全 文 ：　　收稿日期: 2000203213
基金项目: 国家自然科学基金项目 (39870619) 和国际科学基金项目 ( In ternational Foundation fo r Science, IFS) (D ö
294721)
作者简介: 甘四明 (19702) , 男, 四川邻水人, 助理研究员, 农学博士.
　　文章编号: 100121498 (2001) 0220125206
RA PD 标记在桉属种间杂交
一代的分离方式研究
甘四明1, 施季森2, 白嘉雨1, 吴坤明1, 吴菊英1
(1. 中国林业科学研究院 热带林业研究所, 广东 广州　510520;
2. 南京林业大学 林木遗传与基因工程实验室, 江苏 南京　210037)
摘要: 以 1 个尾叶桉×细叶桉全同胞家系的 2 个亲本和 212 个子代为材料, 利用 RA PD 分子标记
技术进行了RA PD 标记在桉树中的分离方式研究。结果表明: 7 个随机引物共扩增出 40 个标记,
标记在 F 1 代的分离方式可以分为两类: 符合孟德尔方式和偏离孟德尔方式。符合孟德尔方式的标
记包括: 亲本均有而在子代中不分离的 9 个 (在这类位点上代表的杂交组合为AA ×AA、AA ×A a
或A a×AA ) , 亲本间呈多态性而在子代中不分离的 7 个 (aa×AA 或AA ×aa) , 亲本间均有而在子
代中 3∶1 分离的 2 个 (A a×A a) , 亲本间呈多态性且在子代中 1∶1 分离的 9 个 (A a×aa 或 aa×
A a)。偏分离的标记包括: 亲本间呈多态性而在子代中偏离 1∶1 分离的 12 个, 两亲本均有而在子
代中偏离 3∶1 分离的 1 个。亲本间呈多态性且在子代中 1∶1 分离的位点在拟测交策略中可以用
于遗传连锁图谱构建, 这为利用 RA PD 标记构建桉树遗传连锁图谱提供了理论支持。
关键词: RA PD 标记; 桉树属; 分离
中图分类号: S722. 3　　　　文献标识码: A
随机扩增多态性DNA (R andom amp lif ied po lymo rph ic DNA , RA PD ) 分子标记技术自
1990 年产生以来[1, 2 ] , 因操作简捷、多态性丰富而在生命科学各领域广为应用[3, 4 ]。林木上,
RA PD 标记已成功用于遗传连锁图谱构建[5 ]。RA PD 为显性标记, 而林木常用的作图群体为
F 1 谱系, 所以采用的作图策略为拟测交策略 (P seudo2testcro ss st ra tegy) [6, 7 ] , 即某一亲本上杂
合 (显示该位点谱带, 基因型A a) 而另一亲本上隐性纯合 (无该位点谱带, 基因型 aa) 的位点
(谱带)在其全同胞子代中将呈 1∶1 分离, 类似测交的分离方式。因此, RA PD 标记连锁图谱构
建以前, 进行RA PD 位点的遗传分离研究可以为遗传图谱构建提供理论基础。
一般认为, RA PD 标记在杂种一代中的分离符合孟德尔遗传规律[8 ] , 但偏分离的情况在拟
南芥 (A rabid op sis tha liana H eynh. ) [9 ]和针叶树[6 ]等研究中仍然存在, 即使对完全或部分双列
杂交材料的研究中, 偏分离位点的比例仍较高[8, 10 ]。本研究利用尾叶桉 (E uca lyp tus u rop hy lla
S. T. B lake)×细叶桉 (E. tereticorn is Sm ith)的 2 个亲本和 212 个子代个体, 在较大群体材料
林业科学研究　2001, 14 (2) : 125～ 130　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
F orest R esearch　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
的基础上分析RA PD 标记在杂种子代中的分离模式, 以期为桉树RA PD 标记连锁图谱构建提
供理论上的分析。
1　材料与方法
1. 1　材料
研究材料包括尾叶桉和细叶桉 2 个亲本及其杂交产生的 212 个全同胞子代。1996 年秋进
行控制授粉, 1997 年夏采种育苗, 9 月底移苗, 11 月底采叶样。
1. 2　D NA 提取和 RAPD 反应
取各子代和亲本叶样 1 g 左右用于DNA 提取。DNA 提取采用CTAB 法[11 ] , RA PD 反应
参考甘四明等的方法[12 ]。备选引物 40 个 (O PA P01～ 20 和O PA S01～ 20) (Operon 公司) , 利用
2 个亲本和 6 个子代进行引物筛选, 筛选出多态性高、能扩增清晰明亮谱带的 7 个引物用于正
式扩增 (表 1)。
表 1　正式扩增的随机引物及扩增位点
引　　物 序　　列 N t N p s N p ns N np s
O PA P07 5’A CCA CCCGCT 3’ 7 5 1 0
O PA P10 5’T GGGT GA TCC 3’ 5 2 1 1
O PA P12 5’GTCT TA CCCC 3’ 5 1 2 0
O PA S10 5’CCCGTCTA CC 3’ 7 2 3 1
O PA S14 5’TCGCA GCGT T 3’ 5 3 0 0
O PA S18 5’GT T GCGCA GT 3’ 6 4 0 1
O PA S20 5’TCT GCCT GGA 3’ 5 4 0 0
合　　计 7 40 21 7 3
　　注: N t 为扩增出的总谱带数; N p s为在 2 个亲本间呈多态性且在子代中分离的谱带数;N p ns为在 2 个亲本间呈多态性而
在子代中不分离的谱带数;N np s为 2 个亲本俱有而在子代中分离的谱带数。
1. 3　RAPD 标记的分离分析
RA PD 谱带用“0”代表无、“1”代表有进行统计。每条谱带名称包括引物名、谱带长度和强
度。谱带强度分为 3 个等级, 3 为最强 (表 2)。假设RA PD 标记为一对等位基因按显性方式遗
传, 则具有某条谱带的亲本在该位点上的基因型为AA 或A a, 而无该谱带的亲本为 aa, 由此
推断该谱带在子代中的理论分离。用 ς2 进行适合度检验, Α= 0. 05。
2　结果与讨论
2. 1　RAPD 扩增结果
从 40 个引物中筛选出 7 个用于正式扩增。7 个引物共扩增出 40 条谱带, 表 1 列出了不同
引物扩增的总谱带数 (N t)、亲本间多态性且在子代中分离的谱带数 (N p s)、亲本间呈多态性而
在子代中不分离的谱带数 (N p ns)和亲本均有而在子代中分离的谱带数 (N np s)。不同引物扩增的
N t 和N p s有差异, 引物O PA P07 扩增的N t 和N p s最高, 这表明进一步筛选引物的必要。图 1 显
示了用引物O PA P07 对 2 个亲本和部分子代的扩增结果。
扩增谱带的长度介于 1. 8kb (引物O PA S20)～ 230bp (引物O PA S10)。40 条谱带中, 在亲
本和子代中均无多态性的有 9 条 (22. 5% ) , 在亲本中有多态性而在子代中不分离的有 7 条
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(18. 5% ) (包括母本特有的 3 条和父本特有的 4 条) , 亲本中呈多态性且在子代中分离的有 21
条 (52. 5% ) , 亲本中均有而在子代中分离的有 3 条 (7. 5% )。共有 28 (21+ 7) 条谱带 (70. 0% )
在亲本中呈多态性, 24 条 (60. 0% ) 在子代中分离, 这也表明亲本的多态性较高。就杂合性而
言, 母本总谱带 (位点) 28 条, 在子代中分离的杂合位点 16 个, 杂合度为 57. 1% ; 父本总谱带
(位点) 24 条, 杂合位点 11 个, 杂合度为 45. 8% , 表明亲本的杂合度较高, 选择该家系用于作图
是可行的。
　　箭头示在子代中分离的标记谱带 (从上到下依次为O PA P072830ö3、2490ö2、2420ö3、2400ö3 和2250ö2)。A
板第 2 泳道为母本尾叶桉 (因缺失补在D 板第 1 泳道) , 第 3 泳道为父本细叶桉,A 板其余泳道及B 板和C 板均
为子代, D 板依次为前三板缺失的样品的补充。A 板第 1 泳道和D 板最后泳道为标记 DNA 长度和M arker
(M B I) , 从上到下显示的谱带长度依次为 1031、900、800、700、600、500、400 和 300 bp。
图 1　引物O PA P07 对 2 个亲本和 99 个子代的扩增结果
2. 2　RAPD 标记的分离
不同RA PD 标记在子代中的分离比例见表 2。利用 ς 2 检验RA PD 标记的遗传和分离是否
符合一对等位基因的孟德尔方式, 显著水平为 Α= 0. 05。
24 个分离位点按其分离特点和适合度检验可以分为以下 4 组: 第É 组 9 个位点符合 1∶1
分离; 第Ê 组 2 个位点符合 3∶1 分离; 第Ë 组 12 个位点偏离 1∶1 分离, 其中 10 个偏母本分
离, 2 个偏父本分离; 第Ì 组 1 个位点偏离 3∶1 分离。可见, 本研究中偏分离的比例较高, 共有
13 个位点偏分离。值得指出的是, 偏离 1∶1 分离的 12 个位点中 (第Ë 组) , 绝大多数位点的分
离表现为一种趋母本的现象。例如, 位点O PA P072830ö3 为母本特有谱带, 在子代中大多数个
体具有此位点 (125∶87, p < 0. 01) ; 而位点O PA P072490ö2 为父本特有谱带, 母本没有, 则子
代中大多数个体表现与母本一致 (66∶146, p < 0. 005)。可能母本对RA PD 标记的遗传有一定
的影响。
RA PD 分子标记技术的一个不足是扩增中随机引物在退火时容易与模板发生错配, 导致
重复性差[13 ]。这可以通过严格控制RA PD 实验体系的扩增程序和只记录重复性好的强带得到
改进。本研究中, 补充的几个样品都是另外配制和扩增的 (图 1 的D 板) , 其带型与其它几个板
基本一致, 说明重复性较好, 与正式扩增的样品具有较高的可比性。
本研究的偏分离位点的比例仍相当高。分子标记位点的偏分离现象已在较多植物中报
道[14 ]。其可能原因是: (1) 非等位位点的共带现象 (Co2m igrat ing bands) , 尤其对 RA PD 和
A FL P 等高产标记系统[15 ]; (2)研究群体偏小[6 ]; (3)杂种中有配子选择或隐性纯合致死的等位
721第 2 期　　　　　　　　　甘四明等: RA PD 标记在桉属种间杂交一代的分离方式研究　　　　　　　　　　　
表 2　24 个 RAPD 位点的分离和适合度检验
分组 (位点数) 位　　点 母本 父本 分离比 (1s∶0s) 期望比值 ς2 概　　率
第É 组 O PA P072420ö3 1 0 107∶105 1∶1 0. 004 7 > 0. 90
(9) O PA P102670ö2 1 0 101∶111 1∶1 0. 382 1 0. 50～ 0. 75
O PA P122580ö3 1 0 117∶95 1∶1 2. 080 2 0. 10～ 0. 25
O PA S1021000ö2 1 0 104∶108 1∶1 0. 021 2 0. 75～ 0. 90
O PA S102880ö3 1 0 119∶93 1∶1 1. 474 1 0. 10～ 0. 25
O PA S182580ö2 1 0 120∶92 1∶1 3. 438 7 0. 05～ 0. 10
O PA S182550ö3 1 0 118∶94 1∶1 2. 495 3 0. 10～ 0. 25
O PA S202500ö2 0 1 102∶110 1∶1 0. 231 1 0. 50～ 0. 75
O PA S202490ö2 1 0 92∶120 1∶1 3. 438 7 0. 05～ 0. 10
第Ê 组 O PA S182290ö1 1 1 151∶61 3∶1 1. 415 1 0. 10～ 0. 25
(2) O PA S1021200ö3 1 1 171∶41 3∶1 3. 327 0 0. 05～ 0. 10
第Ë 组 O PA P072830ö3 1 0 125∶87 1∶1 6. 457 5 0. 005～ 0. 013
(12) O PA P072490ö2 0 1 66∶146 1∶1 29. 438 7 < 0. 0053
O PA P072400ö3 0 1 67∶145 1∶1 27. 967 0 < 0. 0053
O PA P072250ö2 0 1 77∶135 1∶1 15. 325 5 < 0. 0053
O PA P102570ö1 1 0 123∶89 1∶1 5. 136 8 0. 01～ 0. 0253
O PA S1421350ö2 0 1 71∶141 1∶1 22. 457 5 < 0. 0053
O PA S142950ö3 1 0 138∶74 1∶1 18. 721 7 < 0. 0053
O PA S182490ö2 1 0 139∶73 1∶1 19. 929 2 < 0. 0053
O PA S2021030ö2 0 1 73∶139 1∶1 19. 929 2 < 0. 0053
O PA S202430ö2 1 0 136∶76 1∶1 16. 419 8 < 0. 0053
O PA S142750ö2 0 1 146∶66 1∶1 29. 438 7 < 0. 0053
O PA S182630ö3 0 1 145∶67 1∶1 29. 967 0 < 0. 0053
第Ì 组 (1) O PA P102530ö2 1 1 134∶78 3∶1 15. 100 6 < 0. 0053
　　注: 3 示显著偏离 0. 05 水平。
基因的存在[16～ 18 ]; (4)与研究材料有关, 如种间杂种比种内杂种的偏分离比例大[19 ]; (5)单个亲
本的细胞质基因组的细微影响[10 ]; (6) 染色体在杂交过程中存在结构重排、缺失、插入和突
变[20, 21 ]。本研究中, 亲本树种尾叶桉与细叶桉遗传差别较大, 尾叶桉主要天然分布于印度尼西
亚及附近岛屿, 细叶桉主要天然分布于澳大利亚, 且两树种在树皮颜色、叶色、叶形、叶子大小
及果形等方面也差别明显, 因此亲本的较大遗传差异可能是导致RA PD 标记偏分离严重的重
要原因。另外, H eun 和H elen t jaris[10 ]为了解决偏分离的问题, 提出判读位点时可把RA PD 标
记分为“质量多态性”(U nam b iguou s po lymo rph ism ) 和“数量多态性”(Q uan t ita t ive po lymo r2
ph ism ) , 前者指直观的有ö无谱带, 后者指谱带强度的多态性, 即把相同长度的片段按强度不
同而分别统计。这虽可在一定程度上减少偏分离位点的数量, 但在实际操作中, 谱带强弱的判
断有很大的主观性, 所以在实用中难于把握, 较少应用。
有的研究报道, 子代中有非亲RA PD 标记出现, 这是因为两亲本的不同长度的等位核苷
酸序列在子代形成异源双链体[22, 23 ]。但在本研究中, 子代的所有谱带均可在亲本中找到, 亲本
的谱带也可在子代中找到, 表明RA PD 位点具有可靠的遗传性。同时, 有一定数量的谱带服从
孟德尔的一对等位基因的遗传规律, 表明RA PD 可以作为遗传标记[10, 22 ] , 并且第É 组的位点
是将来遗传图谱构建的有用标记。这为利用RA PD 标记进行桉树遗传连锁图谱构建提供了理
论支持。
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921第 2 期　　　　　　　　　甘四明等: RA PD 标记在桉属种间杂交一代的分离方式研究　　　　　　　　　　　
Segrega tion of RAPD M arkers: A Case in
In terspec if ic Cross of E uca lyp tus
GA N S i2m ing 1, S H I J i2sen2, B A I J ia2y u 1, W U K un2m ing 1, W U J u2y ing 1
(1. Research Insitu te of T rop ical Fo restry, CA F, Guangzhou　510520, Guandong, Ch ina;
2. N an jing Fo restry U niversity, N an jing　210037, J iangsu, Ch ina)
Abstract: Seven 102m er p rim ers w ere u sed fo r analysis on segregat ion of RA PD (R andom
amp lif ied po lymo rph ic DNA ) m arkers in an in terspecif ic F 1 popu la t ion of E uca lyp tus u rop hy l2
la × E. tereticorn is, including 2 paren ts and 212 sib s. O f the to ta l 40 fragm en ts amp lif ied,
28 (70% ) w ere po lymo rph ic betw een paren ts and 24 (60% ) segregan t in the sib s, ind ica t ing
a h igh level of po lymo rph ism and heterozygo sity a t RA PD loci betw een the tw o paren ts.
T here w ere 27 m arkers segregat ing in a M endelian pat tern, including 9 m arkers p resen t ing
in bo th paren ts and all sib s ( rep resen t ing a geno typ ic com b inat ion AA ×AA , AA ×A a o r A a
×AA ) , 7 m arkers po lymo rph ic betw een the paren ts bu t homo logou s in all sib s (AA ×aa o r
aa×AA ) , 2 m arkers p resen t ing in bo th paren ts and segregat ing in the sib s in a ra t io 3∶1
(A a×A a) , and 9 m arkers po lymo rph ic betw een the paren ts and segregat ing in the sib s in a
ra t io 1∶1 (A a×aa o r aa×A a). T here w ere 13 m arkers segregat ing in a nonm endelian pat2
tern, including 12 m arkers po lymo rph ic betw een paren ts bu t segregat ing in the sib s in a ra t io
d isto rt ive from 1∶1, and 1 m arkers homo logou s in bo th paren ts bu t segregat ing in the sib s
in a ra t io d isto rt ive from 3∶1. T ho se m arkers that w ere po lymo rph ic betw een paren ts and
segregat ing 1∶1 in the sib s, fo llow ing a p seudo2testcro ss configu ra t ion, cou ld be po ten t ia lly
u sefu l fo r genet ic linkage m ap con struct ion of the rep resen ta t ive species, w h ich w ou ld lay a
theo ret ica l basis fo r genet ic linkage m ap con struct ion u sing RA PD m arkers and F 1 popu la2
t ion.
Key words: RA PD m arker; E uca lyp tus; segregat ion
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