全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿袁圆远渊猿冤院圆愿员 圆愿远云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤园猿鄄园圆愿员鄄园远
基于 悦耘鄄粤云蕴孕的 缘个美洲黑杨新品种
指纹图谱分析
贾会霞袁 胡建军鄢袁 卢孟柱
渊林木遗传育种国家重点实验室袁中国林业科学研究院林业研究所袁国家林业局林木培育重点实验室袁北京摇 员园园园怨员冤
收稿日期院 圆园员圆鄄园员鄄员远
基金项目院 林业行业公益类重大专项 渊圆园员猿园源员园猿 冤曰 野 愿远猿 冶 计划 渊 圆园员员粤粤员园园圆园员 冤曰林木遗传育种国家重点实验室专项课题
渊悦粤云再月月圆园员圆园源员冤
作者简介院 贾会霞渊员怨愿苑要冤袁女袁硕士研究生援主要研究方向院林木遗传育种援 耘皂葬蚤造院澡怎蚤曾蚤葬赃躁蚤葬岳 员圆远援 糟燥皂
鄢 通讯作者院胡建军渊员怨远怨要冤袁男袁博士袁副研究员援主要研究方向院林木遗传育种援 耘皂葬蚤造院澡怎躁躁岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶
摘 要院以 缘 个美洲黑杨新品种渊丹红杨尧南杨尧中林 圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨冤为实验材料袁利用 悦耘鄄粤云蕴孕渊毛细管电
泳鄄粤云蕴孕冤技术袁采用 耘糟燥砸 陨 垣 猿 辕酝泽藻 陨 垣 猿 和 孕泽贼 陨 垣 圆 辕酝泽藻 陨 垣 猿 引物组合构建指纹图谱袁并进行遗传多样性分析遥 结
果表明院从 猿远 对引物组合中筛选出 员圆 对扩增条带数目多尧稳定且清晰的引物进行扩增袁共获得条带数 愿苑苑 条袁多态
性条带数 猿员缘 条袁平均多态率为 猿缘郾 怨圆豫 遥 采用 哉孕郧酝粤法进行聚类分析袁相似系数为 园郾 苑源 员郾 园园曰丹红杨与南杨
之间的差异较大曰在相似系数 园郾 怨愿 时袁中林 圆园圆缘 杨与中红杨和全红杨分为两类袁员员 条稳定特异的条带可以作为鉴
别它们的依据曰全红杨和中红杨之间未监测到稳定清晰的特异条带袁初步认为 圆 个品种在基因组水平上没有明显
差异遥
关键词院悦耘鄄粤云蕴孕曰美洲黑杨曰遗传多样性曰指纹图谱
中图分类号院杂苑员愿郾 源远摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码院粤
云蚤灶早藻则责则蚤灶贼 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 云蚤增藻 晕藻憎 悦怎造贼蚤增葬则泽 燥枣 孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
月葬泽藻凿 燥灶 悦耘鄄粤云蕴孕
允陨粤 匀怎蚤鄄曾蚤葬袁 匀哉 允蚤葬灶鄄躁怎灶袁 蕴哉 酝藻灶早鄄扎澡怎
渊杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 栽则藻藻 郧藻灶藻贼蚤糟泽 葬灶凿 月则藻藻凿蚤灶早袁 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁
运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 栽则藻藻 月则藻藻凿蚤灶早 葬灶凿 悦怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 燥枣 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 悦耘鄄粤云蕴孕渊悦葬责蚤造造葬则赠 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽鄄葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂冤 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 糟燥灶泽贼则怎糟贼 贼澡藻
枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼 葬灶凿 葬灶葬造赠扎藻 贼澡藻 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 枣蚤增藻 灶藻憎 糟怎造贼蚤增葬则泽 燥枣 孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
悦蕴援 耶阅葬灶澡燥灶早爷袁 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶晕葬灶爷袁 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶在澡燥灶早造蚤灶圆园圆缘爷袁 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶在澡燥灶早澡燥灶早爷袁
葬灶凿 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶匝怎葬灶澡燥灶早爷援 栽澡藻 责则蚤皂藻则 糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶泽 燥枣 耘糟燥砸 陨 垣 猿 辕酝泽藻 陨 垣 猿 葬灶凿 孕泽贼 陨 垣 圆 辕酝泽藻 陨 垣 猿 憎藻则藻
怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 员圆 责葬蚤则泽 燥枣 责则蚤皂藻则泽 糟燥怎造凿 遭藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 皂葬灶赠 泽贼葬遭造藻 葬灶凿 糟造藻葬则 葬皂责造蚤鄄
枣蚤藻凿 遭葬灶凿泽 蚤灶 葬造造 贼澡藻 猿远 责则蚤皂藻则 责葬蚤则泽援 愿苑苑 遭葬灶凿泽 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 猿员缘 责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 遭葬灶凿泽袁 葬灶凿 贼澡藻 责燥造赠皂燥则鄄
责澡蚤泽皂 枣则藻择怎藻灶糟赠 憎葬泽 猿缘郾 怨圆豫 援 哉孕郧酝粤 糟造怎泽贼藻则 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 则葬灶早藻凿 枣则燥皂 园郾 苑源 贼燥
员郾 园园援 栽澡藻 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 遭藻贼憎藻藻灶 耶阅葬灶澡燥灶早爷 葬灶凿 耶晕葬灶爷 憎葬泽 造葬则早藻援 栽澡藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 燥枣 耶 在澡燥灶早澡燥灶早爷 葬灶凿
耶匝怎葬灶澡燥灶早爷 憎蚤贼澡 耶在澡燥灶早造蚤灶圆园圆缘爷 憎葬泽 园郾 怨愿援 员员 泽贼葬遭造藻 葬灶凿 糟造藻葬则 泽责藻糟蚤枣蚤糟 遭葬灶凿泽 糟燥怎造凿 遭藻 怎泽藻凿 贼燥 蚤凿藻灶贼蚤枣赠 贼澡藻泽藻 糟怎造鄄
贼蚤增葬则泽援 栽澡藻则藻 憎藻则藻 灶燥贼 凿藻贼藻糟贼藻凿 泽贼葬遭造藻 葬灶凿 糟造藻葬则 泽责藻糟蚤枣蚤糟 遭葬灶凿泽 遭藻贼憎藻藻灶 耶在澡燥灶早澡燥灶早爷 葬灶凿 耶匝怎葬灶澡燥灶早爷援 陨贼 泽怎早早藻泽鄄
贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 增葬则蚤葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 贼憎燥 糟怎造贼蚤增葬则泽 憎葬泽 灶燥贼 凿则葬皂葬贼蚤糟援
运藻赠 憎燥则凿泽院 悦耘鄄粤云蕴孕曰 孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽曰 枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼曰 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
杨树是营造速生丰产林尧防护林尧水土保持林和
四旁绿化林极为重要的树种遥 近百年来袁世界各国
的杨树改良育种工作发展迅速袁通过杂交育种已培
育出许多优良品种袁如院玉鄄远怨 杨渊孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
糟增援 耶 蕴怎曾爷冤尧玉鄄苑圆 杨 渊 孕援 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬 糟增援 耶 杂葬灶
酝葬则贼蚤灶燥爷冤尧玉鄄远猿 杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 糟增援 耶匀葬则增葬则凿爷冤尧缘园
号杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶缘缘 辕 缘远爷冤尧猿远 号杨渊孕援 凿藻造鄄
贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶圆运耘晕愿爷冤尧员园苑 杨 渊 孕援 伊 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬
糟增援 耶 苑源 辕 苑远 爷冤 和 员园愿 杨 渊 孕援 伊 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬 糟增援
耶郧怎葬则蚤藻灶贼燥爷冤等遥 从 圆园 世纪 远园尧苑园 年代开始袁我国
先后引入了这些优良品种袁主要用于速生丰产林袁种
植广泛袁产生了巨大的经济效益咱员 原 猿暂 遥 在国内袁杨树
的育种工作也在迅速进行袁通过常规杂交育种技术袁
培育出许多速生杨树新品种袁如院南抗杨渊孕援 凿藻造鄄
贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶 晕葬灶噪葬灶早爷冤尧创新杨 渊 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援
耶载蚤灶泽澡蚤躁蚤爷冤尧丹红杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶阅葬灶澡燥灶早爷冤尧
南杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶晕葬灶爷冤尧中林 源远 杨渊孕援 凿藻造鄄
贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶在澡燥灶早造蚤灶源远爷冤尧中林 圆园圆缘 杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
悦蕴援 耶在澡燥灶早造蚤灶圆园圆缘爷冤等咱源暂 曰通过基因工程育种培育
出的世纪杨渊孕援 灶蚤早则葬 悦 蕴援 耶员圆爷冤袁大田抗食叶害虫
效果显著袁在我国已得到了商业化种植咱缘暂 遥 近几年袁
丹红杨和南杨因其速生尧抗病虫害尧易成活和干形通
直等优良性状袁在黄河中下游尧长江流域等广大地区
推广种植取得了成功咱远 原 苑暂 曰而中红杨 渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
悦蕴援 耶在澡燥灶早澡燥灶早爷冤和全红杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽 悦蕴援 耶匝怎葬鄄
灶澡燥灶早爷冤因其叶子为红叶袁雄株袁无飞絮袁用于道路尧
城市郊区尧四旁绿化中袁具有立地成林尧立地成景的
效果咱愿暂 遥 目前袁这几个美洲黑杨种内杂交种在生产
上多采用形态特征进行区别袁但它们的遗传差异如
何袁在基因组水平上的鉴定未见相关报道遥
目前袁对植物基因组水平上的鉴定常采用分子
标记的方法袁其中袁粤云蕴孕渊扩增片段长度多态性冤 咱怨暂
是一种检测 阅晕粤多态性效应最高的分子标记方法袁
由于该技术多态性高尧重复性好袁能分辨出很小的种
质遗传差异袁是一种非常理想的 阅晕粤 分子标记技
术袁已被广泛用于种质遗传多样性和品种鉴定等研
究中咱员园 原 员猿暂 遥 尹佟明等咱员源暂利用 粤云蕴孕对 源圆 个美洲黑
杨无性系进行了指纹图谱分析袁宋红竹等咱员缘暂利用
粤云蕴孕对杨属 缘 个派中 圆园 个种及杂种的 源源 份材料
进行遗传多样性分析袁李金花等咱员远暂利用 粤云蕴孕 技术
建立了 员园 个北方黑杨派栽培品种的指纹图谱袁李淑
娴等咱员苑暂对松属树种的种苗进行了 粤云蕴孕指纹鉴定的
研究袁王利等咱员愿暂利用 粤云蕴孕对 源怨 个银杏雌株种质进
行了遗传关系研究袁闵会等咱员怨暂对香榧天然群体的遗
传多样性进行了 粤云蕴孕 分析遥 悦耘鄄粤云蕴孕渊毛细管电
泳鄄粤云蕴孕冤是在 粤云蕴孕 的基础上袁采用 悦耘 技术检测
荧光扩增产物的一种新型的高通量检测方法咱圆园 原 圆猿暂 袁
具有操作简便尧分辨率高尧效率高尧自动统计数据等
优点遥 季鹏章咱圆源暂等利用 悦耘鄄粤云蕴孕 对西双版纳地区
的 源 个古茶园和 圆 个台地茶园进行了遗传多样性分
析袁李凤霞等咱圆缘暂采用此方法对 圆愿 份烟草野生种和 缘
份栽培种进行了荧光 粤云蕴孕 分析遥 本研究采用 悦耘鄄
粤云蕴孕 对丹红杨尧南杨尧中林 圆园圆缘 杨尧中红杨和全红
杨 缘 个美洲黑杨新品种进行遗传多样性分析袁并构
建其指纹图谱袁从分子水平上为新品种鉴定与保护
提供科学的理论依据遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 材料
丹红杨和南杨是中国林业科学研究院培育出来
的速生杨树新品种袁是以我国从意大利引进的 圆 个
美洲黑杨无性系 缘园 号杨为母本尧猿远 号杨为父本袁通
过杂交育种选育的 圆 个优良无性系袁适合速生丰产
林尧农田防护和四旁绿化遥 中菏 员 号杨渊孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽
月葬则贼则 悦 蕴援 耶在澡燥灶早澡藻鄄员爷冤袁又名中林 圆园圆缘 杨袁是中国
林业科学研究院林业研究所黄东森以玉鄄远怨 杨为母
本袁以意大利罗马农林研究中心提供的美洲黑杨为
父本袁经过杂交选育得到的优良无性系遥 中红杨来
源于中林 圆园圆缘 杨的芽变袁是河南省林科院朱延林等
培育得到的杨树新品种遥 全红杨是在中红杨的基础
上进一步选育而来袁与中红杨相比袁红叶期更长袁且
叶柄尧叶脉和树干为紫红色遥
丹红杨和南杨采自中国林业科学研究院苗圃袁
中林 圆园圆缘 杨尧中红杨尧全红杨渊包括全红杨原株尧返
祖苗尧夏季嫁接苗和 圆 根 员 杆平茬苗冤由北京万林园
生态科技有限公司提供遥 圆园员员 年 怨 月收集 缘 个美洲
黑杨品种袁在温室扦插育苗袁员园 月下旬萌发出嫩叶袁
采集嫩叶放入自封袋中袁用冰盒带回实验室置于
原 愿园 益冰箱中备用袁室内试验在中国林科院林木遗
传育种国家重点实验室进行袁分别做了 圆 次生物学
重复和 猿 次技术重复遥
员援 圆摇 阅晕粤的提取
采用 悦栽粤月 法遥 取 圆 猿 片冷冻保藏的嫩叶放
入研钵中袁液氮研磨袁研磨后放入 圆 皂蕴离心管中袁加
入 愿园园 滋蕴 远缘 益预热的 圆 伊 悦栽粤月 缓冲液袁水浴 猿园
皂蚤灶袁室温冷却后加入 愿园园 滋蕴 饱和酚 辕氯仿 辕异戊醇
圆愿圆
第 猿 期 贾会霞等院基于 悦耘鄄粤云蕴孕的 缘 个美洲黑杨新品种指纹图谱分析
混合液渊灾 辕 灾 辕 灾 越 圆缘颐 圆源颐 员冤袁轻柔混匀后袁员圆 园园园 则窑
皂蚤灶 原员离心 员园 皂蚤灶遥 取 苑园园 滋蕴的上清液转入新离心
管中袁加入等体积的饱和酚 辕氯仿 辕异戊醇混合液混
匀袁员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 员园 皂蚤灶遥 取 远园园 滋蕴 的上清
液加入 圆 倍体积预冷的无水乙醇袁 原 圆园 益静置 猿园
皂蚤灶后袁员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 员园 皂蚤灶遥 用 苑园豫乙醇
洗涤 圆 次袁自然条件下风干袁加入 源园园 滋蕴 灭菌
凿凿匀圆韵溶解 阅晕粤袁溶解完全后袁加入 园郾 缘 滋蕴 砸晕葬泽藻
渊员园 皂早窑皂蕴 原员冤袁猿苑 益水浴 猿园 皂蚤灶遥 加入等体积的
饱和酚 辕氯仿 辕异戊醇混合液混匀袁员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员
离心 员园 皂蚤灶遥 取上清袁用 圆 倍体积的无水乙醇沉淀
阅晕粤袁员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 圆园 皂蚤灶遥 洗涤风干后袁加
入 缘园 滋蕴的灭菌 凿凿匀圆韵 溶解 阅晕粤遥 员郾 园豫 粤早则燥泽藻 凝
胶电泳检测 阅晕粤 质量遥 用紫外分光光度计测定样
品 阅晕粤的浓度和纯度袁将浓度稀释至 圆园园 灶早窑蕴 原员袁
置于 原圆园 益冰箱中备用遥
员援 猿摇 粤云蕴孕分析
粤云蕴孕分析方法按照吕金辉等咱圆远暂在柳树上建立
的体系袁仅对酶切部分进行改进遥 采用 耘糟燥砸 陨 辕 酝泽藻
陨和 孕泽贼 陨 辕 酝泽藻 陨两组限制性内切酶进行双酶切袁酶
切体系院员园 伊 遭怎枣枣藻则 圆 滋蕴袁内切酶各 园郾 缘 滋蕴袁阅晕粤 圆
滋蕴袁员园园 伊 月杂粤 园郾 圆 滋蕴袁灭菌 凿凿匀圆韵 员源郾 愿 滋蕴袁总体积圆园 滋蕴曰猿苑 益过夜酶切遥 选择性扩增采用 耘糟燥砸 陨 垣
猿 辕酝泽藻 陨 垣 猿 和 孕泽贼 陨 垣 圆 辕酝泽藻 陨 垣 猿 引物组合袁其中袁
酝泽藻 陨 垣 猿 引物的 缘忆端加 悦赠缘 荧光袁选择性扩增的产
物上均带有荧光遥
采用 悦耘技术检测选择性扩增产物袁选择性扩
增后的荧光产物于 郧藻灶燥皂藻蕴葬遭 郧藻载孕 遗传分析系统
中进行毛细管电泳遥 将甲酰胺与 源园园 遭责内标按 员园园
颐 员 的体积比混匀后袁吸取 圆园 滋蕴 加入上样板中袁再
加入 园郾 猿 园郾 缘 滋蕴选择性扩增产物袁离心后加一滴
矿物油防止样品蒸发袁然后用 悦耘匝 愿园园园 遗传分析仪
进行毛细管电泳遥 悦耘 检测程序院变性 怨园 益袁员圆园 泽曰
吸样 圆郾 园 噪增袁员圆园 泽曰分离 远郾 园 噪增袁源园 皂蚤灶遥
员援 源摇 数据分析
郧藻曾责系统中的 云则葬早皂藻灶贼泽 片段分析软件可对数
据库收集的原始数据进行分析袁将各泳道内分子量
内标的位置与各样品峰值的位置做比较袁得到片段
大小范围为 远园 源园园 遭责遥 根据荧光信号识别的片
段数据结合 悦耘 图袁将有峰值的位置记为 员袁无峰值
记为 园袁转换为 园尧员 矩阵曰然后对各种重复间的差异
进行比较袁将重复性好且条带清晰的条带记为 员袁将
重复性差的带型剔出袁调整仪器自动输出的矩阵值遥
采取用 晕栽杂再杂圆郾 员园 分析软件中的 杂酝渊简单系数匹
配冤法计算样品种间的相似系数袁并用 杂粤匀晕 悦造怎泽贼藻鄄
则蚤灶早进行 哉孕郧酝粤渊非加权成对算术平均法冤进行聚
类分析袁最后通过 栽则藻藻 责造燥贼 模块生成聚类图遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 阅晕粤质量检测
高质量的基因组 阅晕粤 是进行 粤云蕴孕 实验和数
据分析的前提条件遥 本实验采用 悦栽粤月 法提取的基
因组 阅晕粤袁电泳图条带清晰袁没有弥散带渊图 员冤袁
粤圆远园 辕 粤圆愿园 介于 员郾 愿 圆郾 园 之间袁粤圆远园 辕 粤圆猿园 大于
圆郾 园袁说明所提取的基因组 阅晕粤 完整且质量较高袁
符合 粤云蕴孕实验要求渊图 员冤遥
图 员摇 缘 个美洲黑杨新品种基因组 阅晕粤 提取后电泳检测结果
圆援 圆摇 酶切连接结果检验
酶切和连接是否完全直接影响到 粤云蕴孕 结果的
准确性袁通过预扩增电泳结果检测遥 预扩增后取 愿
滋蕴于 员豫琼脂糖胶上电泳袁结果显示院阅晕粤 酶切完
全袁连接尧预扩增后能够扩增出大量的产物渊图 圆冤遥
图 圆摇 引物 耘糟燥砸 陨 垣 粤 辕 酝泽藻 陨 垣 悦对 缘 个美洲黑杨新品种
样品 阅晕粤预扩增的电泳结果
圆援 猿摇 粤云蕴孕多态性分析
从 猿远 对引物组合中筛选出 员圆 对扩增条带较多
且较稳定的引物组合袁对 愿 个样品进行扩增袁扩增条
带多分布在 远园 源园园 遭责 之间袁获得总条带 愿苑苑 条袁
多态性条带共 猿员缘 条袁平均多态率为 猿缘郾 怨圆豫 袁员圆 对
引物的多态率为 圆远郾 愿苑豫 缘园郾 苑苑豫 渊表 员冤遥
猿愿圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
表 员摇 员圆 对不同引物组合的扩增结果
引物组合 总条带 辕条 多态性条带 辕条 多态率 辕 豫
耘粤粤郧 辕 酝悦栽栽 远圆 圆怨 源远援 苑苑
耘粤悦粤 辕 酝悦粤栽 缘猿 圆猿 源猿援 源园
耘粤粤郧 辕 酝悦粤粤 远圆 圆园 猿圆援 圆远
孕悦粤 辕 酝粤粤郧 员员远 猿缘 猿园援 员苑
孕悦悦 辕 酝粤悦悦 缘园 圆员 源圆援 园园
孕悦粤 辕 酝悦粤郧 苑愿 猿园 猿愿援 源远
孕悦悦 辕 酝悦粤郧 缘远 圆员 猿苑援 缘园
孕悦悦 辕 酝悦粤栽 远苑 员愿 圆远援 愿苑
孕粤粤 辕 酝悦栽郧 员园园 圆苑 圆苑援 园园
孕悦悦 辕 酝悦栽栽 缘缘 圆缘 源缘援 源缘
孕粤粤 辕 酝郧郧悦 远缘 猿猿 缘园援 苑苑
孕悦粤 辕 酝栽栽郧 员员猿 猿猿 圆怨援 圆园
总数 愿苑苑 猿员缘 猿缘援 怨圆
平均 苑猿援 园愿 圆远援 圆缘 猿缘援 怨圆
摇 摇 员圆 对引物均能检测到丹红杨和南杨之间的特
异条带袁缘 对引物 渊 孕悦悦 辕 酝粤悦悦尧孕悦粤 辕 酝悦粤郧尧孕悦悦 辕
酝悦粤栽尧孕粤粤 辕 酝悦栽郧 和 孕悦粤 辕 酝栽栽郧冤能检测到 圆园圆缘
杨和中红杨之间有 员员 条特异条带袁孕悦悦 辕 酝粤悦悦 和
孕悦悦 辕 酝悦粤栽各能检测到 员 条特异条带袁孕悦粤 辕 酝悦粤郧
检测到 圆 条特异条带袁孕悦粤 辕 酝栽栽郧 检测到 猿 条特异
条带袁孕粤粤 辕 酝悦栽郧检测到 源 条特异条带曰但是全红杨
渊原株尧返祖苗尧嫁接苗和平茬苗冤和中红杨的带型
之间没有明显清晰的带型差异遥 图 猿 为 孕粤粤 辕
酝悦栽郧对 缘 个品种在 员缘园 圆缘园 遭责 范围内的扩增图
谱袁全红杨为平茬苗的图谱遥
圆援 源摇 聚类分析
将 员圆 对引物组合扩增出的条带作为原始矩阵袁
用 晕栽杂再杂圆援 员园 软件计算并分析这 缘 个杨树品种之
图 猿摇 引物组合 孕粤粤 辕 酝悦栽郧对 缘 个杨树品种的扩增图谱渊员缘园 圆缘园 遭责冤
源愿圆
第 猿 期 贾会霞等院基于 悦耘鄄粤云蕴孕的 缘 个美洲黑杨新品种指纹图谱分析
间的遗传相似度袁 获得聚类图渊图 源冤遥 在相似系数
为 园郾 苑源猿 时可以分为 圆 大类群袁丹红杨与 圆园圆缘 杨尧
中红杨和全红杨聚为 员 类袁南杨独自为 员 类曰在相似
系数为 园郾 愿猿猿 时袁圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨与丹红杨
分开曰在相似系数为 园郾 怨愿园 时袁中红杨和全红杨聚为
员 类袁与 圆园圆缘 杨分开曰最后袁全红杨原株尧返祖苗尧嫁
接苗和平茬苗聚在一起遥 由此可见袁丹红杨和南杨
虽然都来自同一亲本袁但在基因组上存在较大的差
异曰圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨属于同一无性系袁但由
于长期扩繁尧选育或环境影响袁基因组之间存在细微
的差异遥
圆援 缘摇 指纹图谱构建
根据 员圆 对引物扩增的多态性条带构建 缘 个杨
树品种的 阅晕粤 指纹图谱袁在所构建的指纹图谱中
渊表 圆冤袁丹红杨尧南杨尧中林 圆园圆缘 杨尧中红杨都有自
图 源摇 基于 粤云蕴孕结果的 愿 份材料的聚类图
身独特的带型袁可以作为品种鉴定的理论依据袁然而
中红杨和全红杨之间的带型几乎没有差异遥
表 圆摇 引物组合 孕粤粤鄄酝悦栽郧对 缘 个美洲黑杨新品种构建的指纹图谱
品种 片段 辕 遭责远苑 愿苑 怨圆 怨猿 怨愿 员园怨 员圆园 员苑苑 员怨园 圆园猿 圆园怨 圆员缘 圆员苑 圆猿缘 圆猿怨 圆源愿 圆缘怨 圆苑苑 圆怨园 圆怨圆 圆怨源 圆怨缘 圆怨怨 猿怨愿 猿怨怨
丹红杨 园 园 员 员 员 园 园 员 员 园 园 园 园 园 园 园 园 园 园 员 园 园 园 员 园
南杨摇 员 员 员 园 园 员 员 园 员 员 员 员 员 园 员 园 员 员 员 员 园 员 员 园 员
中林 圆园圆缘 杨 员 园 园 园 员 员 园 园 员 园 园 园 园 员 园 员 员 园 园 园 员 园 园 园 员
中红杨 园 园 园 园 员 员 园 园 园 园 园 园 园 园 园 园 员 园 园 园 员 园 园 园 员
全红杨 园 园 园 园 员 员 园 园 园 园 园 园 园 园 园 园 员 园 园 园 员 园 园 园 员
猿摇 结论与讨论
本研究利用 悦耘鄄粤云蕴孕 成功构建了丹红杨尧南
杨尧中林 圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨的指纹图谱袁并进
行了遗传多样性分析袁可以作为鉴别这些品种的理
论依据遥 实验结果显示院丹红杨与南杨之间的差异
较大曰中林 圆园圆缘 杨与中红杨之间存在较小差异袁员员
条稳定特异的带型可以作为鉴别它们的依据曰全红
杨和中红杨之间未监测到稳定清晰的特异条带遥
丹红杨和南杨虽然具有同样的母本渊缘园 号杨冤
和父本渊猿远 号杨冤袁但相似系数为 园援 苑源袁说明这 圆 个
品种基因组之间存在许多差异遥 丹红杨为雌株袁南
杨为雄株袁这可能是其造成差异的原因之一遥 丹红
杨与 圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨来自不同的父母本袁
却聚为一类袁这是由于 圆园圆缘 杨确切的父本未知袁该
父本可能与 猿远 号杨的亲缘关系较近曰杂交时花粉可
能受到污染曰由于长期扩繁的原因造成材料发生混
乱遥 冯锦霞等咱圆苑暂在利用荧光 杂杂砸 技术对丹红杨和
巨霸杨渊南杨冤与亲本进行亲子鉴定时袁也发现丹红
杨有 圆 个 杂杂砸位点在亲本中没有出现袁不符合孟德
尔遗传定律遥 本实验没有对父母本进行鉴定袁且与
冯锦霞取样地一样袁所以确切原因还需进一步的
研究遥
中林 圆园圆缘 杨尧中红杨和全红杨属于同一无性
系袁前 圆 个品种之间存在明显的带型差异袁但是全红
杨和中红杨之间没有监测到非常稳定清晰的特异条
带遥 在利用 粤云蕴孕对植物进行指纹图谱构建和遗传
多样性分析的研究中袁通常筛选出 源 员远 对条带数
目多且分辨率高的引物组合进行鉴定咱圆愿 原 猿员暂 遥 在本
研究中袁采用 员圆 对引物组合未能将全红杨和中红杨
区分开袁初步说明两个品种在基因组水平上差异不
明显遥
由于传统的 粤云蕴孕标记是通过聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测扩增片段袁程序繁琐尧可读性低且容易判读
错误遥 悦耘 技术一次可进行 怨远 孔板的检测袁片段大
小可以精确到 员 遭责袁并且可以将扩增条带自动转化
成 园尧员 矩阵袁克服了传统 粤云蕴孕 的缺点袁具有效率
高尧灵敏度高等优点袁应用前景广阔遥 近年来袁有研
究将 粤云蕴孕 的扩增产物通过回收尧克隆尧测序尧设计
引物和再扩增袁转化 杂悦粤砸渊序列特异扩增区域冤共
缘愿圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
显性标记袁 可迅速尧 简便尧高效地检测大量样
本咱猿圆 原 猿远暂 袁因此袁在今后杨树指纹图谱的构建中可以
大力开展 杂悦粤砸标记的研究遥
参考文献院
咱员暂 方升佐援 中国杨树人工林培育技术研究进展咱 允暂 援 应用生态学
报袁 圆园园愿袁 员怨渊员园冤院 圆猿园愿 原 圆猿员远
咱圆暂 刘喜荣袁安摇 丽袁 刘长敏袁 等援 廊坊地区黑杨派新无性系引种试
验结果初报咱允暂 援 林业实用技术袁 圆园园怨渊苑冤院 圆猿 原 圆源
咱猿暂 王会刚袁 马鸿鹏袁 田新辉袁 等援 员园 个速生杨品系对比试验研究
咱允暂 援 河北林果研究袁 圆园园怨袁 圆源渊源冤院 猿缘苑 原 猿远员
咱源暂 陈章水援 杨树栽培实用技术咱酝暂援 北京院 中国林业出版社袁
圆园园缘院员员缘 原 员圆愿
咱缘暂 胡建军袁 李淑梅袁 卢孟柱袁 等援 转 月贼基因欧洲黑杨抗虫稳定性
及其对天敌昆虫的影响咱允暂 援 林业科学研究袁 圆园园苑袁 圆园渊缘冤院 远缘远
原 远缘怨
咱远暂 张春玲袁 李淑梅袁 赵自成袁 等援 杨树新品种耶丹红杨爷咱 允暂 援 林业
科学袁 圆园园愿袁 源源渊员冤院 员远怨
咱苑暂 韩文超援 速生抗虫杨树新品种鄄巨霸咱允暂 援 农村实用技术与信息袁
圆园园缘渊员圆冤院猿苑
咱愿暂 朱延林袁 程相军援 杨树新品种鄄中红杨咱允暂 援 林业科学袁 圆园园愿袁 源源
渊员园冤院员苑猿 原 员苑源
咱怨暂 灾燥泽 孕袁 匀燥早藻则泽 砸袁 月造藻藻噪藻则 酝袁 藻贼 葬造援 粤云蕴孕院 葬 灶藻憎 贼藻糟澡灶蚤择怎藻 枣燥则
阅晕粤 枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼蚤灶早咱 允暂 援 晕怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿泽 则藻泽藻葬则糟澡袁 员怨怨缘袁 圆猿 渊圆员冤院
源源园苑 原 源源员源
咱员园暂 酝怎造怎增蚤 郧袁 杂责则藻灶贼 允袁 杂燥则葬灶扎燥 晕袁 藻贼 葬造援 粤皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡
责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 渊粤云蕴孕冤 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 增葬则蚤葬贼蚤燥灶 蚤灶 酝燥则蚤灶早葬 燥造藻鄄
蚤枣藻则葬 蕴葬皂咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 耘糟燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 愿渊猿冤院 源远猿 原 源苑园
咱员员暂 杂澡葬则皂葬 杂 运袁 运灶燥曾 酝 砸袁 耘造造蚤泽 栽 匀 晕援 粤云蕴孕 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 凿蚤增藻则鄄
泽蚤贼赠 葬灶凿 责澡赠造燥早藻灶赠 燥枣 蕴藻灶泽 葬灶凿 蚤贼泽 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶 憎蚤贼澡 砸粤孕阅 葬灶葬造赠泽蚤泽
咱允暂 援 栽粤郧 栽澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 葬灶凿 粤责责造蚤藻凿 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁 员怨怨远袁 怨猿渊缘冤院 苑缘员
原 苑缘愿
咱员圆暂 张书芬袁 傅廷栋袁 马朝芝袁 等援 猿 种分子标记分析油菜品种间的
多态性效率比较咱允暂援 中国油料作物学报袁 圆园园缘袁 圆苑渊圆冤院 员怨 原圆猿
咱员猿暂 灾怎赠造泽贼藻噪藻 酝袁 孕藻造藻皂葬灶 允 阅袁 灾葬灶 耘蚤躁噪 酝 允 栽援 粤云蕴孕 贼藻糟澡灶燥造燥早赠 枣燥则
阅晕粤 枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼蚤灶早 咱 允暂 援 晕葬贼怎则藻 责则燥贼燥糟燥造泽袁 圆园园苑袁 圆 渊远 冤院 员猿愿苑
原 员猿怨愿
咱员源暂 尹佟明袁孙摇 晔援 美洲黑杨无性系 粤云蕴孕 指纹分析咱允暂 援 植物学
报院英文版袁 员怨怨愿袁 源园渊愿冤院 苑苑愿 原 苑愿园
咱员缘暂 宋红竹袁 张绮纹袁 周春江援 杨树部分种的 粤云蕴孕 遗传多样性分
析咱允暂 援 林业科学袁 圆园园苑袁 源猿渊员圆冤院 远源 原 远怨
咱员远暂 李金花袁 宋红竹袁 周春江袁 等援 北方地区黑杨派栽培品种的
粤云蕴孕 指纹分析咱允暂 援 林业科学研究袁 圆园园怨袁 圆圆渊圆冤院 圆园苑 原 圆员圆
咱员苑暂 李淑娴袁 陈志银袁 沈永宝袁 等援 松属树种种苗鉴定中 粤云蕴孕 指
纹技术的研究咱允暂 援 南京林业大学学报院自然科学版袁 圆园园猿袁 圆苑
渊猿冤院 员 原 远
咱员愿暂 王摇 利袁 邢世岩袁 王摇 芳袁 等援 银杏雌株种质遗传关系的 粤云蕴孕
分析咱允暂 援 林业科学袁 圆园园愿袁 源源渊源冤院 源愿 原 缘猿
咱员怨暂 闵摇 会袁 程诗明袁 康志雄袁 等援 香榧天然群体遗传多样性的
粤云蕴孕分析咱允暂 援 林业科学研究袁 圆园园怨袁 圆圆渊猿冤院 猿远苑 原 猿苑圆
咱圆园暂 宰燥灶早 运袁 悦澡怎葬灶 再袁 粤早早葬则憎葬造 粤袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣赠蚤灶早 责葬贼贼藻则灶泽 燥枣 阅晕粤
枣燥则 贼怎皂燥则 凿蚤葬早灶燥泽蚤泽 怎泽蚤灶早 糟葬责蚤造造葬则赠 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽鄄葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早鄄
皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 渊悦耘鄄粤云蕴孕冤 泽糟则藻藻灶蚤灶早咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
月蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤糟泽 葬灶凿 悦燥皂责怎贼葬贼蚤燥灶葬造 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园源袁 圆渊猿冤院 缘远怨 原 缘愿愿
咱圆员暂 蕴怎燥 酝 悦袁 栽澡燥皂葬泽 悦袁 再燥怎 云 酝袁 藻贼 葬造援 匀蚤早澡鄄贼澡则燥怎早澡责怎贼 枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼鄄
蚤灶早 燥枣 遭葬糟贼藻则蚤葬造 葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 糟澡则燥皂燥泽燥皂藻泽 怎泽蚤灶早 贼澡藻 泽灶葬责泽澡燥贼 造葬遭藻造蚤灶早
噪蚤贼 葬灶凿 泽蚤扎蚤灶早 燥枣 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 枣则葬早皂藻灶贼泽 遭赠 糟葬责蚤造造葬则赠 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽
咱允暂 援 郧藻灶燥皂蚤糟泽袁 圆园园猿袁 愿圆渊猿冤院 猿苑愿 原 猿愿怨
咱圆圆暂 酝葬早怎蚤则藻 栽袁 孕藻葬噪葬造造 砸袁 杂葬藻灶早藻则 孕援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟
凿蚤增藻则泽蚤贼赠 蚤灶 贼澡藻 皂葬灶早则燥增藻 泽责藻糟蚤藻泽 粤增蚤糟藻灶灶蚤葬 皂葬则蚤灶葬 渊 云燥则泽噪援 冤 灾蚤鄄
藻则澡援 渊粤增蚤糟藻灶灶蚤葬糟藻葬藻冤 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 粤云蕴孕泽 葬灶凿 杂杂砸泽咱允暂 援 栽粤郧 栽澡藻鄄
燥则藻贼蚤糟葬造 葬灶凿 粤责责造蚤藻凿 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁 圆园园圆袁 员园源渊圆冤院 猿愿愿 原 猿怨愿
咱圆猿暂 运葬则葬糟葬 酝袁 杂葬澡葬 杂袁 在蚤责枣 粤援 郧藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 葬皂燥灶早 枣燥则葬早藻 遭藻则皂怎凿鄄
葬早则葬泽泽渊悦赠灶燥凿燥灶 泽责责援 冤院藻增蚤凿藻灶糟藻 枣则燥皂 糟澡造燥则燥责造葬泽贼 葬灶凿 灶怎糟造藻葬则 阅晕粤
枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼蚤灶早咱允暂 援 悦则燥责 泽糟蚤藻灶糟藻袁圆园园圆袁源圆渊远冤院圆员员愿 原 圆员圆苑
咱圆源暂 季鹏章袁 蒋会兵袁 黄兴奇袁 等援 古茶园袁 台地茶园遗传多样性
的 粤云蕴孕分析咱允暂 援 遗传袁 圆园园怨袁 猿员渊员冤院 员园员 原 员园愿
咱圆缘暂 李凤霞袁 王卫锋袁 王摇 鲁袁 等援 烟草属植物遗传多样性和亲缘
进化关系的荧光 粤云蕴孕 分析 咱 允暂 援 中国农业科学袁 圆园员园袁 源猿
渊员圆冤院 圆源员愿 原 圆源圆苑
咱圆远暂 吕金辉袁 胡建军袁 卢孟柱援 基于毛细管电泳的柳树 粤云蕴孕 分子
标记研究咱允暂 援 北京林业大学学报袁 圆园员圆袁 猿源渊员冤院 缘员 原 缘苑
咱圆苑暂 冯锦霞袁 张川红袁 郑勇奇袁 等援 利用荧光 杂杂砸标记鉴别杨树品
种咱允暂 援 林业科学袁 圆园员员袁 源苑渊远冤院 员远苑 原 员苑源
咱圆愿暂 酝葬 匝袁 在澡葬灶早 允袁 孕藻蚤 阅援 郧藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 宰葬造灶怎贼 糟怎造贼蚤增葬则泽 蚤灶 悦澡蚤鄄
灶葬 怎泽蚤灶早 枣造怎燥则藻泽糟藻灶贼 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂咱 允暂 援
允燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 粤皂藻则蚤糟葬灶 杂燥糟蚤藻贼赠 枣燥则 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园员员袁
员猿远渊远冤院源圆圆 原 源圆愿
咱圆怨暂 月则葬早造蚤葬 蕴袁 月则怎灶葬 杂袁 蕴葬灶贼藻则蚤 杂袁 藻贼 葬造援 粤灶 粤云蕴孕鄄遭葬泽藻凿 葬泽泽藻泽泽皂藻灶贼
燥枣 贼澡藻 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 憎蚤贼澡蚤灶 匀蚤遭蚤泽糟怎泽 则燥泽葬鄄泽蚤灶藻灶泽蚤泽 葬灶凿 蚤贼泽 责造葬糟藻
憎蚤贼澡蚤灶 贼澡藻 匀蚤遭蚤泽糟怎泽 早藻灶怎泽 糟燥皂责造藻曾 咱 允暂 援 杂糟蚤藻灶贼蚤葬 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬藻袁
圆园员园袁 员圆猿渊猿冤院 猿苑圆 原 猿苑愿
咱猿园暂 程小毛袁 岳摇 琳袁 黄晓霞援 基于 粤云蕴孕 标记技术的三翅槭与三
角枫亲缘关系分析咱 允暂 援 中国农学通报袁 圆园员员袁 圆苑 渊员远冤院 苑怨
原 愿猿
咱猿员暂 黄仁志袁 颜新培袁 李摇 健袁 等援 湖南省 员园 个现行栽培桑树品种
的 粤云蕴孕指纹图谱分析咱允暂援 蚕业科学袁圆园园怨袁猿缘渊源冤院愿猿苑 原愿源员
咱猿圆暂 允怎造蚤燥 耘袁 灾藻则则蚤藻则 允袁 阅燥则造澡葬糟 凿藻 月燥则灶藻 云援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 杂悦粤砸
皂葬则噪藻则泽 造蚤灶噪藻凿 贼燥 贼澡则藻藻 凿蚤泽藻葬泽藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻泽 遭葬泽藻凿 燥灶 粤云蕴孕 憎蚤贼澡蚤灶
晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂 蕴咱 允暂 援 栽粤郧 栽澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 葬灶凿 粤责责造蚤藻凿 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁
圆园园远袁员员圆渊圆冤院 猿猿缘 原 猿源远
咱猿猿暂 晕藻早蚤 酝袁 阅藻增蚤糟 酝袁 阅藻造泽藻灶赠 酝袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 粤云蕴孕 枣则葬早鄄
皂藻灶贼泽 造蚤灶噪藻凿 贼燥 泽藻藻凿 糟燥葬贼 糟燥造燥怎则 蚤灶 月则葬泽泽蚤糟葬 躁怎灶糟藻葬 葬灶凿 糟燥灶增藻则泽蚤燥灶
贼燥 葬 杂悦粤砸 皂葬则噪藻则 枣燥则 则葬责蚤凿 泽藻造藻糟贼蚤燥灶咱允暂 援 栽粤郧 栽澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 葬灶凿 粤责鄄
责造蚤藻凿 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁 圆园园园袁 员园员渊员冤院 员源远 原 员缘圆
咱猿源暂 杂澡藻灶 粤袁 蕴蚤 匀袁 宰葬灶早 运袁 藻贼 葬造援 杂藻择怎藻灶糟藻 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎藻凿 葬皂责造蚤枣蚤藻凿
则藻早蚤燥灶 渊杂悦粤砸冤 皂葬则噪藻则泽鄄遭葬泽藻凿 则葬责蚤凿 皂燥造藻糟怎造葬则 贼赠责蚤灶早 葬灶凿 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤鄄
糟葬贼蚤燥灶 燥枣 悦怎灶灶蚤灶早澡葬皂蚤葬 造葬灶糟藻燥造葬贼葬咱允暂 援 粤枣则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥贼藻糟澡鄄
灶燥造燥早赠袁 圆园员员袁员园渊愿圆冤院 员怨园远远 原 员怨园苑源
咱猿缘暂 杂葬则憎葬贼 酝袁 晕葬遭蚤 郧袁 阅葬泽 杂袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 皂葬则噪藻则泽 蚤灶 皂藻凿蚤糟蚤灶葬造
责造葬灶贼 遭蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠院 责葬泽贼 葬灶凿 责则藻泽藻灶贼咱允暂 援 悦则蚤贼蚤糟葬造 砸藻增蚤藻憎泽 蚤灶 月蚤燥鄄
贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员圆袁 猿圆渊员冤院 苑源 原 怨圆
咱猿远暂 酝蚤葬燥 蕴袁 杂澡燥怎 杂袁 悦葬蚤 允袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼憎燥 粤云蕴孕 皂葬则噪藻则泽
造蚤灶噪藻凿 贼燥 遭葬糟贼藻则蚤葬造 憎蚤造贼 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 贼燥皂葬贼燥 葬灶凿 糟燥灶增藻则泽蚤燥灶 贼燥 杂悦粤砸
皂葬则噪藻则泽咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 遭蚤燥造燥早赠 则藻责燥则贼泽袁 圆园园怨袁 猿远渊猿冤院 源苑怨 原 源愿远
远愿圆