全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2007, 20 (4) : 537～541
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0420537205
大花蕙兰 (Cym bidium hybridum )试管苗
基部切块诱导类原球茎研究 3
吴开云 1, 2 , 黄敏仁 13 3 , 王明庥 1
(1. 南京林业大学森林资源与环境学院 ,江苏 南京　210037; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :以大花蕙兰试管苗基部切块为外植体 ,以 MS培养基为基本培养基 ,培养诱导类原球茎 ( PLB ) ,研究不同激素
配比以及外植体来源基因型对 PLB诱导的影响。低水平的 2, 42D和较高水平的 62BA对于试管苗基部切块诱导
PLB具有显著的促进作用。当 2, 42D浓度高于 0. 60 mg·L - 1时 , PLB诱导受到显著抑制。不同基因型有不同的最
佳激素组合。NAA对特定基因型诱导 PLB有效。以试管苗基部切块组织培养方式诱导大花蕙兰 PLB是可行的 ,为
转基因研究提供了植株再生技术基础。
关键词 :大花蕙兰 ;原球茎 ; PLB;植株再生
中图分类号 : S682. 31 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007202205
基金项目 : 浙江省自然科学基金项目“利用天麻抗真菌蛋白 GAFP基因遗传转人改良热带兰抗病性研究”( Y305684)
作者简介 : 吴开云 (1963—) ,男 ,江苏江都人 ,副研究员 ,在读博士研究生.3 李杰博士为本试验提供大花蕙兰品种材料 ;诸葛强老师、王光萍老师为本研究提供了热情帮助 ,特此致谢 !3 3 通讯作者
M icropropaga tion of C ym bidium hybridum by Inducem en t
of PL B from Cuted Ba se of in vitro Plan tlets
WU Kai2yun1, 2 , HUANG M in2ren1 , WANG M ing2xiu1
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing　210037, J iangsu, China;
2. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　311400, Zhejiang, China)
Abstract: PLB ( p rotocorm2like body ) is successfully induced from the cuted tissue of p lantlet2base of Cym bid ium
hybridum in vitro, in a simulative manner like m icrotuber. The effects of different concentrations of 2, 42D, 62BA ,
and NAA on the PLB formation of C. hybridum were investigated in different level of concentration. The results
showed that the effects of 2, 42D and 62BA on the frequency of PLB formation of C. hybridum differed extremely sig2
nificantly. 2, 42D on lower level was a important stimulative to induce PLB , but the inducing of PLB would be re2
strained when the concentration of 2, 42D was above 0. 60 mg·L - 1. The frequency of PLB formation increased basi2
cally with the increase of concentrations of 62BA. The frequency of PLB formation was also related to the genotype,
NAA was a important stimulative factor for some special genotype of C. hybridum. The experiment strategy to indu2
cing PLB in simulative manner of bulb is feasible.
Key words: Cym bid ium hybridum ; p rotocorm; PLB; p lant regulator
大花蕙兰 (Cym bidium hybridum Hort. ) ,又称虎头
兰、西姆比兰 ,属于兰科 (O rchidaceae)兰属 (Cym bidi2
um )植物。大花蕙兰株型相对高大飘逸 ,花型大而丰
润 ,花序繁茂 ,色彩华丽且层次丰富多变 ,容易营造热
烈开朗的环境气氛 ,是市场潜力最大的兰花之一。
国内外现有关大花蕙兰试管苗培育方面的研
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
究 ,基本上是利用茎尖 [ 1 ]、茎段 [ 2 ]、新芽 [ 3 ]、假鳞茎
切块、根段 [ 4, 5 ]或直接以类原球茎 [ 6 ]作为外植体 ,通
过诱导丛生芽或类原球茎实现快繁的目的。类原球
茎 (p rotocorm 2like body, PLB )诱导是兰科植物重要
的繁殖方式之一 ,具有繁殖效率高、易于生根等优
点。PLB是由分生组织的薄壁细胞脱分化 ,形成胚
性细胞 ,经球状胚发育而来 [ 7 ]。Chen J T [ 8 ]、谷祝
平 [ 9 ]、祝建 [ 10 ]等认为兰花类原球茎来源于体细胞
胚 ,因此在兰花基因工程育种方面具有重要价值。
利用成年株分蘖芽、花茎或直接以假鳞茎茎尖作为
外植体诱导 PLB则有外植体来源有限、成本高、效
率低的缺点。PLB增殖诱导还存在变异积累和分化
能力退化的问题 [ 11, 12 ]。
本研究拟利用 PLB成批诱导产生的、健壮的大
花蕙兰试管苗作为丰富的外植体来源。以大花蕙兰
试管苗基部切块作为外植体 ,结合不同处理水平的
外源激素组合 ,进行植物外源激素对大花蕙兰 PLB
发生影响的研究 ,以期获得一种有效的适合于转基
因的大花蕙兰再生技术。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
供试的大花蕙兰品种由江苏省兰花工程研究中
心李杰博士提供 ,有 4个商品化品种 ,分别用 CMM、
PET、CW I、CAH表示。其中 CMM (梦露 )开中轮花 ,
萼瓣粉红 ,唇瓣带暗红色“V”形斑点 ; CW I(幻影 )开
中大轮花 ,萼瓣绿色 ,唇瓣红色 ; CAH (夕阳 )开中大
轮花 ,萼瓣红色 ,唇瓣红色带黄色边 ; PET (彼特 )开
中轮花 ,萼瓣黄色 ,唇瓣红色“V”形斑块。基本培养
基为 MS培养基。使用的激素有细胞分裂素 62BA,
生长素 NAA、2, 42D。
1. 2 外植体取样
取高约 5～6 cm健壮的试管苗 ,切除根部 ,剥去
外围较老的叶片 ,再切去上部叶片部分 ,只留下高约
5 mm的基部 ,并纵切为 2个瓣 ,在无菌条件下 ,植入
含有不同激素配比的 MS培养基 , 30 d后开始观察
和调查 PLB诱导效果。
1. 3 基本培养基与培养条件
基本培养基配方为 : MS + 8. 0 g·L - 1琼脂 + 30
g·L - 1蔗糖。培养温度为 25 ±2 ℃, 环境相对湿度
60% ～80% ,黑暗诱导 20 d后 ,继续弱光培养 10 d
(50 lx) ,再进入正常光培养阶段 (2 500 lx)。平均培
养 40 d后调查诱导结果 ;并用含有 62BA0. 2、NAA0. 1
的 MS培养基继代 ,继代培养 30 d后调查后续效应。
1. 4 试验设计与计算方法
采用多因素完全区组试验设计 ,选择 62BA、2, 42
D、NAA作为外源激素。3种外源激素水平的梯度
设置分别是 : 62BA 为 0. 00、0. 50、1. 50、4. 50 mg·
L - 1 ; 2, 42D为 0. 00、0. 02、0. 06、0. 20、0. 60、2. 00 mg
·L - 1 ; NAA为 0. 00、0. 20 mg·L - 1。其中 NAA与
2, 42D同属于生长素类 ,仅设置 0. 00、0. 20两个梯度
作为参考。每个基因型为 48个激素处理组合 ,结合
4个基因型 (CMM、PET、CW I、CAH ) ,总共 192种处
理组合 ,每个组合处理重复 3次。
PLB诱导率 FO I( frequency of inducement ) =发
生体胚 (愈伤组织 )的外植体数 /接种外植体数 ,以
瓶为单位计算平均数。统计数据录入计算机用
SPSS程序作方差分析和显著性检验。
繁殖系数 PM ( p ropagation multip le ) =新发生
的 PLB总数 /每瓶接种消耗的试管苗数。其中“每
瓶接种消耗的拟鳞茎数 ”为实际等于“总的接种外
植体数 /试管苗基部平均切块数 ”。以瓶为单位计算
平均数 ,统计数据录入计算机用 SPSS程序分析。
诱导结果以外植体产生 PLB为标准 ,愈伤状增
生或单芽延长均不计 ,计算其诱导率。PLB颗粒状
多 ,浅绿色为生长良好。记录产生聚积的 PLB 团
数 , PLB总个数和产生 PLB的外植体的个数 ,以便统
计繁殖系数。
上述试验均以 200 mL的培养瓶接种 ,每瓶培养基
50 mL,每瓶接种外植体 50个 ,每个处理 3次重复。
2　结果与分析
外植体在含有 62BA、2, 42D和 NAA不同激素水
平的 MS培养基中 ,经过 1周黑暗诱导和 25 d弱光条
件下的恒温培养 ,外植体上开始长出大小不一的浅绿
色颗粒状组织 ,即 PLB。表 1列出本实验中部分诱导
效果较好的或有代表性的培养基的激素浓度。
直接观测发现 ,经过 1个多月的培养 ,不同处理
呈现单一 PLB、单一鳞芽或不同程度的桑葚状 PLB聚
集等情况 (图 1)。还有一些处理出现外植体褐化死
亡或 PLB呈现畸形松软等情况。在继代培养中 ,单一
鳞芽或单一 PLB一般直接发育成苗 ;而桑葚状 PLB
聚集团则逐步发育成簇生的小苗 ,或继续增殖形成较
大规模的桑葚状 PLB聚集团。图 1中依次反映了
CMM、PET、CW I、CAH等 4个基因型在各自最适激素
配比水平下 , PLB形成后桑葚状聚集的情况。
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第 4期 吴开云等 :大花蕙兰 (Cym bid ium hybridum )试管苗基部切块诱导类原球茎研究
图 1　不同基因型大花蕙兰拟球茎诱导的桑葚状 PLB聚集
表 1　部分培养基的激素浓度 mg·L - 1
处理号 2, 42D 62BA NAA
3 0. 20 0. 00 0. 00
9 0. 06 0. 50 0. 00
14 0. 02 1. 50 0. 00
19 0. 00 4. 50 0. 00
21 0. 06 4. 50 0. 00
30 2. 00 0. 00 0. 20
37 0. 00 1. 50 0. 20
45 0. 60 4. 50 0. 20
2. 1 M S添加不同浓度激素对试管苗基部切块诱
导 PL B的影响
培养到 40 d后统计 PLB的诱导率和繁殖系数。
大花蕙兰试管苗基部切块接种在含有不同激素水平
组合的 MS培养基上培养 ,诱导 PLB的效果存在明
显的差异 ,结果见图 2、3。各种处理组合的平均诱
导率为 4. 70% ～52. 90% ,平均繁殖系数 0. 10 ～
9150,即 1棵试管苗的基部切块平均诱导 0. 10～
9150个 PLB。
从图 2可以发现 ,大花蕙兰试管苗基部切块在
不同激素组合的 MS培养基上均能不同程度地发生
PLB诱导。在 2, 42D浓度较低的情况下 , PLB诱导
率较高 ;随着 2, 42D浓度逐渐增加 , PLB诱导率依次
降低 ;当 2, 42D达到 2. 00 mg·L - 1时 , PLB诱导率相
当于相邻的 0. 60 mg·L - 1处理水平的一半。值得注
意的是 , 2, 42D浓度为 0. 02 mg·L - 1的 PLB平均诱
导率比浓度为 0. 00 mg·L - 1的略低。图 2还反映了
不同 62BA 浓度对试管苗基部切块诱导 PLB 的影
响。在各个特定的 2, 42D浓度下 ,随着 62BA浓度的
递增 , PLB诱导率基本上呈现从低到高的变化趋势 ,
并且在 62BA浓度达到 1. 50～4. 50 mg·L - 1时 , PLB
诱导率呈现到达高峰然后略有下降的趋势。
不同激素处理水平下 , PLB繁殖系数的变化更
为明显。从图 3可以看出 ,当 2, 42D浓度为 0. 60 mg
·L - 1时 , PLB 诱导受到明显的抑制 ; 2, 42D 达到
2. 00 mg·L - 1时 , PLB诱导受到严重的抑制 ,基本上
不产生 PLB诱导。
NAA仅设置了 2个梯度水平 ,对 PLB诱导效果
未发现明显的的差异。
图 2　不同激素组合处理大花蕙兰试管
苗基部切块诱导 PLB的诱导率
图 3　不同激素组合处理大花蕙兰试管
苗基部切块诱导 PLB的繁殖系数
2. 2 不同基因型大花蕙兰对试管苗基部切块诱导
PL B的影响
本试验选用了 4个基因型 (品种 )大花蕙兰作为
试管苗基部切块诱导 PLB实验的材料。4个品种 48
个激素组合的外植体发生 PLB的情况存在明显差
异。图 4中的每个峰值分别反映了 48个不同激素
水平组合的平均繁殖系数的变化。从图 4可以发
现 , CW I的诱导率和繁殖系数均明显低于其它 3个
基因型 ,总平均繁殖系数为 CMM > CAH > PET >
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
CW I,而总平均诱导率为 CMM > PET > CAH > CW I (图略 )。
注 : 1⋯⋯24⋯⋯48为次级横坐标 ,表示培养基处理号依次为 1～48
图 4　不同基因型大花蕙兰及激素组合对试管苗基部切块诱导 PLB繁殖系数的影响
2. 3 不同处理因素的方差分析
方差分析结果 (表 2)表明 , 2, 42D和 62BA不同
处理水平对 PLB诱导效果达到了极显著差异 ( p <
0. 01) ;基因型之间的 PLB 诱导效果也达到极显著
差异 ,表明不同的品种适合使用不同的激素配比水
平。NAA在 0. 00 mg·L - 1和 0. 20 mg·L - 1 2个梯
度水平上的 PLB平均诱导率和平均繁殖系数均未
达到显著差异。重复处理之间有一定的差异 ,但未
达到显著水平。
表 2　不同激素组合和基因型对 PL B诱导率和 PL B繁殖系数影响的方差分析
方差来源 自由度
PLB诱导率
Ⅲ型方差 SS 均方 M S F值 p值
PLB繁殖系数
Ⅲ型方差 SS 均方 M S F值 p值
2, 42D 5 118 793. 37 23 758. 67 150. 593 3 0. 000 3 848. 596 769. 719 91. 9813 3 0. 000
62BA 3 7 033. 22 2 344. 41 14. 863 3 0. 000 978. 414 326. 138 38. 9733 3 0. 000
NAA 1 27. 70 27. 70 0. 183 3 0. 675 37. 707 37. 707 4. 5063 0. 034
基因型 3 25 762. 78 8 587. 59 54. 433 3 0. 000 723. 605 241. 202 28. 8233 3 0. 000
重复 2 1 590. 12 795. 06 5. 043 3 0. 007 15. 018 7. 509 0. 8973 3 0. 408
误差 561 88 512. 47 157. 78 4 694. 600 8. 370
合计 576 755 966. 65 18 565. 540
　　注 : 3 表示达到α = 0. 05显著水平 ; 3 3 表示达到α = 0. 01极显著水平。
　　根据表 2的 F值检验 ,影响 PLB诱导率的最主
要因子是 2, 42D,其次是基因型 ,然后是 62BA。对
PLB繁殖系数主要影响因子依次是 2, 42D、62BA、基
因型。
3 结论与讨论
试验结果表明 ,激素对大花蕙兰试管苗基部切
块诱导 PLB具有重要作用。从总体统计水平上看 ,
2, 42D 0. 00 mg·L - 1处理的 PLB诱导率和 PLB繁殖
系数均最高 ;但从具体的激素组合诱导效果看 , PLB
诱导率和 PLB 繁殖系数变化趋势不完全一致。各
个基因型有不同的最佳激素组合 ,所对应的 PLB繁
殖系数最高的 4个处理号的 2, 42D水平为 0. 00～0. 06 mg·L - 1。这种现象表明不同激素因子之间 ,以及激素与基因型之间存在复杂的交互作用。繁殖系数的高低反映了 PLB增殖和聚集的程度 ,因此繁殖系数更能反映不同处理水平在诱导 PLB效果上的差别。总的来说 ,低浓度的 2, 42D对 PLB诱导有促进作用 ,当 2, 42D浓度增加到 0. 06 mg·L - 1时 ,出现对 PLB的抑制趋势 ;在 2, 42D适合的情况下 , PLB繁殖系数随 62BA浓度的提高而增加 ,但当 62BA增加到 4. 50 mg·L - 1时 ,开始出现对 PLB的抑制趋势 ;NAA在有限的 2个梯度水平上的平均诱导效果差异不显著 ,但对于具体的基因型 PET有明显促进作用 ,如果提高 NAA水平 ,可能在平均诱导效果上出现显著差异。通过观察还发现 ,在不含 62BA的情况
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第 4期 吴开云等 :大花蕙兰 (Cym bid ium hybridum )试管苗基部切块诱导类原球茎研究
下 , PLB基本上单个发生 ,而且 PLB表面附生绒毛 ,
在含有细胞分裂素 62BA 或生长素 NAA 的培养基
中 , PLB表面没有附生绒毛 ,但 2, 42D对附生绒毛没
有明显影响。
基因型之间对于激素的反应有着不同程度的差
别。CMM比其它基因型更容易诱导 PLB,在 62BA
1. 50 mg·L - 1、2, 42D 0. 00～0. 02 mg·L - 1激素条件
下即可获得较好的诱导效果。CW I诱导 PLB 相对
比较困难 ,需要较高水平的 62BA和 2, 42D;当 62BA
4. 50 mg·L - 1、2, 42D 0. 06 mg·L - 1 L、NAA 0. 00～
0. 20 mg·L - 1时 , CW I诱导 PLB效果最好。CAH需
要较低的 62BA 和较高的 2, 42D。适当的生长素
NAA对 PET诱导 PLB有显著促进作用。
本试验采用完全区组试验设计 ,每个基因型设
置了 48个不同激素水平组合 ,比正交试验多设置了
24个组合。由于激素之间的交互作用比较强 ,完全
区组设计更容易直接发现适合特定基因型的最佳激
素水平组合。结果表明 ,最适合 CMM、CW I、CAH和
PET的 PLB诱导培养基分别为第 14、21、9和 37号
培养基 ,相应的激素水平分别为 2, 42D0. 02 + 62BA1. 50
+NAA0. 00、2, 42D0. 06 + 62BA4. 50 + NAA0. 00、2, 42D0. 06
+ 62BA0. 50 + NAA0. 00 和 2, 42D0. 00 + 62BA1. 50
+NAA0. 20。
大花蕙兰试管苗基部包含极短的茎和顶端生长
点 ,叶基部组织非常幼嫩 ,细胞处于分裂旺盛时期 ,
生理上与球根类植物的鳞茎有一定的相似性。本试
验选择健壮的试管苗基部的切块进行 PLB诱导 ,正
是利用了其在生理上的优势。本方法克服了外植体
来源限制 ,避免了 PLB反复继代诱导存在的变异积
累的风险 ,可以作为大花蕙兰转基因研究的植株再
生技术基础。
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