全 文 :林业科学研究 2012,25(1):88 92
ForestResearch
文章编号:10011498(2012)01008805
华仁杏杂种鉴定及遗传变异分析
刘梦培1,傅大立1,2,李芳东1,傅建敏1,田 敏3,梁 臣4
(1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心,河南 郑州 450003;2.北京林业大学,北京 100083;
3.中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 311400;4.河南省洛阳林业科学研究所,河南 洛阳 471002)
收稿日期:20110407
基金项目:国家十一五科技支撑项目资助(2006BAD01A17032)
作者简介:刘梦培(1984—),女,河北邢台人,硕士研究生,主要从事经济林分子与常规育种研究.
通讯作者:傅大立(1965—),男,北京林业大学博士后,中国林业科学研究院经济林研究开发中心研究员,从事林木种质资源分类与
遗传育种研究.Email:fu_dali@163.com
摘要:以华仁杏6个杂交组合为实验材料,利用SSR分子标记技术研究亲本与杂种扩增谱带的多态性,以甄别真假
杂种。筛选出在亲本和杂种之间存在双亲互补带型的引物6对,除2个杂种无法鉴别外,其余品种均可鉴别为真杂
种。另外亲缘关系和遗传变异分析结果表明,各个组合杂交后代表现出来的一致性较高,遗传多样性水平相差不
大,但当父本选择X1时,母本选择H1或H3杂交后代差异比较显著。
关键词:华仁杏;SSR;杂种鉴定;聚类分析;遗传变异
中图分类号:S718.46 文献标识码:A
IdentificationandGeneticVariationAnalysisofArmeniacacathayanaHybrids
LIUMengpei1,FUDali1,2,LIFangdong1,FUJianmin1,TIANMin3,LIANGChen4
(1.NontimberForestryResearchandDevelopmentCenter,ChineseAcademyofForestry,Zhengzhou 450003,Henan,China;
2.BeijingForestryUniversity,Beijing 100083,China;
3.ResearchInstituteofSubtropicalForestry,ChineseAcademyofForestry,Fuyang 311400,Zhejiang,China;
4.ResearchInstituteofForestryinLuoyang,Luoyang 471002,Henan,China)
Abstract:WithsixhybridizedcombinationsofArmeniacacathayanaasexperimentalmaterials,theSSRmolecular
markertechnologywasusedtoidentifyhybridsthroughamplificationpolymorphismbandsand6primerswithparent
complementarybelttypewerescreened.Mostofthehybridswereidentifiedastruehybridsexcepttwo.Inaddition,
thegeneticrelationshipandgeneticvariationanalysisresultsshowedthatalthehybridcombinationdisplayedhigh
consistencyandnotsignificantgeneticdiversitywasfound.WhenchoosingX1asmaleparentandH1orH3asfe
maleparent,thediferencesofhybridsweresignificant.Theresultsofhybrididentificationandgeneticvariationa
nalysiscanbeusedinfutureshybridparentsbreeding,geneticlinkagemapconstructionandQTLmappingofim
portantcharacterofA.cathayana.
Keywords:Armeniacacathayana;SSR;hybrididentification;clusteringanalysis;geneticvariation
杂交育种是植物遗传改良的关键技术,有利于
综合双亲的优良性状,培育高产稳产的优良品种。
华仁杏(ArmeniacacathayanaD.L.Fuetal.)[1]作
为一新种,杂交育种方面工作还没有开始。杏属虽
为自交不亲和品种,但也存在一定程度的自交,所以
有必要对华仁杏杂交后代进行真实性鉴定。传统的
杂种鉴定方法多基于形态学鉴定,但这种鉴定方法
难度大,周期长。随着分子生物学的发展,分子标记
技术已成功应用在植物杂交后代的研究中,SSR标
记具有共显性、多态性好、稳定性高等优点[2],在水
稻(OryzasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、棉花(Gos
sypiumspp.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)、竹子
第1期 刘梦培等:华仁杏杂种鉴定及遗传变异分析
等[3-7]物种的杂种鉴定中广泛应用。本研究以华仁
杏6个杂交组合的亲本及杂交后代为实验材料,应
用SSR分子标记技术进行杂种鉴定及遗传变异分
析,以期为华仁杏杂交育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
5个杂交亲本为X1、X2、H1、H2、H3。其中杂交
后代A(X1×H1)成活6株,B(H2×H1)成活6株,
C(X2×H1)成活6株,D(X1×H3)成活1株,E(X2
×H3)成活2株,F(H1×H3)成活3株。植物材料
采自国家林业局泡桐研究开发中心种质资源圃。
华仁杏所用 PCR所需10×PCRBuferWithout
MgCl2、MgCl2、dNTPMiX、TaqDNAPolymerase、Mark
er均购于TaKaRa公司,SSR引物参照国内外发表的
蔷薇科稳定多态的40对引物序列,由上海生工公司
合成,实验于2009—2010年在中国林科院亚热带林
业研究所植物细胞工程实验室内完成。
1.2 华仁杏基因组提取及SSRPCR反应体系优化
采用改良 CTAB法[8]提取植物基因组 DNA,提
取的DNA通过1.0%琼脂糖电泳检测,并存放于 -
20℃冰箱备用,最终用TE稀释至50ng·uL-1作为
模板DNA。
SSRPCR优化反应体系总体积20μL,其中10×
PCRBufer20μL、25mmol·L-1MgCl212μL、10mmol
·L-1dNTPsMiX04μL、5U·μL-1TaqDNA聚合酶
03μL、10μmol·L-1的上下游引物各05μL、DNA模
板05μL、ddH2O146μL。SSR扩增程序94℃预变性
5min,94℃变性45s,最适宜退火温度退火45s,72℃
延伸90s,35个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
1.3 SSRPCR产物检测
SSR产物检测采用一种新的微卫星 PAGEDNA
的显带方法[9]。SSRPCR产物在8%(29∶1)聚丙烯
酰胺凝胶上分离,胶片大小为195mm×120mm×1
mm,8μLPCR产物与2μL含有 gelred的溴酚蓝上
样缓冲液 PCR管中混合均匀,取3μL上样,120V
电压下电泳3h。电泳结束后,自来水冲洗玻璃板双
面,预冷,剥下凝胶,清水冲洗后,直接放入全自动紫
外与可见分析装置拍照和分析。
1.4 数据统计与分析
杂种鉴定分析方法:筛选清晰、稳定、子代表现
出双亲互补带型的引物,用于杂种鉴定。
遗传变异分析:用 NTSYSpc2.10[10]软件进行类
平均法(UPGMA法)聚类分析;用 PopGeneVersion
1.31[11]软件进行遗传距离分析和等位基因数、期望
杂合度和Shannon多样性等相关指标分析。
2 结果与分析
2.1 华仁杏杂交种真实性鉴定
从40对 SSR引物中筛选出6对清晰、稳定、后
代表现出双亲互补带型的引物,引物 Pchgms4和引
物BPPCT034检测图谱见图1。从表1中我们得出,
Pchgms4和 Bppct034产生的等位基因数为 5,剩余
引物产生的等位基因数为4。6对引物鉴定的真杂
种数在3 9个范围内,以引物Bppct034最多,鉴定
比率为37.5%,Pchgms3和Pchgms4鉴定比率最少,
鉴定比率为 125%。其中部分杂交种可通过两条
引物中任意一条鉴定,如 A(X1×H1-1)可通过引
物Bppct009或引物 Bppct034鉴定,D(X1×H3)可
通过引物Aprigms18或引物96005加以鉴定。
(1 5为杂交亲本;6 29为杂交子代)
图1 引物Pchgms4(上)和引物BPPCT034(下)对华仁杏亲本及杂交种的SSR检测图谱
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林 业 科 学 研 究 第25卷
杂交后代只具有双亲特征带的杂交后代为真杂
种,其他类型需做进一步分析。杂种鉴定结果主要
表现为4种类型:双亲互补性、父本型、母本型和其
他型,其中22个杂交种为双亲互补型,为真杂种,剩
余B(H2×H14)1个杂交后代和C(X2×H16)1个
杂交后代需做进一步鉴定。
表1 6对引物的杂种鉴定结果
引物编号 引物序列 等位基因数 鉴定真杂种数 鉴定比率/%
Pchgms3 F—ACGGTATGTCCGTACACTCTCCATG R—CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC 4 3 12.5
Pchgms4 F—ATCTTCACAACCCTAATGTC R—GTTGAGGCAAAAGACTTCAAT 5 3 12.5
BPPCT009 F—ATTCGGGTCGAACTCCCT R—ACGAGCACTAGAGTAACCCTCTC 4 7 29.2
BPPCT034 F—CTACCTGAAATAAGCAGAGCCAT R—CAATGGAGAATGGGGTGC 5 9 37.5
Aprigms18 F—TCTGAGTTCAGTGGGTAGCA R—ACAGAATGTGCGTTGCTTTA 4 7 29.2
96005 F—GTAACGCTCGCTACCACAAA R—CCTGCATATCACCACCCAG 4 6 25.0
2.2 杂交种与其亲本亲缘关系分析
杂交种与其亲本间的亲缘关系见图2。A(X1×
H1)杂交6株后代中,6株均与其父本 X1的相似系
数高于与其母本 H1的相似系数,亲缘关系与其父
本较近,与其母本较远(图2:A);B(H2×H1)6株杂
交后代中,亲本间的亲缘关系高于杂交后代与亲本
间的亲缘关系(图2:B);C(X2×H1)杂交后代杂交
种(X2×H1-6)与母本的亲缘关系较近(图2:C);
D(X1×H3)的1株杂交种与父本X1的亲缘关系更
近(图2:D);E(X2×H3)2株杂交后代中,杂交种
(X2×H3-1)与母本的亲缘关系较近,(X2×H3-
2)无法断定(图2:E);F(H1×H3)3株杂交后代均
与父本 H1的亲缘关系近于与其母本的亲缘关系
(图2:F)。总的来说,各个杂交组合杂交后代表现
出来的一致性较高,尤其是杂交组合A(X1×H1)、B
(H2×H1)、D(X1×H3)和F(H1×H3)。
图2 杂交后代与亲本间亲缘关系的比较
09
第1期 刘梦培等:华仁杏杂种鉴定及遗传变异分析
2.3 华仁杏杂交后代遗传距离和遗传相似系数
分析
从遗传变异相关系数上分析杂交后代(表2),
除♂X1×♀H3杂交后代外,等位基因数以♂H2×
♀H1杂交后代最高,♂X2×♀H3杂交后代最低;
有效等位基因数♂H1×♀H3杂交后代最高,♂X1
×♀H1杂交后代最低;期望杂合度和 Shannon遗传
多样性指数均以♂X2×♀H1杂交后代 >♂H2×♀
H1杂交后代 >♂H1×♀H3杂交后代 >♂X2×♀
H3杂交后代>♂X1×♀H1杂交后代。总体来说,6
个组合杂交后代的遗传多样性水平相差不大。
表2 华仁杏杂交后代遗传变异分析
项目
等位基因数
Na
有效等位
基因数Ne
期望杂合度
H
Shannon多样性
指数I
♂X1×♀H1 1.5769 1.3038 0.1850 0.2833
♂H2×♀H1 1.7692 1.4178 0.2478 0.3773
♂X2×♀H1 1.7308 1.4400 0.2596 0.3890
♂X1×♀H3 1 1 1 1
♂X2×♀H3 1.5000 1.3536 0.2071 0.3024
♂H1×♀H3 1.5769 1.4489 0.2453 0.3536
(平均) 1.9615 1.6216 0.3651 0.5415
从遗传距离和遗传相似系数上分析杂交后代
(表3)。♂X2×♀H3与♂X2×♀H1杂交后代和
♂H2×♀H1杂交后代与♂X1×♀H1杂交后代遗
传相似系数最高,分别为08242和08218,两对组
合亲缘关系较近,说明当父本选择 X2时,母本选择
H3或H1表现出来的杂交后代差异很小,当母本选
择H1时,父本选择 H2或 X1同样杂交后代差异也
很小。而♂X1×♀H1杂交后代与♂X1×♀H3杂
交后代遗传距离最高,为04295,两者亲缘关系最
远。说明当父本选择 X1时,母本选择 H1或 H3杂
交后代差异显著。
表3 华仁杏杂交后代遗传距离和遗传相似度分析
项目 ♂X1×♀H1 ♂H2×♀H1 ♂X2×♀H1 ♂X1×♀H3 ♂X2×♀H3 ♂H1×♀H3
♂X1×♀H1 0.8218 0.7899 0.6508 0.7840 0.7127
♂H2×♀H1 0.1963 0.7850 0.6602 0.7682 0.7885
♂X2×♀H1 0.2358 0.2420 0.7362 0.8242 0.6694
♂X1×♀H3 0.4295 0.4152 0.3063 0.7827 0.7377
♂X2×♀H3 0.2433 0.2637 0.1934 0.2450 0.7333
♂H1×♀H3 0.3387 0.2376 0.4013 0.3024 0.3103
3 讨论
杂种鉴定是杂交育种的一个重要环节,快速、准
确鉴定真杂种是杂交育种工作的重要前提和基
础[12]。植物杂种鉴定的方法主要有形态学鉴定、细
胞学鉴定、同工酶鉴定[13-16]及分子标记鉴定[17-19]。
如张新玲[14]采用了常规染色体组型分析方法对小
麦属(TriticumLinn.)2个种间杂种及3个亲本进行
了核型分析,鉴定出 2个杂种均为真杂种;罗向
东[15]运用天冬氨酸转氨酶(AAT)、苹果酸脱氢酶
(MDH)以及酯酶(EST)3种同工酶对栽培黄瓜(Cu
cumissativusLinn.)与 野 黄 瓜 (Cucumishystrix
Chakr.)正反杂交种进行了鉴定。但形态学鉴定、细
胞学鉴定和同工酶鉴定易受环境条件和发育阶段的
影响,具有相对局限性。分子标记技术已成为现在
进行杂种鉴定的理想工具,鉴定速度快,环境影响因
素小,鉴定的准确率高,确保了被鉴定杂种的真实
性,提高了育种利用的有效性。目前广泛应用的分
子标记有RAPD、ISSR、AFLP、SSR等,但 RAPD标记
重复性差、ISSR标记多为显性、AFLP标记操作复杂
等,相对来说,SSR标记以其共显性、重复性高的优
点在杂种鉴定的研究中广泛应用。如卢江杰[7]利用
在竹类植物中有较高通用性的SSR标记可以对杂交
竹种的真实性进行早期鉴定。田蕾等[17]为建立鉴
定大豆(Soybeansp.)杂种的方法,采用亲本间有多
态性的3对 SSR引物,对148个耐盐与盐敏感大豆
19
林 业 科 学 研 究 第25卷
品种正反交F1植株进行分子鉴定。可见 SSR分子
标记技术在杂种鉴定中得到了广泛的应用。
本研究仅利用6对引物就将24个杂种中的22
个鉴定为真杂种,杂种鉴定比率9125%。说明利
用SSR分子标记进行杂种鉴定是切实可行的,也是
快速高效的鉴定方法。同时也说明华仁杏存在一定
程度的自交,所以有必要对华仁杏杂交后代进行真
实性鉴定,提高杂交育种的效率,为新品种的选育奠
定良好的基础。
本研究也从聚类分析、遗传距离和遗传多样性
等相关分析对华仁杏杂交后代进行了遗传变异分
析。研究结果表明,6个组合杂交后代表现出来的
一致性较高,尤其是杂交组合A(X1×H1)、B(H2×
H1)、D(X1×H3)和 F(H1×H3)。另外6个组合
杂交后代遗传距离范围在01963 04295之间,
以♂X1×♀H1杂交后代与♂X1×♀H3杂交后代
遗传距离最高,从而可推出当父本选择 X1时,母本
选择 H1和 H3杂交后代差异显著。这一结论可以
服务于华仁杏杂交亲本的选育。但实验有相对不足
之处,就是杂交后代数量相对较少,结果分析可能有
一定偏差。但作者认为本研究提供了一种理论方
法,利用分子标记技术进行杂种鉴定和遗传变异分
析,为杂交育种提供理论指导是值得推广的。
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