全 文 ：　　收稿日期 : 2002208215
基金项目 : 2002 —2004 年浙江省自然科学基金项目“桤木属植物系统生物学及群体结构遗传研究”(编号 301265)
作者简介 : 卓仁英 (1969 —) ,男 ,福建莆田人 ,博士.
　　文章编号 : 100121498 (2003) 0120117206
桤木群体遗传分化研究
I. DNA 提取和 PCR条件的建立
卓仁英 , 孟现东 , 陈益泰
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳　311400)
关键词 : 桤木 ; RAPD 分子标记 ; PCR 扩增条件
中图分类号 : S792114 　　　　　文献标识码 :A
桤木 ( Alnus cremastogyne Burk)为桦木科 (Betulaceae)植物 ,主要分布于四川盆地及其周边地
区。桤木喜光、喜湿 ,根系发达 ,对土壤要求不严 ,适应性强 ,在长江中下游地区防护林建设中
具有重要作用。
国外对桤木属 ( Alnus)植物的研究起步较早 ,主要集中于生理生化方面包括生长、固 N、抗
涝性以及种间杂交研究等[1 　3 ] 。虽有学者利用 RFLP 研究其核糖体 DNA 的基因结构、以同工
酶技术研究桤木属的群体遗传变异[4 　6 ] ,但未见应用 RAPD 技术的研究报道。随着现代生物
技术的发展 ,生物多样性的检测技术日趋成熟和多样化 ,近 20 年来发展的 RFLP、RAPD、SSR 等
分子标记技术 ,可从不同角度和层次来揭示物种的变异性。本项研究旨在建立桤木属植物
DNA 提取方法和 RAPD 反应程序 ,以进行桤木属种间和种内遗传变异的研究。
1 　材料与方法
111 　实验材料
以 1996 和 1998 两年从桤木原分布区四川盆地及其周边地区采集的种子 ,在中国林业科
学研究院亚热带林业研究所苗圃培育成的 2 年生幼苗为实验材料 ,7 月份采当年生嫩叶用于
实验分析。
112 　实验方法
11211 　DNA 提取 　根据 PCR 扩增的实验要求[7 　9 ]和现有实验条件 ,设计了 3 种样品 DNA 提
取处理方法 :
(1)取 4 g 新鲜样品加入液氮进行研磨 ,然后用 w = 5 %CTAB 提取缓冲液 (含 w = 5 %
CTAB、100 mmol·L - 1 Tris2HCl ,pH值 810、20 mmol·L - 1 EDTA、114mol·L - 1 NaCl、w = 2 %PVP、w =
2 %β- 巯基乙醇)进行提取。DNA 提取方法为 :处理后的材料在预冷的研钵中研磨成粉末状 ,
加入 20 mL 提取缓冲液 ,混匀 ,于 65 ℃恒温温育 40 min , (中间不断震荡、混匀) ,然后加入等体
积的 Cl (氯仿∶异戊醇体积比为 24∶1) ,在摇床上混匀 10 min ,于 4 500 r·min - 1离心 15 min ,取上
林业科学研究　2003 ,16 (1) :117 　122
Forest Research
清液移入另一离心管 ,加入 20 mL 异丙醇沉淀 DNA ,用干净玻璃钩捞出 DNA ,φ= 70 %乙醇洗
涤 3 　5 次 ,晾干后溶解于 1 mL TE ,4 ℃保存。
(2)取 4 g 新鲜样品在 - 18 ℃低温条件下处理 7 h 以上 ,然后用 w = 5 %CTAB 提取缓冲液
进行 DNA 提取。方法同 (1) ,所得 DNA 用 1 mL TE溶解。
(3)取 4 g 新鲜样品用 108 ℃灭活 15 min ,80 ℃烘干 12 h 以上 ,然后用 w = 5 % CTAB 提取
缓冲液进行 DNA 提取。方法同 (1) ,所得 DNA 用 1 mL TE溶解。
分别取 50μL 基因组 DNA 溶液用 TE稀释至 1 000μL ,用贝克曼 DU2640 紫外分光光度计
测定其在 260、280 nm 波长下的光吸收值 ,计算 A260/ A280 的比值并估算 DNA 浓度。
11212 　不同处理所得基因组 DNA 的纯度和分子量 　分别取 5μL 基因组 DNA 溶液用ρ=
112 %琼脂糖进行电泳分析 ,恒压 110 V。至指示剂移动到凝胶前沿停止电泳。EB 染色 30
min ,紫外灯下观察、拍照。
11213 　PCR 扩增条件的建立　根据 PCR 实验要求 ,分别采用不同的 Mg2 + 浓度、d2NTP 浓度和
模板 DNA 浓度进行 PCR 扩增。实验条件如表 1。
表 1 　PCR反应条件
条 件 Mg2 + d2NTP 模板 DNA
PCR 缓冲液/μL 215
d2NTP/ (mmol·L - 1) 215 115 , 210 , 215 , 310
引物 (s60 + s155) / (mmol·L - 1) 每个引物 2μL
Mg2 + ( mmol L - 1) 115 , 210 , 215 , 310
Tap 酶 1 u(上海华美公司)
模板 DNA/ ng 40 20 , 40 , 80 , 100
ddH2O/μL 加 ddH2O 补足 20μL
　　注 :引物序列为 S60 :ACCCGGTCAC; S155 :ACGCACAACC ,均为加拿大 Songon 公司上海分公司生产。
取 10μL PCR 扩增产物在ρ= 018 %琼脂糖凝胶上电泳分析 ,恒压 100 V ,至指示剂电泳到
凝胶前沿停止。EB 染色 30 min ,紫外灯下观察、拍照。
11214 　对不同处理方法所得的 DNA 进行 PCR 扩增 　分别对 3 种处理所得的 DNA 进行 PCR
扩增。
反应条件为 :反应总体积为 20μL ,其中 PCR 反应缓冲液 (100 mmol·L - 1 Tris2HCl , (pH
910) ,500 mmol·L - 1 KCl ,25 mmol·L - 1 MgCl2 ,0101 %明胶 ,510 g L - 1 BSA) 215μL ,d2NTP 215 mmol
·L - 1 ,引物 ( s60 + s155) 各 2 mmol·L - 1 ,Mg2 + 310 mmol·L - 1 ,Taq 酶 1 u ,模板 DNA 各 40 ng ,用
ddH2O 补足 20μL。
反应程序为 :在 PE9600 型 PCR 基因扩增仪中 ,先进行 94 ℃预变性 3 min ,然后 94 ℃变性
18 s ,36 ℃退火 80 s ,72 ℃延伸 120 s ,40 个循环 ,最后 72 ℃反应 10 min。取 10μLPCR 扩增产物
在ρ= 018 %琼脂糖凝胶上电泳分析 ,恒压 100 V ,至指示剂电泳到凝胶前沿停止。EB 染色 30
min ,紫外灯下观察、拍照。
11215 　优化条件的 PCR　以上述建立的优化条件组合即 :PCR 反应缓冲液 215μL ,d2NTP 215μL ,引
物(s60 + s155)各 2 mmol·L - 1 ,Mg2 + 310 mmol·L - 1 ,Tap 酶 1 u ,模板DNA 各 40 ng ,用 ddH2O 补足 20μL。
对 12 个不同桤木种源的DNA 进行 PCR扩增 ,电泳分析扩增结果 ,记录实验结果并拍照。
811　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
2 　结果与分析
211 　不同处理所得的基因组 DNA 纯度和分子量
通过紫外分光光度计和电泳分析 ,可以看出不同处理方法对所提取的 DNA 有较大影响。DNA
的纯度差异较大 (表 2) ,通过液氮 + CTAB 过程提取的 DNA 纯度略大于冰冻 + CTAB 提取的
DNA ,远大于烘干处理 + CTAB 提取的 DNA 样品 ,但三者的 DNA 样品都可以满足 PCR 的要求 ,
电泳结果如图 1 ,不同处理所得的 DNA 样品分子量完全一致 ,约为 30 kb 左右。本文中 Marker
均为Lambda DNA/ EcoRI + HindIII。
表 2 　不同处理条件下紫外分光光度计测定结果
项目
处理 I(液氮 + CTAB)
样品 I 样品 II
处理 II(冰冻 + CTAB)
样品 I 样品 II
处理 III(烘干 + CTAB)
样品 I 样品 II
A260 01720 7 01784 1 01710 4 01708 9 01605 3 01643 2
A280 01402 4 01440 1 01410 6 01405 6 01441 0 01520 1
A260/ A280 1179 1178 1173 1174 1137 1123
DNA 浓度/ (ng·L - 1) 72017 78411 71014 70819 60513 64312
212 　不同浓度的 Mg2 + 、d2NTP、模板 DNA 对 PCR 扩增的影响
图 1 　不同处理所得的 DNA 电泳结果
(处理方法 :1、2 冰冻 + CTAB ,3、4 液氮
+ CTAB ,5、8Marker ,6、7 烘干 + CTAB)
21211 　不同 Mg2 + 浓度对 PCR 扩增结果的影响 　以 115、210、
215、310 mmol·L - 1 4 个浓度的 Mg2 + 进行 PCR 扩增 ,电泳分析
实验结果如图 2 ,可以看出 ,115 mmol·L - 1的 Mg2 + 浓度偏低 ,影
响了 PCR 扩增 ,扩增片段数量少 ,甚至无扩增产物 ;而 210 　
310 mmol·L - 1的 Mg2 + 浓度基本能够满足 PCR 扩增的要求 ,对
PCR 扩增有较好的促进作用 ,这主要是由于 Mg2 + 与 d2NTP 结
合 ,从而影响到 Taq 酶反应的底物浓度。
21212 　不同浓度的 d2NTP 对 PCR 扩增的影响 　以不同浓度
(115、210、215、310 mmol·L - 1 4 个浓度)的 d2NTP 进行 PCR 扩增 ,
电泳分析实验结果如图 3 ,可以看出 ,115 　210 mmol·L - 1的 d2
NTP浓度偏低 ,导致反应不完全 ,影响了 PCR 扩增 ,扩增片段数
量少 , 出现弱带 ; 而 215 　310 mmol·L - 1的 d2NTP 浓度基本能够
图 2 　不同 Mg2 +浓度对 PCR 扩增结果的影响
(Mg2 +浓度 1 : 310 mmol·L - 1 ,2、3 : 215 mmol·L - 1 ,4、
5 : 210 mmol·L - 1 ,6、7 : 115 mmol·L - 1 ,8 : Marker) 图 3 　不同浓度的 d2NTP 对 PCR 扩增的影响(d2NTP 浓度 : 1、2 :310 mmol·L - 1 ,3、4 : 215 mmol·L - 1 ,5、6 :210 mmol·L - 1 ,7、8 : 115 mmol·L - 1 ,9 Marker)
911第 1 期 卓仁英等 :桤木群体遗传分化研究 I. DNA 提取和 PCR 条件的建立
图 4 　不同浓度的模板 DNA 对 PCR 扩增的影响
(DNA 模板浓度 :1、2 :100 ng ,3、4 :80 ng ,
5、6 :40 ng ,7 :20 ng ,8 :Marker)
满足 PCR 扩增的要求 ,对 PCR 扩增反应较
为完全 ,获得较多的强带。
21213 　不同浓度的模板 DNA 对 PCR
扩增的影响 　分别以 20、40、80、100 ng 的模
板 DNA 进行 PCR 扩增 ,电泳分析扩增结果
如图 4 ,从图中可以看出 ,40 ng 的模板 DNA
已经能够满足 PCR 扩增的要求 ,可以获得
较为清晰的谱带 ;以 20 ng 的模板DNA 进行
扩增 ,所得扩增产物多为弱带 ,表现为模板
DNA 浓度过低 ;而以 100 ng 的模板 DNA 进
行扩增 ,产物中有假阳性谱带出现 ,表现为
图 5 　不同处理所得的模板 DNA 对 PCR 扩增的影响
(DNA 模板类型 :1、2 液氮处理 ,3、4
冰冻处理 ,5、6 烘干处理 ,7 Marker)
模板 DNA 浓度过高。
213 　不同处理所得的模板 DNA 对 PCR 扩
增的影响
　　分别取 40 ng 3 种不同处理所得的模板
DNA 作为模板进行 PCR 扩增 ,电泳结果如
图 5。3 种处理方法所得的 DNA 均可以满
足 PCR 扩增的要求 ,但烘干处理后用 CTAB
提取的 DNA 不利于 PCR 扩增 ,仅有弱扩增
带出现 ,而用液氮 + CTAB 和冰冻 + CTAB
提取的模板 DNA 扩增结果基本相似 ,完全
可以满足 PCR 扩增要求。
214 　优化条件组合的 PCR 扩增结果
以优化条件组合对 12 个不同桤木种源
所提取的模板 DNA 进行 PCR 扩增 ,电泳结
图 6 　优化条件组合的 PCR 扩增结果
(模板 11 石草 (1) ,2. 石草 (2) ,3. 宣恩 (1) ,4. 宣恩 (2) ,
5. 盐亭 (1) ,6. 盐亭 (2) ,7. 邛崃 ,8. 雅安 (1) ,9. 雅安 (2) ,
10. 金堂 (1) ,11. 金堂 (2) )
果如图 6。多数 DNA 有扩增产物 ,且多态
性较强 ,表明所建立的 PCR 扩增优化条件
基本适合于不同桤木种源的 RAPD 反应
需要。
3 　小结与讨论
由于桤木叶片中含有大量的酚类和多
糖类物质 ,对 PCR 扩增结果影响较大 ,为了
减少这些物质的影响 ,在提取缓冲液中加
入了 w = 2 %PVP、w = 2 %2β2巯基乙醇 ,消
除酚类物质对 DNA 的影响 ,从而获得了较
好的结果[10 ,11 ] ,使 3 种处理所得的 DNA 都
可以满足 PCR 扩增的需要。在一些实验室
021　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
由于条件限制 ,采用冰冻处理后再进行 DNA 提取 ,可节省经费 ,简化实验条件 ,在研磨时样品
应保持冰冻。
PCR 扩增对各种条件比较灵敏。许多研究表明 ,只要严格控制 PCR 的扩增条件 ,可以得
到较好的可重复的试验结果[12 ] ,反应混合物中离子浓度尤其是 Mg2 + 对 PCR 扩增的特异性和
扩增效率有较大的影响 ,浓度过高会形成非特异性扩增产物。此外 Mg2 + 可与 d2NTP 结合 ,促
进 PCR 反应[13 ] ;d2NTP 是 PCR 反应的重要底物之一[12 ] ,其浓度可以略为过剩 ,保证 PCR 扩增
反应的完全。模板中含有 TE溶液 ,会抑制 PCR 扩增 ,且过量模板会形成假阳性扩增产物 ,20
　80 ng 的模板 DNA 已经足以进行 PCR 扩增了。
本实验设计了 3 种 PCR 扩增程序 ,PCR 扩增均在 PE9600 型 PCR 扩增仪上进行 ,程序 1 为 :
先 94 ℃预变性 3 min ,然后 94 ℃变性 18 s ,36 ℃退火 80 s ,72 ℃延伸 120 s ,40 个循环 ,最后
72 ℃反应 10 min。程序 2 为 :先 94 ℃预变性 3 min ,然后 95 ℃变性 18 s ,55 ℃退火 80 s ,72 ℃
延伸 120 s ,40 个循环 ,最后 72 ℃反应 10 min[14 ] 。程序 3 为 :94 ℃预变性 3 min ,然后 94 ℃变性
30 s ,35 ℃退火 60 s ,72 ℃延伸 80s ,40 个循环 ,最后 72 ℃反应 10 min。但程序 2、3 均未能获得
扩增产物。
本实验中采用双引物进行 PCR 扩增 ,提高扩增产物的多态性和引物的利用效率 ,以本实
验建立的 PCR 扩增程序进行引物筛选和扩增 ,可以得到较好的实验结果。
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121第 1 期 卓仁英等 :桤木群体遗传分化研究 I. DNA 提取和 PCR 条件的建立
Research on the Populations Variation of Alnus cremastogyne
I. DNA Extracting and Protocol Optimum for PCR
ZHUO Ren2ying , MENG Xian2dong , CHEN Yi2tai
(Research Institute of Subtropical Forestry , CAF , Fuyang 　311400 , Zhejiang , China)
Abstract : Taking China’s endemic tree species Alnus cremastogyne and other 5 Alnus species as test
materials , the DNA extraction of genome and the amplification of PCR were studied. Two methods were
tested , i . e. freezing treatment + 5 % CTAB and liquid nityrogen + 5 % CTAB. It is proved that the opti2
mum PCR program is as follows : pre2denaturating under 94 ℃for 3 min. , denaturating under 94 ℃for
18 seconds , annealing under 36 ℃for 80 seconds and extending under 72 ℃for 120 seconds. After 40
cycles , the sample is reacted for 10 minutes under 72 ℃. PCR system includes buffer 2. 5μL , d2NTP
2. 5μL , primer (s60 + s155) 2 mmol·L - 1 , Mg2 + 3. 0 mmol·L - 1 , Tap enzyme 1 U , DNA 40 mg , then
adding ddH2O to 20μL. This study may provide some references for the application of RAPD technique
in genetic research of alder tree species.
Key words : Alnus cremastogyne ; RAPD molecular marker ; PCR
221　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷