ৘䰊↉ⱘಲᔦߚᵤ㒧ᵰ
培养阶段 回归方程 样本容量 ( N) 复相关系数 ( R) 检验值 ( Ft) 临界值
芽苗的再生 Y = 78. 1 + 8. 16X1 - 183X2 10 0. 998 9 1 578. 0 F ( 0. 01, 2, 7) = 9. 547
组培苗的生根 Y = 100 - 84X1 10 0. 941 5 62. 41 F ( 0. 01, 1, 8) = 11 . 26
试管苗的保存 Y = 4. 70 - 0. 594X1 + 0 . 071 5X2 10 0. 994 3 304. 6 F ( 0. 01, 2, 7) = 9. 547
注 :显著性水平 α= 0 . 01.
经 46 个月的保存后,将丛生芽团转接到嫩芽基
部直接再生芽苗培养基 N6 + ZT 2. 70 mg·L
- 1 +
IAA 0. 05 mg·L - 1上进行解除保存培养,培养 35 天
后,芽苗叶片由浅绿逐渐转为翠绿色, 继续培养至
60 天, 芽苗回复迅速生长状态,丛生芽团基部再次
分化出大量芽苗,分化率达 98% ,且苗粗壮、生长旺
盛,形态和发育均未出现异常( 图 1f) 。
3 ඉৢ
实验证明,培养基 N6 + ZT 2. 65 mg·L
- 1 + IAA
0. 05 mg·L - 1对宽叶杜香嫩芽基部直接再生芽苗的
诱导效果最好,宽叶杜香离体培养采取新生嫩芽基
部直接再生方式,遗传稳定性好,速度快、分化率高。
培养基 MS( 改良) + IAA 0. 1 mg·L - 1 + Kt 0. 75 mg
·L - 1较适合于宽叶杜香的生根, 在培养基中附加
0. 75 mg·L - 1的 Kt,再生植株较未附加的粗壮且长
692
第 2 期 杨丽娟等: 宽叶杜香叶柄再生体系建立及种质离体保存研究
a. 芽苗直接再生 ; b.生根培养 ; c. 节增殖培养 ; d. 移栽 ;
e. 种质试管保存 ; f. 解除保存后生长情况
图 1 宽叶杜香离体培养及植株再生各阶段的培养物形态
势好。再生植株快繁采取节培法,在生根培养基的
基础上进行优化,附加 2. 0 mg·L - 1的 GA3 有利于
茎段腋芽的迅速萌发和伸长,从而缩短了增殖周期,
提高了增殖倍数。方法简捷, 经济实用, 可操作性
强,达到了再生植株快繁的目标。目前,国内外已有
很多关于植物种质保存方面的报道,大多采取低温
处理、玻璃化、包埋、低温结合弱光照等方法 [ 10 ]。本
研究对宽叶杜香的种质保存采取“矮化延缓生长”
的方法 [ 11 ] , 即以 N-68 为基本培养基且不需加生长
素和细胞分裂素,只需加入矮壮素 B9 2. 5 mg·L
- 1
和根皮苷 1. 0 mg·L - 1对丛生芽团进行试管保存,
这种方法可在常温下保存宽叶杜香种质达 46 个月
以上。通过对解除保存的丛生芽团进行分化和生根
试验证明:解除保存后丛生芽团很快回复生长,并能
很快于基部再生出芽苗且生长旺盛, 分化率达
98% ,形态和发育均未出现异常。应用均匀设计法
处理和分析数据大大缩短了培养基配方的摸索周
期。本研究结果证明:已成功建立了宽叶杜香高效
快繁体系,达到了试管保存的目的。本文结果可对
长白山野生杜香的开发利用、工厂化育苗和种质试
管保存奠定基础。
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