全 文 ：第 38卷第 2期
2011年 3月
浙　江　大　学　学　报(理学版)
Journal of Zhejiang University(Science Edition)
http://www.journals.zju.edu.cn/ sci
V ol.38 No.2
Mar.2011
收稿日期:2010-04-22.
基金项目:国家科技部“国家科技攻关计划引导项目”(2005BA741C).
作者简介:顾地周(1973-),男 ,讲师 ,主要从事长白山区珍稀濒危植物和药用植物研究.
＊通信作者(1964-),男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事森林培育 、林木种子生物学等研究.
DOI:10.3785/ j.issn.1008-9497.2011.02.018
温泉瓶尔小草离体培养及种质试管保存培养基的筛选
顾地周1 , 高捍东2＊ , 陆　爽1 , 冯　颖1
(1.通化师范学院 生物系 , 吉林 通化 134002;2.南京林业大学 森林资源与环境学院 , 江苏 南京 210037)
摘　要:以温泉瓶尔小草新生幼叶为外植体 , 应用均匀设计法筛选其最适宜的离体培养和种质试管保存各阶段培
养基.结果表明 , 最适合愈伤组织诱导的培养基为WPM +ZT0.50 mg · L-1 +2 , 4-D1.90 mg · L -1 , 诱导率为
96.5%;芽苗分化的培养基为WPM +ZT1.70 mg · L-1 +NAA0.10 mg · L-1 , 分化率为 99.0%;生根培养基为
1/4MS+IAA0.05 mg· L-1+IBA0.03 mg · L-1 ,生根率达 97.8%以上;试管保存培养基为WPM+KT1.10 mg· L-1
+根皮苷 3.20 mg· L-1 , 通过 24 个月的保存 , 芽苗生长率仅在 6.5%以下.试验结果证明 ,成功建立了温泉瓶尔小
草离体培养体系 ,常温条件下利用延缓生长的方法在试管内保存温泉瓶尔小草种质是可行的.
关　键　词:温泉瓶尔小草;种质试管保存;均匀设计;根皮苷
中图分类号:S 722　　　　文献标志码:A　　　　文章编号:1008-9497(2011)02-205-06
GU Di-zhou1 , GAO H an-dong2 , ＊ , LU Shuang1 , FENG Ying 1(1.Department of Biology , Tonghua Normal Uni-
versity , Tonghua 134002 , J i lin Province , China;2.College of Forest Resources and Environment , Nan jing For-
estry University , Nan jing 210037 , China)
Screening of media for in vitro culture and germplasm conservation in vitro of Ophioglossum thermale Kom.Journal o f
Zhejiang Univ ersity(Science Edition), 2011 , 38(2):205-210
Abstract:The tender leaves of Ophioglossum thermale Kom.w ere used as explants , all suitable media of culture in
vitro and ge rmplasm conse rvation in vitro were screened through uniform design experiments.The results showed
tha t WPM +ZT0.50 mg · L-1 +2 , 4-D1.90 mg· L-1 w as most suitable fo r callus induction w ith a induction r ate o f
96.5%;WPM+ZT1.70 mg · L -1 +NAA0.10 mg· L-1 was most suitable fo r shoo ts regeneration w ith a regenera-
tion rate o f 99.0%;1/ 4MS+IAA0.05 mg· L-1 +IBA0.03 mg · L-1 w as most suitable for roo ting with a ro oting
rate of 97.8%;WPM+KT1.10 mg · L -1 +phloridzin3.20 mg· L-1w as most suitable fo r in v itro ge rmplasm pre s-
er vation fo r 24 months with a g row ing rate of 6.5%.The re sults pro ve that In v itro culture system of Ophiog los-
sum thermale has been successfully e stablished , and the method o f defering g row th was practical fo r germ plasm con-
serva tion in vitro at normal tempe rature.
Key Words:Ophiog lossum thermale Kom.;germpla sm conserva tion in vitro;uniform design;phlo ridzin
　　温泉瓶尔小草(Ophioglossum thermale Kom .)
又称狭叶瓶尔小草 ,是瓶尔小草科瓶尔小草属多年
生草本植物 ,国家二级重点保护植物.《中国珍稀濒
危保护植物名录(第一册)》中定为渐危种[ 1] , 《吉林
省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类
重点保护植物.它是长白山区野生珍稀濒危药用植
物 ,主治疔疮肿毒 、目赤肿痛 、乳痈 、疔疮 、疥疮身痒 、
跌打损伤 、瘀血肿痛等.其株形优美 ,可引种用于湖
畔 、河岸 、池边等湿地绿化的地被植物.其在长白山
区数量十分稀少 ,分布区域十分狭窄 ,仅生活在长白
山国家级自然保护区北坡海拔 1 750 ～ 1 800 m 的
聚龙温泉附近 ,整个种群不足 300余株 ,常规繁殖难
度极大 ,开发和利用受到极大限制.因此 ,在保护好
现有野生资源的同时 ,利用植物组织培养方法对这
一野生珍贵稀有植物进行离体培养和试管保存 ,以
防本物种灭绝.同时 ,为缩短培养基配方的摸索周
期 ,本试验应用均匀设计分析处理数据 ,以期得到温
泉瓶尔小草离体培养和试管保存各阶段的培养基.
目前关于温泉瓶尔小草的离体培养和种质试管保存
的报道国内外迄今未见.
1　材料与方法
1.1　外植体材料的处理
2004年 7月于长白山国家级自然保护区北坡
海拔 1 750 ～ 1 800 m 的聚龙温泉附近采温泉瓶尔
小草新生嫩叶.在超净工作台上用体积分数为 70%
酒精涮洗 30 s ,用含质量分数为 2%青霉素的次氯
酸钠(0.5%(质量分数))溶液浸泡 3 min ,无菌水冲
洗 10次.用无菌滤纸吸干表面水分 ,切除被杀菌消
毒剂损伤部分后作为外植体备用[ 2] .
1.2　愈伤组织诱导培养基的筛选
以WPM 为基本培养基[ 3] ,附加蔗糖30 g ·L-1 ,
琼脂粉 8.5 g ·L-1 ,pH 5.5 ,温度(22±2)℃,光照
强度 800 lx ,光照周期 8 h ·d-1 .为了提高愈伤组织
的诱导率 ,采用均匀设计法[ 4-8] ,选用 U7(72)均匀表 ,
每个处理接种外植体数为 10 ,重复 3次 ,考察了细胞分
裂素 ZT 和生长素2 ,4-D(由预试验可知质量浓度范围
分别为 0.50 ～ 1.00 mg ·L-1和 1.20 ～ 1.80 mg ·L-1)
质量浓度交叉配比对诱导率的影响.将经过处理的
外植体接种到附加不同质量浓度的 ZT 和 2 , 4-D 培
养基上进行愈伤组织诱导培养.嫩叶培养至 50 d统
计诱导率 ,筛选最适宜的愈伤组织诱导培养基.
1.3　愈伤组织芽苗分化培养基的筛选
以WPM 为基本培养基 ,附加蔗糖 20 g ·L -1 ,
琼脂 8.5 g ·L-1 , pH 5.5 ,温度(22±2)℃,光照强
度 1 100 lx ,光照周期 10 h · d-1 .为了提高愈伤组
织的芽苗分化率 ,选用 U 10(102)均匀表 ,每个处理
接种愈伤组织块数为 30 ,重复 3次 ,考察了细胞分裂
素ZT 和生长素NAA(由预试验可知质量浓度范围分
别为 0.80 ～ 1.50 mg ·L-1和 0.25 ～ 0.70 mg ·L -1)
质量浓度交叉配比对分化率的影响 ,筛选最适宜愈
伤组织芽苗分化的培养基.
1.4　生根培养培养基的筛选
以改良 MS 为培养基 ,蔗糖 10 g · L -1 ,琼脂
8.0 g ·L-1 ,pH 5.8 , 温度(22 ±2)℃, 光照强度
1 000 lx ,光照周期 10 h ·d-1 .由预试验可知 ,采用
1/4MS培养基对组培苗生根效果较好 ,同时附加不同质
量浓度的 IAA 、IBA和 NAA ,由预试验确定3种生长素
质量浓度范围分别控制在 IAA0.05 ～ 0.12 mg ·L-1 、
IBA0.05 ～ 0.10 mg · L-1 和 NAA0.01 ～
0.05 mg ·L -1 .为了提高温泉瓶尔小草的生根速度
和生根率 ,选用 U10(103)均匀表 ,每个处理接种苗
数为 30 ,重复 3次 ,同时考察了生长素 IA A 、IBA 和
NAA 质量浓度交叉配比对生根率的影响 ,筛选最
合适的生根培养基.
1.5　种质试管保存培养基的筛选
采用“延缓生长”的方法 ,以WPM作为基本培养
基 ,添加蔗糖 30 g ·L-1 ,琼脂 8.5 g ·L-1 , pH 5.5 ,
附加不同质量浓度的 K T 与根皮苷(由预实验可知 ,
K T 和根皮苷质量浓度分别控制在 1.50 ～ 2.20 mg
·L-1和 1.00 ～ 3.00 mg · L-1),在温度为(20±2)
℃,光照强度 800 lx ,光周期 8 h ·d-1条件下 ,将带
有小芽苗的愈伤组织接种到不同培养基上进行试管
保存.为了确定降低芽苗生长的 K T 和根皮苷最佳
质量浓度配比 ,选用 U 10(102)均匀表 ,每个处理接
种数为 30 ,重复 3 次 ,同时考察了 K T 和根皮苷质
量浓度交叉配比对生长率(生长长度与生长后总长
度的比值)的影响.筛选最适合种质试管保存的培养
基.
1.6　数据分析
试验设计 、数据分析与处理采用均匀设计法.应
用均匀设计软件(Unifo rm Design V3.0)直接分析.
2　结果与分析
2.1　WPM培养基中不同质量浓度 ZT和 2 ,4-D配
比对温泉瓶尔小草叶片愈伤组织诱导的影响
　　实验所得数据(见表 1)经均匀设计软件分析处
理后(见表 5)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求
出Y 的最优组合为:X 1 =0.50 , X 2 =1.80.在此组合
基础上求得最优解:y =92.4.此解为回归方程的解
析解 ,需按公式Y =y ±uα· s(其中 uα为正态分布
的双侧分位数 , s为剩余标准差)计算出优化值区间
估计为Y =92.4±4.36 ,即88.04%～ 96.76%.通过
计算各方程项对回归的贡献值和贡献率可知(按偏回
归平方和降序排列):U2 =796 ,U 2/U =81.7%;U1 =
98.0 ,U 1/U =10.1%,说明 2 , 4-D对温泉瓶尔小草
愈伤组织诱导的影响远远大于 ZT ,由回归方程可
知 ,2 , 4-D 质量浓度与愈伤组织诱导率呈正相关 ,
206 浙 江 大 学 学 报(理学版)　 第 38 卷　
ZT 质量浓度与愈伤组织诱导率呈负相关 ,猜测 ZT
质量浓度在0.50 mg ·L-1以下和 2 , 4-D质量浓度
在 1.80 mg ·L-1以上的组合配比中有更高的愈伤
组织诱导率 ,又以 ZT 的质量浓度为 0.50 、0.40 、
0.30 、0.20 、0.10 、0.00 mg ·L-1 , 2 ,4-D的质量浓度
为 1.80 、1.90 、2.00 mg · L-1做了 6个处理的补充
试验 ,重复 3 次 ,发现 ZT 在 0.50 mg · L-1和 2 ,4-
D1.90 mg ·L-1时愈伤组织诱导率最高.因此 ,以优
化组合ZT0.50 mg · L-1 +2 ,4-D1.90 mg ·L-1进
行验证试验(接种外植体数为 30),将外植体接种到
附加 ZT0.50 mg · L-1和 2 , 4-D1.90 mg · L-1的
WPM 培养基上 ,重复 3次 ,培养 15 d叶片逐渐增厚
变形 ,继续培养至 45 d 叶片完全脱分化形成致密鲜
绿的愈伤组织 ,且愈伤组织表面有少量米粒状小凸起
出现(见图 1a).诱导率达96.5%,在估计区间范围内 ,
比所有实验Y 值都大.因此 ,温泉瓶尔小草嫩叶愈伤
组织诱导的最佳培养基为:WPM +ZT0.50 mg ·L-1
+2 ,4-D1.90 mg ·L-1 .
表 1　温泉瓶尔小草嫩叶愈伤组织诱导培养基的
U 7(72)均匀设计实验安排及结果
Table 1　U 7(72)facto rs and leve ls design for media of
callus f rom young leaves o f Ophiog lossum thermale Kom.
处理号 ρ(ZT)/(mg · L-1)
X1
ρ(2 , 4-D)/(mg · L-1)
X2
诱导
率/ %
1 0.50 1.60 81.5
2 0.60 1.30 62.7
3 0.70 1.80 89.2
4 0.80 1.50 69.4
5 0.90 1.20 54.0
6 1.00 1.70 76.8
7 1.00 1.40 58.7
2.2　WPM培养基中不同质量浓度 ZT和 NAA配
比对温泉瓶尔小草叶片愈伤组织芽苗分化的
影响
　　实验所得数据(见表 2)经均匀设计软件分析处
理后(见表 5)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求
出Y 的最优组合为:X 1 =1.50 , X2 =0.25 ,在此组合
基础上求得最优解:y =95.8 ,此解为回归方程的解
析解 ,需按公式Y =y ±uα· s计算出优化值区间估
计为Y =95.8±4.51 ,即 91.29%～ 100.31%.计算
各方程项对回归的贡献值和贡献率可知 ,U 1 =335 ,
U1/U =47.0%;U 2 =135 ,U 2/U =18.9%,说明 ZT
对温泉瓶尔小草愈伤组织芽苗再分化的影响大于
NAA ,又因 ZT 质量浓度与分化率呈正相关 , NAA
质量浓度与分化率呈负相关 ,以免 ZT 质量浓度在
1.50 mg ·L-1以上和 NAA质量浓度在 0.25 mg ·L-1
以下有更高的芽苗分化率 , 又以 ZT 质量浓度为
1.50 、1.60 、1.70 、1.80 、1.90 、2.00 mg ·L -1 , NAA
质量浓度为 0.25、0.20 、0.15、0.10 、0.05、0.00 mg ·L-1
做了 6个处理的补充试验 ,重复 3 次 , 发现 ZT 在
1.70 mg ·L -1和 NAA 在 0.10 mg · L-1时愈伤组
织分化率最高.因此 ,以优化组合 ZT1.70 mg ·L-1
+NAA0.10 mg ·L -1进行验证试验(接种接种愈
伤组织块数为 30), 将愈伤组织接种到附加 ZT
1.70 mg · L-1和 NAA 0.10 mg ·L-1的 WPM 培
养基上 ,重复 3次 ,愈伤组织培养 10 d后 ,表面米粒
状小凸起逐渐增多 ,继续培养至 25 d ,小凸起逐渐伸
长为芽苗(见图 1b),培养至 38 d苗高可达 1.00 cm ,
分化率达 99.0%以上 ,在估计区间范围内 ,比表 2
中 10个处理的实验Y 值都大.因此 ,温泉瓶尔小草
嫩叶愈伤组织芽苗再分化的最佳培养基为:WPM +
ZT1.70 mg ·L-1 +NAA0.10 mg ·L-1 .
表 2　温泉瓶尔小草愈伤组织芽苗分化培养基的
U 10(102)均匀设计实验安排及结果
Table 2　U10(102)factors and levels design fo r media of shoots
differentia tion from callus of Ophioglossum thermale Kom.
处理号 ρ(ZT)/(mg· L-1)
X 1
ρ(NAA)/(mg· L-1)
X2
分化
率/ %
1 0.80 0.55 65.0
2 0.90 0.35 78.5
3 1.00 0.70 71.5
4 1.10 0.50 79.0
5 1.20 0.30 87.0
6 1.30 0.65 79.5
7 1.40 0.45 87.5
8 1.50 0.25 95.0
9 0.80 0.60 69.5
10 0.90 0.40 77.0
2.3　改良MS培养基中不同浓度生长素配比对温
泉瓶尔小草组培苗生根的影响
　　实验所得数据(见表 3)经均匀设计软件分析处
理后(见表 5)可知 ,回归方程显著.同理根据回归方
程求出Y 的最优组合为:X 1 =0.05 , X 2 =0.05 ,在此
组合基础上求得最优解:y =92.7 ,按公式Y =y ±uα
· s计算出优化值区间估计为 Y =92.7±5.62 ,即
87.08%～ 98.32%.同理 ,计算各方程项对回归的贡
献值和贡献率可知(按偏回归平方和降序排列),U2
=156 ,U 2/U =92.7%;U 1 =32.8 ,U 1/U =19.5%.
207　第 2 期 顾地周 , 等:温泉瓶尔小草离体培养及种质试管保存培养基的筛选
说明 IBA 对温泉瓶尔小草组培苗生根的影响远远
大于 IAA ,又因 IAA 和 IBA 质量浓度均与生根率
呈负相关 ,以免 IAA 和 IBA 的质量浓度在 0.05 mg
·L-1以下有生根率的峰值 ,以 IA A和 IBA 的质量
浓度分别为0.05 、0.04 、0.03 、0.02 、0.01 、0.00 mg
·L-1做了 6 个处理的补充试验 ,重复 3 次 ,发现
IAA 在 0.05 mg ·L -1和 IBA0.03 mg · L-1时组培
苗生根率最高.因此 ,以优化组合 IAA0.05 mg ·
L
-1 +IBA 0.03 mg ·L-1做验证试验 ,重复 3次 ,待
芽苗长至 1.00 cm以上时 ,将生长健壮的苗切下 ,然
后将其移入附加 IAA0.05 mg ·L -1和 IBA0.03 mg
·L-1的 1/4MS 培养基中 ,无根苗培养 25 d在基部
或茎近基部处直接发出 3 ～ 5 条不定根并迅速伸长
(见图 1c),继续培养 45 d后 ,根变得粗壮肉质化 ,全
部产生了侧根 ,根和苗的形态 、发育均正常(见图
1c , d).生根率达 97.8%以上 ,在估计区间范围内 ,
且比表 3中所有实验 Y 值都大.可见 ,温泉瓶尔小
草最佳生根培养基为:1/4M S+IAA0.05 mg · L-1
+IBA 0.03 mg ·L-1 .
表 3　温泉瓶尔小草芽苗生根培养基的
U 10(103)均匀设计实验安排及结果
Table 3　U 10(103)factor s and levels design fo r media
o f shoots ro oting of Ophioglossum thermale Kom.
处理号
ρ(IAA)
/(mg· L-1)
X 1
ρ(IBA)
/(mg · L -1)
X2
ρ(NAA)
/(mg · L-1)
X 3
生根
率/ %
1 0.05 0.09 0.02 85.5
2 0.06 0.05 0.03 95.0
3 0.07 0.08 0.05 83.0
4 0.08 0.06 0.01 87.5
5 0.09 0.07 0.02 85.5
6 0.10 0.07 0.04 82.0
7 0.11 0.06 0.05 85.0
8 0.12 0.08 0.01 81.0
9 0.06 0.05 0.03 89.0
10 0.05 0.10 0.04 77.5
2.4　WPM培养基中不同质量浓度 KT和根皮苷
对温泉瓶尔小草试管苗生长的影响
　　实验所得数据(见表 4)经均匀设计软件分析处
理后(见表 5)可知 ,回归方程显著.根据研究目的进
行反向优化和回归方程求出Y 的最优组合为:X 1 =
1.50 , X 2 =3.00 ,将其代入方程 ,求得 y =0.401 ,按
公式Y =y ±uα· s计算出优化值区间估计为 Y =
0.401±20.0 ,即 0.00%～ 20.401%.通过计算各方
程项对回归的贡献值和贡献率可知(按偏回归平方
和降序排列),U 2 =1.18e+3 ,U2/U =74.9%;U 1 =
402 ,U 1/U =25.6%,说明根皮苷对温泉瓶尔小草芽
苗生长的影响大于 KT ,由回归方程可知 , KT 的质
量浓度与生长率呈正相关 ,根皮苷的质量浓度与生
长率呈负相关 ,根据研究的目的需要反向分析 , K T
的质量浓度在1.50 mg ·L-1以下和根皮苷的质量
浓度在 3.20 mg ·L-1以上可能有更低的生长率 ,又
以 KT 的质量浓度为 1.50 、1.30 、1.10 、0.90 、0.70 、
0.50 、0.30 、0.10 、0.00 mg ·L-1 ,根皮苷质量浓度为
3.00 、3.10 、3.20 、3.30 、3.40 、3.50 mg ·L-1做了 9个
处理的补充试验 ,重复 3次 ,发现 KT 在1.10 mg ·L-1
和根皮苷 3.20 mg · L-1时芽苗生长率最低.因此 ,
将含有芽苗的愈伤组织接种到附加 KT1.10 mg ·L-1
和根皮苷 3.20 mg ·L-1的WPM 培养基上进行保
存 ,保存 24个月愈伤组织上的芽苗平均生长率仅为
6.5%以下 ,且芽苗生长极其缓慢 ,几乎不分化 ,愈伤
组织的形态 、质量等均无明显变化(见图 1e).在估
计区间范围内 ,比所有实验Y 值都小 ,可见 ,温泉瓶
尔小草最佳保存培养基为:WPM+KT1.10 mg ·L-1
+根皮苷3.20 mg ·L-1 .
表 4　温泉瓶尔小草种质试管保存培养基的
U 10(102)均匀设计实验安排及结果
Table 4　U10(102)Uniform design test plan and
result fo r media for g erm plasm conserv ation
in vitro of Ophioglossum thermale Kom.
处理号ρ(KT)/(mg· L-1)
X 1
ρ(根皮苷)/(mg· L-1)
X2
生长
率/ %
1 1.50 2.50 13.0
2 1.60 1.50 25.5
3 1.70 1.00 32.5
4 1.80 2.25 18.0
5 1.90 1.25 31.0
6 2.00 3.00 11.0
7 2.10 2.00 26.0
8 2.20 1.00 42.0
9 2.10 2.75 28.0
10 2.20 1.75 63.0
　　经 24个月的保存后 ,将试管苗转接到愈伤组织
芽苗分化培养基 WPM +ZT1.70 mg · L -1 +
NAA0.10 mg · L-1上进行解除保存再分化培养 ,
培养 40 d后 ,愈伤组织由浅绿逐渐转为翠绿色 ,继
续培养至 65 d ,愈伤组织分化出大量芽苗 ,且苗粗
壮 、生长旺盛 ,形态和发育均未出现异常(见图 1f).
208 浙 江 大 学 学 报(理学版)　 第 38 卷　
表 5　温泉瓶尔小草组培及种质试管保存各阶段的回归分析结果
Table 5　Reg ression analy sis result of in v itro culture and germ plasm conserv ation in v itro in
va rious stages of Ophioglossum thermale Kom.
培养阶段 回归方程 样本容量 复相关系数 剩余标准差 检验值 临界值
愈伤组织诱导 Y=6.17-20.9 X1 +53.7X2 7 0.995 0 1.570 197.10 F(0.05, 2, 4)=6.944
愈伤组织分化 Y =63.6+26.0X1 -27.4X 2 10 0.982 7 1.910 98.30 F(0.05, 2, 7)=4.737
组培苗的生根 Y=109-77.3X1 -225X2 10 0.900 0 2.380 14.93 F(0.05, 2, 7)=4.737
试管保存 Y =8.24+26.6X1 -15.9X 2 10 0.870 5 8.470 10.95 F(0.05, 2, 7)=4.737
　　注 显著性水平α=0.05
图 1　温泉瓶尔小草离体培养和种质试管保存各阶段培养物的形态
Fig.1　Morphostructure of culture s of micropr opagation and ge rmplasm conser vation
in vitro at var ious stages of Ophioglossum thermale Kom.
a.温泉瓶尔小草嫩叶诱导产生的愈伤组织;b.愈伤组织芽苗分化的培养;c , d.生根培养;e.种质试管保存;f.解除保存后生长情况
3　讨论与结论
试验结果可以 证明 , 培养基 WPM +ZT
0.50 mg ·L-1 +2 , 4-D1.90 mg · L-1对温泉瓶尔
小草嫩叶愈伤组织的诱导效果最好 ,愈伤组织诱导
率达到了预期效果.根据诱导产生的愈伤组织形态
发现愈伤组织表面有少量米粒状小凸起出现 ,有利
于进一步芽苗分化培养 ,经过后期愈伤组织在培养
基WPM +ZT1.70 mg ·L-1 +NAA0.10 mg · L-1
上的培养证明了小凸起发育成芽锥进而伸长为芽
苗 ,提高了芽苗的分化速度和分化率.培养基1/4MS
+IAA0.05 mg · L-1 +IBA0.03 mg ·L-1较适合
于温泉瓶尔小草的生根 ,同时使用两种低浓度的生
长素有利于组培苗的生根且粗壮而利于苗的生长.
而过高的生长素导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤 ,
继续培养根从膨胀部或愈伤瘤上发出 ,这样的苗在
移栽时 ,根随愈伤瘤从苗基部脱落 ,移栽成活率几乎
为零 ,可能是根与苗茎的纤维疏导组织连接不完整
所致.目前 ,国内外已有很多关于植物种质保存方面
的报道 ,大多采取低温处理 、玻璃化 、包埋 、低温结合
弱光照等方法[ 9] .本研究对温泉瓶尔小草的种质保
存采取“延缓生长”的方法 ,只需在 WPM 培养基中加
入KT1.10 mg ·L-1和根皮苷 3.20 mg ·L-1延缓愈
伤组织上芽苗的生长达到试管保存的目的 ,在培养
基中辅以适当浓度的 KT 有利于调控温泉瓶尔小草
对根皮苷的吸收 、转化和代谢 ,试验发现当根皮苷超
过 3.20 mg ·L-1时愈伤组织很快变为黄褐色 ,最终
导致芽苗死亡 ,低于 1.0 mg ·L-1保存 14个月以后
恢复生长.利用这种方法可在常温下保存温泉瓶尔
小草种质达 24个月以上 ,解除保存后愈伤组织很快
回复生长 ,并能分化出大量芽苗且苗粗壮而生长旺
盛 ,形态和发育均未出现异常 ,这可能是愈伤组织上
的细胞在保存过程中得到了充足休眠等原因.试验
成功完成了温泉瓶尔小草的离体培养和种质试管保
存培养基的筛选 ,达到了预期目的.同时 ,应用均匀
设计处理 、分析数据和再试验大大缩短了培养基配
方的摸索周期.本文结果对温泉瓶尔小草开发和利
用可能有一定的参考意义.
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