全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (5) : 593～598
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0520741206
印楝异交率和基因流的分析
吴疆翀 , 彭兴民 , 郑益兴 , 张燕平 3
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南 昆明　650224)
摘要 :利用 RAPD分子标记 ,对引种于云南省元谋县和红河县的印楝种群进行父本分析。用 12个引物对 4个种群
共 7株树体测定了异交率 ,平均异交率为 96. 27% ,异交率 95%置信区间为 93. 50% ～99. 05%。对其中红河县勐龙
乡大黑公种群的 2株母本 E和 F及周围 96株父本进行了基因流测定 ,遗传排除法确定了各有 2个父本向母本 E和
F传粉 ,最大似然法分析得出有 3个父本向母本 E传粉 ,有 10个父本向母本 F传粉。有 52. 9%的传粉集中在以母
本为圆心 ,半径 30～50 m的范围内。来自主风方向和逆风方向的传粉在数量上无差异。
关键词 :印楝 ; RAPD;异交率 ;基因流 ;父本分析
中图分类号 : S792. 33　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2007212210
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2006BAD18B03)和云南省科技计划项目 (2005YX20)
作者简介 : 吴疆翀 (1982—) ,男 ,云南昆明市人 ,硕士生.3 通讯作者
O utcrossing Ra te and Gene Flow Estima tion of A zadirach ta indica
WU J iang2chong, PENG X ing2m in, ZHENG Yi2xing, ZHANG Yan2ping
(Research Institute of Resource Insects, CAF, Kunm ing　650224, Yunnan, China)
Abstract: Random Amp lified Polymorphic DNA was used to estimate the outcrossing rate and gene flow of
Azad irach ta ind ica introduced to Yuanmou County and Honghe County, Yunnan, China. Seven trees from four
populations were chosen as the maternal parents, and each of their ripe seeds was collected. After germ ination, 23
seedlings of each maternal tree were random ly selected as sib code to estimate the outcrossing rate. Each p rimer
identified outcrossed offsp ring, characterized by DNA fragments that maternal trees do not have. The cumulative
outcrossing rate of each mother tree was calculated by a total of 12 p rimers. The average outcrossing rate of neem
(Azad irach ta ind ica A. Juss. ) was 96. 27% , with a high 95% confidence interval from 93. 50% through 99. 05%.
The Daheigong population was also used for a gene flow test among the 4 populations. Two mother trees, E and F,
were maternal parents, and 96 trees around them were paternal parents. Two methods, genetic exclusion and
maximum likelihood, were used to estimate gene flow of the population. W ith 12 p rimers, each of 2 paternal trees
was confirmed to have dispersed pollen to E and F by genetic exclusion. And maximum likelihood results indicated
that 3 paternal trees had distributed pollen to maternal tree E, while 10 paternal trees had distributed pollen to
maternal tree F. According to the map, 52. 9% of pollen dispersal was as far as 30—50 m, and the amount of
downwind distribution was not significantly distinct from the upwind.
Key words:A zad irach ta ind ica; RAPD; outcrossing rate; gene flow; paternity analysis
　　植物交配系统的研究可以分为 2个层次 ,第 1
个层次是研究种群自交率与异交率 ,第 2个层次是
研究以花粉和种子为媒介的基因流过程与式样。传
统研究方法是通过套袋等人工控制授粉方式研究自
交与异交的结实率 ,并观察传粉者的行为以及采用
染料或同位素标记花粉来测定花粉的传播 ,由于散
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
布的花粉并不都与胚珠结合 ,不能有效地反映花粉
为媒介的基因流。分子标记技术出现后 ,交配系统
的研究方法发展为亲本分析 [ 1 ]。目前异交率和基因
流测定主要是通过分析每一个后代的亲本来实现。
在已知母本的情况下 ,亲本分析主要是进行父本分
析。早期多采用等位酶分子标记进行亲本分析 ,随
着 DNA 分子标记如随机扩增多态 DNA ( Random
Amp lified Polymorphic DNA, RAPD )、扩增片段长度
多 态 ( Amp lified Fragment Length Polymorphism,
AFLP)、简单重复序列 ( Simp le Sequence Repeat,
SSR )、单核苷酸多态 ( Single Nucleotide Polymor2
phism , SNP)等的发展 ,亲本分析有了很好的工具。
到目前为止 ,已用分子标记分析了近 300种植物的
交配系统 [ 2 ]。国外在此方面研究较多 ,且各种方法
都有应用。如 Krauss[ 3 - 4 ]用等位酶和 AFLP方法对
山龙眼 ( Persoon ia m ollis)进行了父本分析 , Fritsch
等 [ 5 ]用 RAPD方法估计了四数木科 (Datiscaceae)北
美假大麻 (D a tisca g lom era ta )的异交率 , Dow等 [ 6 ]用
SSR方法进行了大果栎 (Q uercus m acrocarpa)的亲本
分析 , Chaix等 [ 7 ]用 SSR方法研究了巨桉 ( Eucalyptus
grandis)种子园的基因流。我国以往在此方面研究很
少且多使用等位酶方法 ,代表有陈小勇等 [ 8 ]利用等位
酶对青冈 (Cyclobalanopsis g lauca)天然种群幼苗的亲
本分析 ,张冬梅等 [ 9 ]利用等位酶对油松 ( Pinus tabu2
laeform is)种子园的父本分析 ;而最近几年植物繁育系
统研究受到重视 , DNA分子标记也得到更多应用 ,有
董贞荣等 [ 10 ]用 RAPD方法对泽苔草 (Caldesia parnas2
sifolia)异交率的测定和艾畅等 [ 11 ]用 SSR方法对马尾
松 (Pinus m assoniana)种子园的父本分析。
印楝 (Azad irach ta ind ica A. Juss. )是一种具有
重要的生态价值和经济价值的多用途树种 ,其种子
是制备生物农药的重要原料 [ 12 - 15 ]。印楝交配系统
方面的研究很少 ,仅 1999年 Kundu[ 16 ]用等位酶方法
估计了孟加拉天然印楝种群交配系统的异交率。该
文首次报道了印楝的异交率 ,为育种策略的制定和种
子园设置提供了依据 ,但是关于异交率研究的取样数
目仅 15株树 ,每株 8粒种子 ,酶系统数也只有 3个 ,取
样数和酶系统数均偏少 ,结果的可靠性还需进一步证
实。本文采用 RAPD分子标记 ,对引种印楝种群的交
配系统进行了进一步的研究 ,通过对异交率和基因流
的更深入了解 ,可以为将来优良无性系和种子园的经
营管理提供更可靠的依据 ,同时本文还进一步研究了
RAPD方法进行父本分析的可行性。
1　材料和方法
1. 1　材料
从引种于云南省元谋县和红河县、树龄为 5～7
年生的 4个缅甸种源印楝种群中共选取 7株树体作
为母本 ,并分别采其种子。种子萌发后 ,每个母本随
机选择 23个幼苗作为子代 (地点和编号见表 1)。以
上材料供异交率测定用。取其中个体数量较少且相
对地理隔离的红河县勐龙乡大黑公种群作基因流测
定用 ,种群位于靠近山顶的弃耕台地 , 5年生印楝纯
林 ,林下散生草本 ,株行距 7 m ×7 m,主要风向为东
风。母本 E和 F周围的 96株树体作为父本 ,编号 1～
96。成株取嫩叶 ,硅胶干燥保存 ,幼苗鲜叶备用。
表 1　样本采集地点及编号
种群 母本 子代 地 点 海拔 /m
1
A
B
A012A23
B012B23 元谋县老城乡南门山(25°32 ′N, 101°54′E) 1 200
2 C C012C23 元谋县苴林乡石灰村(25°44′N, 101°47 ′E) 1 100
3 D D012D23 元谋县老城乡老凹塘(25°29′N, 101°52′E) 1 250
4
E
F
G
E012E23
F012F23
G012G23 红河县勐龙乡大黑公(23°19′N, 102°37′E) 1 000
1. 2　基因组 D NA提取
DNA提取步骤由 Clark[ 17 ]主编的《植物分子生
物学实验手册 》中“CTAB法微量分离 DNA”稍加改
良而成。纯化后的基因组 DNA 经电泳检测后 ,以
λDNA ( TakaRa, 50 ng·μL - 1 )为对照 ,稀释成浓度为
10 ng·μL - 1的模板 DNA。
1. 3　PCR扩增及产物检测
从 Invitrogen公司的 36个随机引物中筛选出 12
个 ( BA01、BA03、BA04、BA05、BA07、BA08、BA10、
BA11、BA12、BA13、BA14、BA15)进行 PCR反应。反
应体系为 20μL,其中含 10 ×buffer ( Promega) 2μL,
25 mmol·L - 1 MgCl2 ( Promega) 1. 4μL, 10 mmol·L - 1
dNTPs ( Promega) 0. 5μL, 5 u·μl- 1 Taq酶 (Promega)
0. 4μL, 66 ng·μL - 1引物 ( Invitrogen) 2μL, 10 ng·
μL - 1模板 DNA 1μL, ddH2 O 12. 7μL。加入 16μL矿
物油 ( Solarbio) ,防止水分蒸发。扩增在 MJ PTC2200
PCR仪上进行 ,程序为 : 95 ℃预变性 5 m in; 94 ℃变性
1 m in, 36 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 2 m in, 40个循环 ;
72 ℃后延伸 10 m in; 4 ℃保存。PCR产物在 1. 5%的
琼脂糖 (OXO ID)凝胶上电泳 ,上样量 3. 0μL,电泳缓
495
第 5期 吴疆翀等 :印楝异交率和基因流的分析
冲液 1 ×TBE, 12 cm ×12 cm电泳槽 , B IO2RAD Power2
Pac Basic电泳仪 90 V恒压电泳 90 m in。0. 05% EB
染色 20 m in,UVP GDS28000凝胶成像系统观察、分析
和照相。
1. 4　异交率的测定
根据 Fritsch[ 5 ]对显性条带的分析方法 ,将子代
扩增出的 DNA片段与母本的片段进行比较 ,含有母
本所没有的片段子代个体为异交产生的子代 ,通过
分析多个引物扩增出的片段 ,统计出累计的异交子
代数量 ,从而得出异交率。
1. 5　基因流的测定
1. 5. 1　遗传排除法 将父本扩增出的片段与母本
及子代进行比较 ,若某个父本出现母本和其它父本
都没有的特征带 ,而子代中具有此特征带 ,则确定该
子代个体为此父本的后代 ,即此父本传粉给了母本。
1. 5. 2　最大似然法 对母本 E、F和它们的子代 ,以
及 96株父本扩增出的片段进行读带 ,然后转换为
1 /0矩阵 (分别表示特定位点上条带的有或无 )。用
PHYL IP V3. 65软件中的 RESTML程序进行最大似
然法分析。最大似然法对每个个体的每个位点都进
行互相比对 ,具有坚实的统计学基础 ,能有效的利用
数据 ,其结果将 DNA片段相似程度高的个体聚类。
排除母本与子代以及子代之间聚类的类群 ,父本与
子代聚成一类的类群中 ,子代与父本具最高相似性 ,
则该子代可能为同类群父本的后代 ,即父本传粉给
了子代对应的母本。
1. 5. 3　传粉距离的测定 　通过遗传排除法和最大
似然法确定传粉的父本后 ,测量父本与母本间的距
离即为传粉距离。
2　结果与分析
2. 1　异交率
12个引物共扩增出 101条谱带 ,其中多态性条带
100条 ,多态位点百分率为 99. 01% (表 2)。平均每个
引物扩增出 8～9个条带 ,片段大小在 100～3 000 bp之
间。引物对 7个母本的异交率检测结果见表 3。母本
A的 23个子代中 ,通过前 5个引物就检测出累计有 21
个子代是异交产生 ,异交率 91. 30%; 12个引物共检测
出累计 22个异交子代 ,异交率稳定在 95. 65%。母本 B
通过前 6个引物检测出累计有 21个子代是异交产生 ,
异交率 91. 30%; 12个引物共检测出累计 22个异交子
代 ,异交率稳定在 95. 65%。母本 C通过前 9个引物检
测出累计有 20个子代是异交产生 ,异交率 86. 96%; 12
个引物共检测出累计 21个异交子代 ,异交率达到 91.
30%。母本 D和 E通过前 6个引物即检测出 23个子
代全是异交产生 ,异交率 100%。引物 BA01扩增的母
本 E和 F的子代不含有母本没有的片段 ,不能检测出
异交子代。母本 F通过前 8个引物检测出累计有 21个
子代是异交产生 ,异交率 91. 30%; 12个引物共检测出
累计 22个异交子代 ,异交率稳定在 95. 65%。母本 G
通过前 6个引物检测出累计有 20个子代是异交产生 ,
异交率 86. 96%; 12个引物共检测出累计 22个异交子
代 ,异交率稳定在 95. 65%。7个母本的异交率经正态
性检验 , Shap iro2W ilk统计量为 0. 840,显著度 P值为
0. 099 >0. 05,服从正态分布 ,偏度系数 - 0. 174,峰度系
数 0. 336。异交率的平均值为 96. 27% , 95%置信区间为
93. 50%～99. 05%。
表 2　引物序列及扩增结果
引物 碱基序列 (5′→3′) 位点数 多态位点数
多态位点
百分率 /%
BA01 GTTTCGCTCC 8 8 100
BA03 CATCCCCCTG 9 9 100
BA04 GGACTGGAGT 8 8 100
BA05 TGCGCCCTTC 10 10 100
BA07 GGTGACGCAG 11 11 100
BA08 GTCCACACGG 11 11 100
BA10 CTGCTGGGAC 10 10 100
BA11 GTAGACCCGT 11 11 100
BA12 CCTTGACGCA 7 7 100
BA13 TTCCCCCGCT 5 5 100
BA14 TCCGCTCTGG 6 6 100
BA15 GGAGGGTGTT 5 4 80
总计 101 100 平均　99. 01
表 3　引物对母本的异交率检测情况
引物
累积异交率 /%
A B C D E F G
BA01 43. 48 21. 74 8. 70 13. 04 0. 00 0. 00 13. 04
BA03 56. 52 39. 13 21. 74 39. 13 26. 09 8. 70 60. 87
BA04 73. 91 60. 87 43. 48 47. 83 39. 13 26. 09 60. 87
BA05 86. 96 69. 56 56. 52 47. 83 91. 30 47. 83 73. 91
BA07 91. 30 78. 26 56. 52 60. 87 91. 30 60. 87 82. 61
BA08 91. 30 91. 30 69. 56 100. 00 100. 00 69. 56 86. 96
BA10 91. 30 91. 30 73. 91 100. 00 100. 00 82. 61 86. 96
BA11 91. 30 95. 65 73. 91 100. 00 100. 00 91. 30 95. 65
BA12 95. 65 95. 65 86. 96 100. 00 100. 00 91. 30 95. 65
BA13 95. 65 95. 65 86. 96 100. 00 100. 00 95. 65 95. 65
BA14 95. 65 95. 65 86. 96 100. 00 100. 00 95. 65 95. 65
BA15 95. 65 95. 65 91. 30 100. 00 100. 00 95. 65 95. 65
平均累积异交率 /% 96. 27　　　　　　　　　　　　
异交率 95%置信区间 /% 93. 50～99. 05　　　　　　　　　　　　　
2. 2　基因流
遗传排除法确定了各有 2个父本向母本 E和 F
传粉 (图 1)。引物 BA05的扩增图谱中 ,父本 63在
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2 000 bp处有一条特征带 ,子代 E01、E02和 E14具
有相同的带 ,说明这几个子代为父本 63的后代 ,父
本 63传粉给了母本 E。引物 BA11的扩增图谱中 ,
父本 86在 750 bp处有一条特征带 ,子代 F18和 F19
具有相同的带 ,说明这 2个子代为父本 86的后代 ,
父本 86传粉给了母本 F。引物 BA13的扩增图谱
中 ,父本 58在 1 000 bp和 1 200 bp处有 2条特征
带 ,子代 E08、E20和 E22具有这 2条相同的带 ,说
明这几个子代为父本 58的后代 ,父本 58传粉给了
母本 E。引物 BA14 的扩增图谱中 , 父本 49 在
1 500 bp处有一条特征带 ,子代 F02、F09、F17和 F20
具有相同的带 ,说明这几个子代为父本 49的后代 ,
父本 49传粉给了母本 F。最大似然法分析得出有 3
个父本向母本 E传粉 ,有 10个父本向母本 F传粉
(表 4)。其中 ,父本 76既向母本 E传粉形成子代
E06,也向母本 F传粉形成子代 F10和 F22;而由于
父本间似然值相同 ,子代 F16和 F21分别有 2个可
能的父本 ;其余子代与父本都是一一对应。
1:父本 ; 　2:母本 ; 　3 - 7:子代 ; 　8: GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus( Fermantas)
图 1　遗传排除法确定的传粉父本
图 2　大黑公种群的花粉散布格局
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第 5期 吴疆翀等 :印楝异交率和基因流的分析
表 4　最大似然法得出的传粉父本
子代 最可能的父本 子代 最可能的父本 子代 最可能的父本
E03 41 F04 73 F10, F22 76
E06 76 F05 94 F14 13
E09 71 F06 4 F16 91, 96
F07 23 F21 75, 92
图 3　传粉距离分布
综合遗传排除法与最大似然法的结果 ,得出云
南省红河县勐龙乡大黑公印楝种群的花粉散布格局
(图 2) ,结果表明来自主风方向和逆风方向的传粉
在数量上无差异。传粉距离的分布见图 3,最小值
9. 9 m,最大值 61. 2 m,平均值 34. 2 m。经正态性检
验 , Shap iro2W ilk 统计量为 0. 978,显著度 P 值为
0. 939 > 0. 05,传粉距离服从正态分布 ,偏度系数
0. 086,峰度系数 0. 632。距离小于 10 m的传粉占
5. 9% , 10～20 m的传粉占 11. 8% , 20～30 m的传粉
占 17. 6% , 30～40 m的传粉占 23. 5% , 40～50 m的
传粉占 29. 4% , 50～60 m的传粉占 5. 9% , 60 m以
上的传粉占 5. 9%。有 52. 9%的传粉集中在以母本
为圆心 ,半径 30～50 m的范围内。
3　结论与讨论
RAPD片段的遗传符合孟德尔定律 ,但由于是
显性分子标记 ,只表达表型显性的带 ,不能鉴别杂合
子 ,所以含有母本没有的条带的子代个体确定为异
交产生的子代 ;而与母本扩增条带相同以及缺少母
本有的条带且不同时具备母本没有的新条带的子代
不确定是自交还是异交产生的。因此在引物数量
少 ,多态位点少的情况下会低估异交率。所以用于
遗传排除时要有足够数量的引物才能保证得到稳定
的累计异交率 ;而 RAPD引物数量多 ,扩增位点多 ,
单个位点的信息不足可以通过大量的位点弥补 [ 2 ]。
本文所筛选的 12个引物多态位点丰富 ,可以为 7个
母本中的 6个测得稳定的累积异交率。等位酶标记
的优点是共显性 ,局限性是可供利用的多态位点少 ,
受多态位点数目、每位点上的等位基因数目和每位
点上等位基因分布频率限制 [ 18 - 19 ] ,但至今仍适合于
父本分析 ,在植物交配系统研究中应用最广 [ 20 ]。
SSR也是共显性标记 ,检出等位基因的灵敏度高 ,多
态性好 ,近几年在国外常用于异交率测定 [ 6 - 7 ] ,不可
否认其是一种很好的亲本分析方法 ;但是费用较昂
贵 ,寻找到合适的引物较难。近几年出现的 SNP与
SSR一样 ,适用范围广 [ 21 ] ,二者将成为今后主要的
分子标记方法。综上所述 ,考虑到 RAPD标记操作
相对简便迅速 ,其不失为一种可行的父本分析方法。
遗传排除法只要父本含有特征带就可以为子代
确定唯一的父本 ,分析简便快捷 ,只需通过简单的计
数即可 ,结果也准确可靠 ;但由于特征带的数量很
少 ,用此方法确定的父本不多。何田华等 [ 1 ]认为对
于排除研究来说 ,所研究的种群中的可能亲本最好
不要超过 100个。本文的实验 12个引物只能从 96
个父本中确定 4个。陈小勇 [ 8 ]用等位酶标记进行的
遗传排除只能为 1株幼苗确定唯一的亲本对。最大
似然法通过计算父本与子代的似然值 ,相似程度最
高的父本和子代最可能存在亲子关系 ,这样可以在
遗传排除的基础上更充分的利用数据 ,但仍然不能
为所有子代找到可能的父本。艾畅等 [ 11 ]用 SSR标
记对马尾松种子园进行的最大似然法分析可以为
286粒种子中的 107粒确定父本。除此之外 ,最大
似然法不能提供结果的可信度 [ 1 ]。所以 ,在进行父
本分析时为得到较为准确而充分的数据 ,两种分析
方法都要使用。
Kundu[ 14 ]对孟加拉的天然印楝种群母本与子代
间进行等位酶分析 , 多位点确定的异交率为
89. 76% ～90. 24% ,平均为 90%。本文研究得出的
引种的印楝种群平均异交率为 96. 27% ,结果基本
一致 ,都显示了印楝以异交为主 ,某些个体甚至是专
性异交。此外 ,传统的人工授粉、杂交指数和花粉 -
胚珠比等传粉生物学方面的研究也表明印楝是一种
兼性异交植物 ,部分自交亲和 ,需要传粉者 [ 22 ]。引
种栽培种群异交率较高的原因可能是由于两试验点
地理因素差异明显 (孟加拉 Nawabganj种群 , 23°25′
N , 89°15′E,海拔 15 m,年降水量 1 540 mm;大黑公
种群 , 23°19′N , 102°37′E,海拔 1 000 m,年降水量
840 mm ) ,生境条件以及传粉昆虫种类、密度和传粉
习性不同所致。此外 ,两地种群的密度和种群内个
795
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
体的年龄结构也会在一定程度上影响异交率。通常
情况下 ,种群密度降低自交率会有所增加 ,这种现象
在风媒传粉植物中表现得更加明显 [ 1, 23 ]。本实验的
结果还显示印楝的花粉传播不受风向影响 ,间接说
明印楝花具虫媒传粉特性。
印楝异交率很高 ,在优良无性系造林和种子园
营建时须考虑相对的地理隔离 ,防止外源花粉进入
后使母本的优良性状在子代丧失。另一方面 ,异交
率高暗示物种遗传多样性丰富 ,开发潜力巨大。如
果对不同种源间及相同种源内具有不同优良性状的
个体进行杂交育种 ,使优良性状在子代集中和固定 ,
将会比较容易地获得较高的遗传增益。对生物农药
的原料林来说 ,可以进行人工辅助异株异花授粉 ,从
而提高种子产量。
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