全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（２）：１９５ ２００
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０１９５０６
杜仲１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸还原异构酶
基因 ｃＤＮＡ全长克隆与序列分析
刘攀峰１，杜红岩１，乌云塔娜２，黄海燕１，朱高浦１
（１．中国林业科学研究院经济林研究开发中心，河南 郑州 ４５０００３；
２．国家林业局经济林育种与栽培重点实验室，湖南 长沙 ４１０００４）
收稿日期：２０１１１１０６
基金项目：国家公益性行业科研专项（２０１００４０２９）
作者简介：刘攀峰（１９８４—），男，河南平顶山人，博士研究生。研究方向：杜仲栽培与育种；Ｅｍａｉｌ：ｐｆｅｎｇｌｉｕ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者： 杜红岩（１９６３—），男，研究员，博士生导师。主要从事杜仲育种、栽培与综合利用的研究。Ｅｍａｉｌ：ｄｈｙ５１５＠１２６．ｃｏｍ
摘要：以杜仲叶片ｃＤＮＡ为模板，采用反转录ＲＣＲ及ＲＡＣＥ技术分离出 ＤＸＲ基因 ｃＤＮＡ全长。序列分析结果表明
该基因序列全长１８１４ｂｐ，共编码４７８个氨基酸，推导的蛋白质分子量为５１．７１ｋＤ，理论等电点５．７９，命名为 ＥｕＤ
ＸＲ。推导的ＥｕＤＸＲ蛋白质序列具有植物ＤＸＲ酶的５个典型基序，并预测出２６个潜在的功能位点。系统进化树分
析表明ＥｕＤＸＲ蛋白与玉米、水稻亲缘关系最近，其次为橡胶、拟南芥、烟草。
关键词：杜仲；ＤＸＲ；基因；序列分析
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ１ＤｅｏｘｙＤＸｙｌｕｌｏｓｅ５Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＧｅｎｅｃＤＮＡｆｒｏｍＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ
ＬＩＵＰａｎｆｅｎｇ１，ＤＵＨｏｎｇｙａｎ１，ＷＵＹＵＮＴａｎａ２，ＨＵＡＮＧＨａｉｙａｎ１，ＺＨＵＧａｏｐｕ１
（１．ＮｏｎｔｉｍｂｅｒＦｏｒｅｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００３，Ｈｅ’ｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｎｗｏｏｄＦｏｒｅｓｔＰｒｏｄｕｃｔｓｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４ Ｈｕ’ｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＤＸＲｇｅｎｅｃＤＮＡｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＰＣＲ）ａｎｄｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄ
ｎａｍｅｄａｆｔｅｒＥｕＤＸＲ．ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｕＤＸＲｗａｓ１８１４ｂｐａｎｄｃｏｎｔａｉｎｓａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）
ｏｆ１４３７ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇ４７８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｗｉｔｈａｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆａｂｏｕｔ５１．７１ｋＤ，ａｎｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔｏｆｗｈｉｃｈｗａｓ５．７９，ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｍｏｔｉｆｓｏｆｐｌａｎｔＤＸＲａｎｄ２６ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅａ
ｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｕＤＸＲ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｕＤＸＲ
ｗａｓｍｏｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆＺｅａｍａｙｓａｎｄＯｒｙｚａｓａｔｉｖａｔｈａｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄｆｏｌｏｗｅｄｂｙＨｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ，Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ；ＤＸＲ；ｇｅｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
萜类是自然界种类最为繁多的一类天然产物，
迄今已有３００００多种从植物体中分离出来，同时一
些萜类化合物仅在部分特定的分类群中合成［１－２］。
植物多种形式的生命活动如光合与呼吸代谢、生长
发育调节、细胞信号转导、植物通讯及环境互作等过
程中萜类都发挥着重要作用［３－５］。
ｌ脱氧Ｄ木酮糖５磷酸还原异构酶（ＤＸＲ）最
早从大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中克隆出来［６］，此后
在多种原核及真核生物中相继被发现。目前在
ＧｅｎｅＢａｎｋ中可检索到拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ
林 业 科 学 研 究 第２５卷
（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）、橡胶（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｗｉｌｄ．ｅｘ
Ａ．Ｊｕｓｓ．）Ｍｕｅｌ．Ａｒｇ．）、红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
（Ｐｉｌｇ．）Ｒｅｈｄ．）、玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）、银杏（Ｇｉｎｋｇｏ
ｂｉｌｏｂａＬ．）、丹参（ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａＢｇｅ．）、火炬松
（ＰｉｎｕｓｔａｅｄａＬｉｎｎ．）等５９种植物 ＤＸＲ基因的序列
信息。一些实验结果认为 ＤＸＲ是 ＭＥＰ途径中的关
键节点［７－９］，如在胡椒（ＰｉｐｅｒｎｉｇｒｕｍＬ．）转基因植株
中ＤＸＲ的过量表达促进了精油类单萜物质的增加，
但也有一些研究认为 ＤＸＲ的表达水平与萜类物质
合成没有密切关系［１０－１２］。
杜仲（ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ．）是新生代第三
纪孑遗植物，不仅是重要的木本药用树种，还是具有
巨大开发前景的天然橡胶资源。在我国已有２０００
多年的栽培历史，适生区分布于全国 ２７个省（区、
市）［１３］。杜仲叶、皮和果实中的多种活性成分都与
萜类合成有关，如环烯醚萜类的京尼平苷、京尼平苷
酸及桃叶珊瑚苷，其中京尼平苷和京尼平苷酸是理
想的降压活性物质，桃叶珊瑚苷具有镇痛、抗菌消炎
作用［１４］；此外具反式聚异戊二烯化学结构的杜仲
胶（ＧｕｔａＰｅｒｃｈａ）属多萜类，它是一种新型的天然高
分子功能材料，可用于军事、橡胶工业、医疗和化工
等领域［１５］。因此，萜类生物合成途径相关功能基因
的开发对杜仲基因工程研究与应用具有重要意义。
目前对杜仲ＤＸＲ基因的克隆尚无报道，本研究从杜
仲叶片总ＲＮＡ中分离出ＤＸＲ同源基因ｃＤＮＡ全长，
并进行了生物信息学分析，旨为杜仲萜类化合物的
生物合成机制、优良基因挖掘及分子育种提供基础
信息。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
杜仲叶片于２０１１年４月下旬采自中国林业科
学研究院经济林研究开发中心院内‘华仲６号’杜仲
良种，清洗干净后投入液氮带回室内 －８０℃保存
备用。
ＲＮＡ提取试剂Ｔｒｉｚｏｌ、ＤＥＰＣ等购自于Ｓｉｇｍａ公
司（美国），ＰＶＰ、ＳＤＳ购自于上海生工，其余试剂均
为国产分析纯；ＲＮＡ反转录试剂盒、３’ＲＡＣＥ及
５’ＲＡＣＥ试剂盒购自于 Ｔａｋａｒａ公司（大连）；ＰＣＲ
产物纯化和回收试剂盒、ｐＧＭＴ克隆载体试剂盒，
２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ及 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自于
ＴＩＡＮＧＥＮ公司（北京）；ＤＨ５α菌株购自于鼎国生
物公司（北京）。
１．２ 叶片总ＲＮＡ提取
采用改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取杜仲叶片 ＲＮＡ［１６－１７］，
提取完毕后测定样品Ａ２６０与Ａ２８０数值，根据Ａ２６０／Ａ２８０
比值，估测ＲＮＡ质量，对满足实验要求的 ＲＮＡ样品
保存于－８０℃冰箱备用。
１．３ 单链ｃＤＮＡ合成
实验操作按 ＭＭＬＶＲＴａｓｅｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ
说明书进行。取ＲＮＡ约２μｇ，按照说明书加入相应
的试剂与引物，设置反转录条件为：室温１０ｍｉｎ；４２
℃ １ｈ；冰浴２ｍｉｎ合成单链ｃＤＮＡ。
１．４ 引物设计
根据一段已知杜仲 ＤＸＲｕｎｉｇｅｎｅ序列设计引物
Ｐ１：５′ＣＧＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＴＣ３′，Ｐ２：５′ＧＣ
ＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴ３′，用于ＤＸＲ特异片段扩
增；在此片段测序结果的基础上，结合试剂盒 ３′
ＲＡＣＥ及 ５′ＲＡＣＥ锚定引物序列 ３Ｏ１：５′ＴＡＣ
ＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴ３′，３Ｉ１：５′ＣＧＣＧＧＡＴＣ
ＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ３′，５Ｏ１：５′ＣＡＴ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ３′，５Ｉ１：５′ ＣＧＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧ３′；设计
适用于巢式 ＰＣＲ扩增的特异性引物３Ｐ１：５′ＣＴＧＴ
ＧＣＣＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＣＴＡ３′，３Ｐ２：５′ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴ
ＧＡＴＴＣＣＧＡＡＣ３′，５Ｐ１：５′ＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣ
ＣＴＣＴ３′，５Ｐ２：５′ＡＡＧＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＣ３′。
１．５ ３′ＲＡＣＥ及５′ＲＡＣＥ扩增
３′ＲＡＣＥ及５′ＲＡＣＥ的 ＰＣＲ反应体系与反应
条件参照Ｔａｋａｒａ３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０与
Ｔａｋａｒａ５′ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ说明书操作。
１．６ ＰＣＲ产物的纯化及克隆测序
按ＴＩＡＮＧＥＮ通用型ＤＮＡ纯化回收试剂盒说明
进行ＰＣＲ产物的回收；按ｐＧＭＴ克隆试剂盒说明将
回收片段连接至 ｐＧＭＴ载体，转化 ＤＨ５α感受态细
胞，将 １００μＬ转化产物与 ４０μＬＸｇａｌ（２０ｍｇ·
ｍＬ－１）、４μＬＩＰＴＧ（５０ｍｇ·Ｌ－１）混合后，均匀涂布
于含有１００ｍｇ·Ｌ－１氨苄青霉素的 ＬＢ固体培养基
上，３７℃恒温过夜培养，挑取白斑单菌落，接种于含
有１００ｍｇ·Ｌ－１氨苄青霉素的 ＬＢ液体培养基中，３７
℃ ２００ｒ·ｍｉｎ－１振荡过夜培养，ＥｃｏＲⅠ酶切２ｈ以
上或过夜，电泳鉴定后送至南京金斯瑞生物公司
测序。
１．７ 杜仲ＤＸＲ基因ｃＤＮＡ序列的生物信息学分析
利用ＮＣＢＩＢｌａｓｔ程序进行序列相似性检索，并
用ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ程序查找基因 ｃＤＮＡ开放阅读框架；
６９１
第２期 刘攀峰等：杜仲１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸还原异构酶基因ｃＤＮＡ全长克隆与序列分析
利用ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ程序与ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ程序分析
氨基酸残基数目与组成、蛋白质相对分子量、理论等
电点以及功能位点等；利用 ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ预测蛋白
质的细胞定位及二级结构；利用 ＴａｒｇｅｔＰ１．１Ｓｅｒｖｅｒ
进行信号肽的预测［１８］；利用 ＥｘＰＡＳｙＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ
程序进行蛋白质的同源建模［１９］；利用 Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ软
件进行蛋白质序列的多重比对并通过ＭＥＧＡ５软件
构建基因的系统进化树［２０］。
２ 结果与分析
２．１ 杜仲ＤＸＲ基因ｃＤＮＡ全长的克隆
利用引物Ｐ１，Ｐ２在逆转录的ｃＤＮＡ模板上扩增
出１条约８００ｂｐ的特异条带（图１Ⅰ）。测序后将
序列进行ＢＬＡＳＴ程序检索，与萝芙木（Ｒａｕｖｏｌｆｉａｖｅｒ
ｔｉｃｉｌａｔａ（Ｌｏｕｒ．）Ｂａｉｌ．；ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．：ＤＱ７７９２８６．
１）、长春花 （Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ（Ｌ．）Ｇ．Ｄｏｎ；
ＡＦ２５０２３５．１）、橹豆 （Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒ．；
ＨＱ３４０２４１．１）ＤＸＲ核苷酸序列的同源性达到 ８０％
以上，确定该片段为杜仲ＤＸＲ基因片段。据此段序
列分别设计用于基因３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ序列扩
增的特异引物，通过ＰＣＲ扩增分别得到１条约１０００
ｂｐ和１条约５００ｂｐ的条带（图１Ⅱ、Ⅲ）。３条基因
片段序列拼接后得到１条长１８１４ｂｐ的基因序列，
该序列与毛果杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒｅｙ＆Ａ．
Ｇｒａｙ；ＥＵ６９３０２０．１）、萝芙木（ＤＱ７７９２８６．１）、橡胶
（ＤＱ４７３４３２．１）、丹 参 （ＦＪ４７６２５５．１）、长 春 花
（ＡＦ２５０２３５．１）ＤＸＲ全长基因序列的相似性分别为
８１％、７８％、７８％、７８％和７７％。通过 ＮＣＢＩ中 ＯＲＦ
ｆｉｎｄｅｒ工具查找到该序列包含一个长１４３７ｂｐ的开
放阅读框，编码序列与橡胶（ＡＢＤ９２７０２．１），蓖麻
（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓＬ．；ＥＥＦ５２００１．１），萝 芙 木
（ＡＡＹ８７１５１．２）ＤＸＲ氨基酸序列的同源性分别为
８６％、８６％、８５％。因此可确定该序列为杜仲 ＤＸＲ
基因ｃＤＮＡ全长序列，将其命名为ＥｕＤＸＲ。
Ⅰ：核心片段扩增，Ⅱ：３′末端序列扩增 ，Ⅲ：５′末端序列扩增
图１ 杜仲ＤＸＲ基因ＲＴＰＣＲ扩增的琼脂糖凝胶电泳图
图２ 杜仲ＥｕＤＸＲ全长ｃＤＮＡ序列及推导的ＤＸＲ氨基酸序列
２．２ 杜仲ＤＸＲ基因ｃＤＮＡ全长及预测蛋白质序列
分析
ＥｕＤＸＲ５′端非编码区长１２６ｂｐ，３′端非编码区
长２５１ｂｐ，编码区长１４３７ｂｐ，共编码４７８个氨基
酸残基（图２）。植物 ＤＸＲ同源蛋白序列具有５个
保守区段［２１－２２］（图２，图３），在杜仲中ＥｕＤＸＲ蛋白
质序列具有 ２个 ＤＸＲ结合基序：ＬＰＡＤＳＥＨＳＡＩ和
ＮＫＧＬＥＶＩＥＡＨＹ，２个 ＮＡＤＰＨ结合基序：ＧＳＴＧＳ
（Ｉ／Ｖ）ＧＴ和 ＬＡＡＧＳＮ（Ｖ／Ｉ）以及 Ｎ端富脯氨酸
７９１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
基序 ＰＰＰＡＷＰＧＲＡ。与两种原核生物相比，包括杜
仲在内的几种植物 ＤＸＲ氨基酸序列起始端多出约
８０个保守性较低的氨基酸残基，且在此段序列中
包含一个与在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中发现
的推测为 ＣＳ（Ａ／Ｖ／Ｍ）基序的剪接位点以及富脯
氨酸保守基序 ＰＰＰＡＷＰＧＲＡ［２３］。蛋白质序列 Ｎ端
不保守并富含丝氨酸残基被认作是典型的质体转
运肽结构［２４］。比对不同物种 ＤＸＲ蛋白质序列的
结果初步说明，推测的 ＥｕＤＸＲ蛋白质序列具有植
物 ＤＸＲ蛋白的典型特征，Ｎ端具有原核生物所没
有的转运肽序列和一个较保守的切割位点，以及一
段富脯氨酸的成熟蛋白的 Ｎ端序列。
２．３ ＥｕＤＸＲ编码蛋白结构及功能预测
２．３．１ ＥｕＤＸＲ编码蛋白理化特性及细胞定位
ＥｘＰａＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ程序预测ＥｕＤＸＲ编码蛋白的
分子量为５１．７１ｋＤ，理论等电点为５．７９；氨基酸组
成中以丙氨酸（１０．５％）、亮氨酸（９．８％）、缬氨酸
（８．４％）含量为最高，蛋白不稳定系数为３６．３７，属
于稳定蛋白质。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ在线预测该蛋白定位
于叶绿体上，ＴａｒｇｅｔＰ１．１Ｓｅｒｖｅｒ对 ＥｕＤＸＲ转运肽的
预测结果表明，该序列含有叶绿体转运肽，预测分值
为０．３０２，可靠性为Ⅳ级，且该转运肽可能包含５１
个氨基酸残基。
大肠杆菌（ＢＡＡ３２４２６．１）；细长聚球藻（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ；ＹＰ＿１７３２０８．１）；拟南芥（ＡＦ１４８８５２）；甜叶菊（Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ
（Ｂｅｒｔ．）Ｂｅｒｔｏｎｉ；ＣＡＤ２２１５６．１）；番茄（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＬ．；ＮＰ＿００１２３４５５３．１）；橡胶（ＡＢＤ９２７０２．１）；
烟草（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＬ．；ＡＢＨ０８９６４．１）；火炬松（ＡＣＪ６７０２２．１）
图３ ＥｕＤＸＲ氨基酸序列与其它物种ＤＸＲ氨基酸序列的多重比对
２．３．２ ＥｕＤＸＲ编码蛋白二级结构预测
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ在线预测 ＥｕＤＸＲ蛋白二级结构
中α螺旋占３８．７％；β折叠占１４．４４％；螺环结构占
４６．８６％，属于混合型结构的蛋白质。
ＥｘＰａＳｙＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ程序分析ＥｕＤＸＲ的基序类型
分为７种，含有２６个潜在的功能位点，包括４个蛋白
激酶Ｃ磷酸化位点（ＴｓＫ，１９２１；ＳｎＲ，２２２４；ＴｆＫ，１２８
１３０；ＴｆＫ，３７９３８１）；１１个Ｎ端十四烷酰化位点（ＧＡｔ
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第２期 刘攀峰等：杜仲１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸还原异构酶基因ｃＤＮＡ全长克隆与序列分析
ｎＧＬ，４１４６；ＧＳｔｇＳＩ，８８９３；ＧＳｉｇＴＱ，９１９６；ＧＳｎｖＴＬ，１１６
１２１；ＧＩｖｇＣＡ，１８０１８５；ＧＬｋｐＴＶ，１８６１９１；ＧＬｐｅＧＡ，２４２
２４７；ＧＧｔｍＴＧ，４０１４０６；ＧＴｍｔＧＶ，４０２４０７；ＧＶｌｓＡＡ，
４０６４１１；ＧＬｓｐＡＬ，４７２４７７）；５个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化
位点（ＳａｅＥ，５１５４；ＳｌｖＤ，１４０１４３；ＳｍｉＥ，３２８３３１；Ｓｗ
ｐＤ，３５５３５８；ＳｌｄＥ，４４９４５２）；２个酰胺化位点（ｐＧＲＫ，
７３７６；ｍＧＫＫ，２８４２８７）；２个 Ｎ端糖 基 化 位 点
（ＮＶＴＬ，１１８１２１；ＮＥＳＬ，１３８１４１）；１个依赖 ｃＡＭＰ和
ｃＧＭＰ的蛋白激酶磷酸化位点（ＫＫｉＴ，２８６２８９）；１个
酪氨酸激酶磷酸化位点（ＤｎｖｋＹ，３８１３８８）。
２．３．３ 杜仲ＥｕＤＸＲ编码蛋白三级结构预测
以运动发酵单胞菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）蛋白为
模板（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．：１ｒ０ｋ）对ＥｕＤＸＲ蛋白质同源建
模，并利用 ＳｗｉｓｓＰｄｂＶｉｅｗｅｒ４．０．４对相应功能域进
行标注，得到的蛋白三维构象如图４所示。ＥｘＰＡｓｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ程序评测推导的 ＥｕＤＸＲ蛋白模
型ＱＭＥＡＮ６得分为０．７２３，与运动发酵单胞菌氨基
酸序列的相似性为４３．２２％。在ＥｕＤＸＲ蛋白三维模
型中直观显示出其Ｎ端结构域、Ｃ端结构域、与
ＮＡＤＰＨ结合的两个保守基序（ＧＳＴＧＳＩＧＴ、ＬＡＡＧＳ
ＮＶ）以及另一保守基序 （ＬＰＡＤＳＥＨＳＡＩ）等功能结构
的空间分布特征。
ＭｏｔｉｆＡ：基序ＧＳＴＧＳ（Ｉ／Ｖ）ＧＴ；ＭｏｔｉｆＢ：ＬＡＡＧＳＮ
（Ｖ／Ｉ）；ＭｏｔｉｆＣ：基序ＬＰＡＤＳＥＨＳＡＩ
图４ ＥｕＤＸＲ编码蛋白三级结构模型
黄花蒿 （Ａ．ａｎｎｕａＬｉｎｎ．，ＡＡＤ５６３９１．２）；甜叶菊（ＣＡＤ２２１５６．１）；亚麻（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｉｍｕｍＬｉｎｎ．，ＣＡＦ２２０９２．１）；金鱼草 （Ａ．ｍａｊｕｓＬ．，
ＡＡＷ２８９９８．１）；拟南芥（ＡＡＦ７３１４０．１）；丹参 （ＡＣＫ５７５３５．１）；番茄（ＮＰ＿００１２３４５５３．１）；烟草（ＡＢＨ０８９６４．１）；橡胶（ＡＢＤ９２７０２．１）；
萝芙木（ＡＡＹ８７１５１．２）；玉米（ＮＰ＿００１１０５１３９．１）；水稻（Ｏ．ｓａｔｉｖａＬ．，ＡＡＬ３７５６０．１）；曼地亚红豆杉（Ｔａｘｕｓ×ｍｅｄｉａＲｅｈｄ．，
ＡＡＵ８７８３６．１）；赤松（Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａＳｉｅｂ．ｅｔＺｕｃｃ．，ＡＣＣ５４５５８．１）；火炬松 （ＡＣＪ６７０２２．１）；紫菜（Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓＵｅｄａ．，
ＡＢＩ９６２７５．１）；褐藻（Ｅ．ｓｉｌｉｃｕｌｏｓｕｓ（Ｄｉｌｗ．）Ｌｙｎｇｂ．，ＣＢＪ２９７２０．１）大肠杆菌（ＢＡＡ３２４２６．１）
图５ ＥｕＤＸＲ氨基酸序列与其它物种ＤＸＲ氨基酸序列的系统进化树
２．３．４ ＤＸＲ编码蛋白的系统进化分析
利用ＭＥＧＡ５中 ＣｌｕｓｔａｌＷ法对２０个不同物种
ＤＸＲ蛋白序列比对，并用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ法构建了
系统进化树（图５）。发现高等植物、藻类以及细菌
来源的ＤＸＲ蛋白序列在进化上分别属于不同的分
类群，ＥｕＤＸＲ蛋白序列与玉米、水稻的亲缘关系最
９９１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
为接近，进化距离分别为０．０６４、０．０６４；其次为橡胶
（０．０７０）、拟南芥（０．０７５）、烟草（０．０８４）、番茄
（０．０８４）和金鱼草（０．０８７）。
３ 讨论
定位于高等植物质体中的 ＭＥＰ途径是植物萜
类合成的一条重要途径，多数研究表明ＤＸＲ在ＭＥＰ
途径代谢网络的调控中起重要作用。本研究认为，
从杜仲中分离出的ＥｕＤＸＲ是高等植物 ＤＸＲ基因家
族的新成员，在高等植物中具有较高的保守性。由
ＥｕＤＸＲ推导出的蛋白质序列被检测出多个潜在功
能位点，表明ＥｕＤＸＲ编码蛋白极有可能参与到杜仲
ＭＥＰ萜类合成途径中并行使重要功能。
转运肽识别特殊膜蛋白，引导细胞质中合成的蛋
白质输入线粒体和叶绿体，转运肽的预测和分析对正
确认识和理解蛋白质的细胞定位及结构域的分选有
着重要意义。预测的ＥｕＤＸＲ编码蛋白具有转运肽序
列，并存在转运肽酶切位点。由于ＤＸＲ是ＭＥＰ合成
途径的一个作用酶，而ＭＥＰ途径仅存在于细胞质体
中，因而可进一步推断本研究克隆出的 ＥｕＤＸＲ基因
其编码蛋白参与到杜仲 ＭＥＰ萜类合成途径中。但
ＥｕＤＸＲ是否为一个基因家族，其家族成员数量、表达
产物的确切定位以及基因功能有待深入研究。
参考文献：
［１］ＢｏｈｌｍａｎｎＪ，ＫｅｅｌｉｎｇＣＩ．Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪ，
２００８，５４（４）：６５６－６６９
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