全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿渊专刊冤院园圆缘 园猿圆云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤专刊鄄园园圆缘鄄园愿
日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究
王摇 鑫员袁圆袁 钱婷婷员袁圆袁 曾庆银员鄢
渊员郾 中国科学院植物研究所袁系统与进化植物学国家重点实验室袁北京摇 员园园园怨猿曰 圆郾 中国科学院大学袁北京摇 员园园园源怨冤
收稿日期院 圆园员猿鄄园愿鄄圆园
基金项目院 国家野怨苑猿冶计划项目渊圆园园怨悦月员员怨员园源冤和国家高技术研究发展计划渊圆园员员粤粤员园园圆园猿冤
作者简介院 王摇 鑫渊员怨愿远要冤袁男袁河南周口人袁硕士研究生袁主要从事蛋白质结构与生化性质研究援
鄢通讯作者院 研究员袁主要从事功能基因组学研究援 耘鄄皂葬蚤造院 择蚤灶早赠蚤灶援 扎藻灶早岳 蚤遭糟葬泽援 葬糟援 糟灶援
摘要院本研究从日本落叶松中克隆到一个谷胱苷肽还原酶渊郧砸冤基因袁命名为 蕴葬郧砸遥 该基因编码 缘远猿 个氨基酸组成
的蛋白质袁预测分子量为 远员援 园远 噪阅葬遥 表达模式分析发现 蕴葬郧砸基因在芽尧成熟针叶尧茎韧皮部和根韧皮部均表达袁是
组成型表达基因遥 蛋白质亚细胞定位研究发现 蕴葬郧砸蛋白定位在叶绿体遥 在大肠杆菌中表达并纯化了 蕴葬郧砸 重组
蛋白遥 酶学性质分析发现袁蕴葬郧砸蛋白对底物 郧杂杂郧和 晕粤阅孕匀具有较高的催化活性和亲和力袁是热稳定蛋白袁而且
最适 责匀值范围在 苑援 园 怨援 园 之间遥 悦凿圆 垣 尧孕遭圆 垣和 悦怎圆 垣等重金属离子对 蕴葬郧砸 蛋白的催化活性具有明显的抑制作
用遥 将 蕴葬郧砸蛋白的第 缘圆愿 位 匀蚤泽突变为 郧造灶后袁其突变蛋白的催化活性显著降低袁而且与野生型 蕴葬郧砸蛋白相比袁
突变蛋白的动力学常数尧最适 责匀值范围和热稳定性均发生了显著变化袁预示着第 缘圆愿 位的匀蚤泽在 蕴葬郧砸的催化特性
和蛋白结构稳定性方面发挥着重要作用遥
关键词院日本落叶松曰谷胱苷肽还原酶曰表达模式曰亚细胞定位曰酶学性质
中图分类号院杂苑怨员援 圆圆猿 文献标识码院粤
月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 砸藻凿怎糟贼葬泽藻
宰粤晕郧 载蚤灶员袁圆袁 匝陨粤晕 栽蚤灶早鄄贼蚤灶早员袁圆袁 在耘晕郧 匝蚤灶早鄄赠蚤灶员
渊员郾 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 杂赠泽贼藻皂葬贼蚤糟 葬灶凿 耘增燥造怎贼蚤燥灶葬则赠 月燥贼葬灶赠袁 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 月燥贼葬灶赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨猿袁 悦澡蚤灶葬曰
圆郾 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园源怨袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻泽 渊郧砸泽冤 葬则藻 噪藻赠 藻灶扎赠皂藻泽 蚤灶 责造葬灶贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻鄄葬泽糟燥则遭葬贼藻 糟赠糟造藻袁 葬灶凿 责造葬赠 蚤皂责燥则贼葬灶贼
则燥造藻泽 蚤灶 责造葬灶贼 燥曾蚤凿葬贼蚤增藻 泽贼则藻泽泽 贼燥造藻则葬灶糟藻援 陨灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 葬 郧砸 早藻灶藻 渊蕴葬郧砸冤 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤援 栽澡蚤泽
早藻灶藻 藻灶糟燥凿藻泽 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 缘远猿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 则藻泽蚤凿怎藻泽袁 憎蚤贼澡 糟葬造糟怎造葬贼藻凿 皂燥造藻糟怎造葬则 皂葬泽泽藻泽 燥枣 远员援 园远 噪阅葬援 砸栽鄄孕悦砸 则藻增藻葬造泽
贼澡葬贼 蕴葬郧砸 蚤泽 葬 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 早藻灶藻袁 憎澡蚤糟澡 蚤泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 葬造造 贼蚤泽泽怎藻泽 凿藻贼藻糟贼藻凿袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 遭怎凿袁 皂葬贼怎则藻 灶藻藻鄄
凿造藻袁 责澡造燥藻皂 燥枣 泽贼藻皂 葬灶凿 则燥燥贼援 栽澡藻 糟澡造燥则燥责造葬泽贼 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 蕴葬郧砸 憎葬泽 糟燥灶枣蚤则皂藻凿 遭赠 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 粤则葬遭蚤鄄
凿燥责泽蚤泽 责则燥贼燥责造葬泽贼援 蕴葬郧砸 憎葬泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤袁 葬灶凿 责怎则蚤枣蚤藻凿 遭赠 晕蚤鄄葬枣枣蚤灶蚤贼赠 糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡赠援 栽澡藻 责怎鄄
则蚤枣蚤藻凿 蕴葬郧砸 责则燥贼藻蚤灶泽 泽澡燥憎藻凿 澡蚤早澡 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 葬灶凿 葬枣枣蚤灶蚤贼蚤藻泽 贼燥憎葬则凿泽 泽怎遭泽贼则葬贼藻泽 郧杂杂郧 葬灶凿 晕粤阅孕匀援 蕴葬郧砸 责则燥鄄
贼藻蚤灶 蚤泽 葬 贼澡藻则皂燥泽贼葬遭造藻 责则燥贼藻蚤灶袁 葬灶凿 澡葬泽 燥责贼蚤皂葬造 责匀 则葬灶早蚤灶早 枣则燥皂 苑援 园 贼燥 怨援 园援 匀藻葬增赠 皂藻贼葬造 蚤燥灶泽 渊悦凿圆 垣 袁 孕遭圆 垣 葬灶凿
悦怎圆 垣 冤 糟燥怎造凿 蚤灶澡蚤遭蚤贼 贼澡藻 蕴葬郧砸爷泽 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽援 宰澡藻灶 贼澡藻 匀蚤泽缘圆愿 燥枣 蕴葬郧砸 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 则藻责造葬糟藻凿 遭赠 郧造灶袁 贼澡藻 皂怎贼葬灶贼 责则燥鄄
贼藻蚤灶泽 泽澡燥憎藻凿 凿藻糟则藻葬泽藻凿 藻灶扎赠皂葬贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 葬灶凿 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 贼燥憎葬则凿泽 泽怎遭泽贼则葬贼藻泽 郧杂杂郧 葬灶凿 晕粤阅孕匀援 酝燥则藻燥增藻则袁
贼澡藻 皂怎贼葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 泽澡燥憎藻凿 造藻泽泽 贼澡藻则皂燥泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 贼澡葬灶 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 责则燥贼藻蚤灶援 栽澡怎泽袁 匀蚤泽缘圆愿 燥枣 蕴葬郧砸 责则燥贼藻蚤灶 皂蚤早澡贼 糟燥灶贼则蚤遭鄄
怎贼藻 贼燥 贼澡藻 藻灶扎赠皂藻爷泽 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬灶凿 泽贼则怎糟贼怎则葬造 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院 蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤曰 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻曰 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶曰 泽怎遭糟藻造造怎造葬则 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶曰 藻灶扎赠皂葬贼蚤糟 糟澡葬则葬糟鄄
贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
当植物受到生物或非生物胁迫时渊如病虫害尧干
旱尧重金属和盐碱等冤袁体内会积累过量活性氧袁导致
生物大分子的损伤并最终造成细胞死亡咱员暂 遥 植物在
长期的进化过程中袁体内形成能有效清除活性氧的
代谢途径遥 其中袁抗坏血酸 原谷胱苷肽循环是植物
体普遍存在的一种活性氧清除的途径遥 谷胱苷肽还
原酶渊郧砸冤是该循环中一个重要的酶袁它利用还原型
辅酶 晕粤阅孕匀 提供的还原力袁将氧化型谷胱苷肽
渊郧杂杂郧冤还原为还原型谷胱苷肽渊郧杂匀冤袁从而使细胞
内环境维持在稳定的氧化还原状态遥 目前已有一些
报道研究 郧砸 基因对生物和非生物的胁迫响应袁例
如袁将水稻 郧砸在酵母体内异源表达后袁酵母对重金
属离子尧双氧水和热胁迫的抗性显著增强咱圆暂 曰将细菌
郧砸在杨树体内过量表达袁转基因杨树抗氧化胁迫的
能力增强咱猿暂 曰将簇毛麦渊匀葬赠灶葬造凿蚤葬 灾蚤造造燥泽葬冤叶绿体
郧砸在易感白粉病的普通小麦体内过量表达袁转基因
植株对白粉病侵染表现出一定的抗性咱源暂 遥 这些研究
表明袁郧砸在植物体内广泛参与各种生物和非生物胁
迫响应遥
日本落叶松渊蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 渊蕴葬皂遭援 冤 悦葬则则援 冤是
中国北方地区重要的针叶造林树种袁是重要的造纸
和建筑用材遥 在其漫长的生长周期中袁经常受到各
种环境因子的胁迫袁比如紫外线尧空气污染物尧低温
和干旱等袁影响其正常生长发育遥 日本落叶松作为
具有重要经济价值和生态价值的树种袁当前对其研
究主要集中在良种选育尧杂交育种等传统的遗传改
良方面袁缺乏对其抗逆分子机制的研究咱缘暂 遥 郧砸 作
为与植物抗逆性状密切相关的蛋白袁对其分子特性
的了解将有助于揭示日本落叶松抵抗逆境胁迫的分
子机理袁有利于利用 郧砸 对其进行分子改良遥 本研
究从日本落叶松中克隆到一个 郧砸 基因袁并对其表
达模式尧亚细胞定位尧蛋白结构和生化特性进行了详
细研究袁为深入揭示 郧砸 在林木中抵抗逆境胁迫的
机理奠定了基础遥
员摇 材料和方法
员援 员摇 植物材料尧菌株和载体
本研究所用材料日本落叶松取自中国科学院北
京植物园袁大肠杆菌 允酝员园怨 和 月蕴圆员渊阅耘猿冤尧亚细胞
定位载体 责孕杂晕 和蛋白表达载体 责耘栽猿园葬 均为本实
验室保存袁责耘粤杂再鄄栽猿 载体购自全式金公司遥
员援 圆摇 酶和试剂
植物 砸晕粤 提取试剂盒袁质粒提取试剂盒袁阅晕粤
纯化回收试剂盒及 阅晕粤 酝葬则噪藻则 购自北京天根生化
科技有限公司遥 蛋白 酝葬则噪藻则 购自 郧藻灶杂贼葬则 公司袁反
转录试剂盒及各种 孕悦砸 试剂购自 栽葬运葬砸葬 公司袁限
制性内切酶购自 晕耘月 公司袁栽源 阅晕粤 连接酶购自
孕则燥皂藻早葬公司遥
员援 猿摇 日本落叶松 蕴葬郧砸基因的克隆
以拟南芥 郧砸蛋白序列渊郧藻灶藻月葬灶噪 粤糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援
粤耘耘苑怨圆远圆冤为模版袁用 栽月蕴粤杂栽晕搜索日本落叶松 糟阅鄄
晕粤 文库 渊该文库由中国林业科学研究院齐力旺研究
员惠赠冤袁得到一个长度 员 缘猿源 遭责 的 耘杂栽 片段渊郧藻灶藻鄄
月葬灶噪 粤糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 允砸员源愿怨怨愿冤袁分析发现该片段编码
的 郧砸蛋白 悦端结构域完整袁但 晕 端结构域不完整袁
根据此 耘杂栽设计下游克隆引物 蕴葬郧砸鄄悦蕴圆遥 采用同样
的方法检索火炬松 耘杂栽 数据库袁得到一个 缘怨远 遭责 的
耘杂栽片段渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 粤宰园员员员员缘冤袁分析
发现该片段编码的 郧砸蛋白 晕端结构域完整袁根据此
耘杂栽设计上游克隆引物 蕴葬郧砸 原 悦蕴员遥
取新鲜的日本落叶松芽约 园援 员 早袁根据试剂盒说
明提取总 砸晕粤袁然后用 栽葬运葬砸葬 反转录试剂盒合成
糟阅晕粤遥 再以 糟阅晕粤为模版袁用克隆引物 蕴葬郧砸鄄悦蕴员 辕
圆 进行 孕悦砸扩增遥 孕悦砸扩增产物经 员豫琼脂糖凝胶
电泳检测袁回收纯化目的条带遥 将回收产物连至
责耘粤杂再鄄栽猿 载体上袁转化大肠杆菌 允酝员园怨 感受态细
胞袁在含有 粤皂责蚤糟蚤造造蚤灶 的 蕴月 平板上挑取多个阳性克
隆进行双向测序遥
员援 源摇 日本落叶松 蕴葬郧砸基因的组织表达分析
为了研究 蕴葬郧砸 基因的组织表达分布袁分别提
取落叶松芽尧成熟针叶尧茎韧皮部和根韧皮部的总
砸晕粤袁分别反转录合成 糟阅晕粤遥 根据已测序的该 郧砸
基因的编码序列袁设计特异引物 蕴葬郧砸鄄耘孕员 辕 圆袁进行
组织表达分布检测遥 孕悦砸 反应程序是院怨源益预变性
缘 皂蚤灶曰然后 怨源益 猿园 泽袁远园益 猿园 泽袁苑圆益 员 皂蚤灶袁猿缘 个循
环曰最后 苑圆益延伸 圆 皂蚤灶袁内标为 粤糟贼蚤灶基因遥
员援 缘摇 日本落叶松 蕴葬郧砸亚细胞定位分析
以 责耘粤杂再鄄栽猿 辕 蕴葬郧砸质粒为模板袁用亚细胞定位
引物 蕴葬郧砸鄄杂蕴员 辕 圆 进行扩增袁将编码完整 蕴葬郧砸 蛋白
的序列克隆至亚细胞定位载体 责孕杂晕 中咱远暂 袁构建 蕴葬鄄
郧砸鄄藻郧云孕 融合蛋白表达载体遥 将重组载体转化
允酝员园怨 感受态细胞袁挑取阳性克隆并测序验证遥 从
阳性克隆中提取质粒袁转化拟南芥叶肉细胞原生质
体进行瞬时表达遥 拟南芥原生质体制备尧转化和培
养参考 杂责葬则噪藻泽 等的方法咱苑暂 遥 作为对照袁将不含有
蕴葬郧砸 基因的空载体进行原生质体转化遥 培养 员 天
远圆
专刊 王摇 鑫等院日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究
后袁在激光扫描共聚焦显微镜 渊 韵造赠皂责怎泽 云灾员园园园
酝孕耘冤下进行观察遥
表 员摇 实验中用到的引物
项目 引物名称 引物序列渊缘忆鄄猿忆冤
基因克隆 蕴葬郧砸鄄悦蕴员 郧悦郧粤栽栽郧栽粤粤粤粤悦悦粤粤粤粤悦悦
蕴葬郧砸鄄悦蕴圆 郧郧粤郧粤粤栽粤郧栽栽郧栽悦粤栽悦粤栽悦栽栽粤郧悦
表达模式分析蕴葬郧砸鄄耘孕员 悦粤栽郧粤粤栽栽栽郧粤粤郧粤郧粤郧栽郧栽粤郧郧悦栽
蕴葬郧砸鄄耘孕圆 悦悦郧悦粤郧粤栽郧郧栽粤栽粤栽栽栽悦栽郧栽粤栽栽悦
亚细胞定位 蕴葬郧砸鄄杂蕴员 栽郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧悦栽粤郧悦栽悦悦粤栽郧郧郧粤郧悦
蕴葬郧砸鄄杂蕴圆 栽粤郧粤栽悦栽栽悦栽悦郧栽粤郧栽悦粤粤粤悦栽郧悦郧悦悦
蛋白表达 蕴葬郧砸鄄耘载员 栽郧郧粤栽悦悦郧悦粤郧粤郧郧栽悦粤粤栽粤粤栽郧郧郧悦悦
蕴葬郧砸鄄耘载圆 郧悦栽悦郧粤郧栽栽粤悦栽粤郧郧栽郧郧栽栽郧粤郧郧悦悦郧栽粤郧粤悦
基因点突变 蕴葬郧砸鄄酝哉员 悦栽郧悦郧郧悦栽郧栽郧郧郧栽栽郧粤粤栽栽悦悦栽粤悦悦
蕴葬郧砸鄄酝哉圆 郧郧栽粤郧郧粤粤栽栽悦粤粤悦悦悦粤悦粤郧悦悦郧悦粤郧
员援 远摇 日本落叶松 蕴葬郧砸蛋白结构模拟
以人类 郧砸 渊孕阅月院员早则粤冤 载 射线晶体结构为模
版袁用 陨灶泽蚤早澡贼 陨陨 软件中的 粤造蚤早灶 圆阅 程序进行序列比
对遥 并分别以 酝燥凿藻造藻则模块和 责则燥枣蚤造藻鄄猿阅程序进行三
维结构模拟和模拟结果校验遥 以 责则燥枣蚤造藻鄄猿阅 校验值
高低作为评判模拟结果优劣的标准袁挑选校验值最
高的模拟结构遥
员援 苑摇 日本落叶松 蕴葬郧砸蛋白的表达和纯化
以 责耘粤杂再鄄栽猿 辕 蕴葬郧砸重组质粒为模板袁用表达引
物 蕴葬郧砸鄄耘载员 辕 圆 进行 孕悦砸 扩增遥 孕悦砸 产物经双酶
切回收袁连至蛋白表达载体 责耘栽猿园葬遥 突变体基因的
获得是通过 孕悦砸 将 蕴葬郧砸 的 匀蚤泽缘圆愿 突变为 郧造灶袁并
连至表达载体 责耘栽猿园葬遥 将含有 蕴葬郧砸 以及 匀缘圆愿匝
突变体的质粒转化到大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤感受态
细胞中袁挑取阳性克隆进行测序遥 将测序验证的表
达菌在含卡那霉素的 蕴月液体培养基中培养至 韵阅远园园
为 园援 缘袁加入 陨孕栽郧至终浓度为 园援 员 皂皂燥造窑蕴 原员袁猿苑益
过夜培养遥 在 源益袁远 缘园园 早条件下离心 员园 皂蚤灶 收集
菌体遥 用缓冲液 粤 渊圆园 皂皂燥造窑蕴 原员咪唑袁园援 缘 皂燥造窑
蕴 原员 晕葬悦造袁圆园 皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬猿孕韵源袁责匀值 苑援 远冤 重悬菌
体并在冰上超声破碎菌体遥 将破碎后的菌液在
源益袁员园 园园园 早条件下离心 员园 皂蚤灶袁收集上清并上样
至经缓冲液 粤 平衡后的 晕蚤 琼脂糖亲和层析柱中遥
常温结合 猿园 皂蚤灶 后用缓冲液 粤 洗脱杂蛋白遥 然后
用缓冲液 月 渊园援 猿 皂燥造窑蕴 原员咪唑袁园援 缘 皂燥造窑蕴 原员晕葬悦造袁
圆园 皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬猿孕韵源袁责匀 值 苑援 远冤洗脱目的蛋白遥
洗脱下的蛋白用 孕阅鄄员园 凝胶过滤柱换至缓冲液 悦
渊员 皂皂燥造窑蕴 原员 耘阅栽粤袁 圆园 皂皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造袁 员园园
皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造冤 中遥
员援 愿摇 日本落叶松 蕴葬郧砸蛋白生化特性检测
蛋白定量采用二喹啉甲酸法渊月悦粤冤袁用牛血清
蛋白作为标准遥 蕴葬郧砸 活性测定参考 酝葬增蚤泽 等的方
法咱愿暂 遥 反应体系包括 员 皂皂燥造窑蕴 原员 郧杂杂郧袁 园援 员 皂皂燥造
窑蕴 原员 晕粤阅孕匀袁 缘园 皂皂燥造窑蕴 原员 运猿孕韵源 和 员 皂皂燥造窑
蕴 原员 耘阅栽粤袁 责匀 值 苑援 远遥 在常温下用紫外分光光度计
耘增燥造怎贼蚤燥灶 猿园园 测定 猿 皂蚤灶 内 粤猿源园的下降值袁作为酶活
性计算的依据遥 酶比活定义为 员 皂早 郧砸 在 员 皂蚤灶 内
氧化 晕粤阅孕匀的微摩尔数遥
在进行 蕴葬郧砸 对 郧杂杂郧 的酶促动力学分析时袁
固定 晕粤阅孕匀浓度为 园援 员 皂皂燥造窑蕴 原员袁郧杂杂郧 的浓度
在 园援 园员 园援 缘 皂皂燥造窑蕴 原员之间变化袁然后测定酶的
催化活性曰在进行 蕴葬郧砸对 晕粤阅孕匀 的酶促动力学分
析时袁固定 郧杂杂郧浓度为 员 皂皂燥造窑蕴 原员袁晕粤阅孕匀的浓
度在 园援 园园园 猿 园援 园园苑 皂皂燥造窑蕴 原员之间变化袁然后测
定酶的催化活性袁最后得到的酶促动力学数据用
匀赠责藻则猿圆 责则燥早则葬皂 程序渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 造蚤增援 葬糟援 怎噪 辕 憎躁泽藻 辕
泽燥枣贼憎葬则藻援 澡贼皂造冤进行非线性回归分析遥
为测定日本落叶松发挥催化活性时的最适 责匀
值范围袁采用 运猿孕韵源袁栽则蚤泽鄄匀悦造和 悦粤孕杂 渊晕鄄环己基鄄猿鄄
氨基丙磺酸冤猿 种缓冲液袁浓度均为 缘园 皂皂燥造窑蕴 原员袁
责匀值分别为 缘援 缘 愿援 缘袁苑援 缘 员园援 园袁员园援 园 员员援 园遥
热力学稳定性测定是将酶在 苑园益分别保温 圆尧源尧远尧
愿尧员缘尧猿园 和 远园 皂蚤灶 后袁测定酶的催化活性遥 重金属
离子对蛋白催化活性影响的测定是将不同浓度的
孕遭圆 垣 袁悦怎圆 垣 袁悦凿圆 垣加入反应体系中袁测定酶活性的变
化遥 考虑到磷酸缓冲液可能与金属离子生成沉淀袁
将原反应缓冲液中的 运猿孕韵源 换成 栽则蚤泽鄄匀悦造袁责匀 值愿郾 园遥 在含有不同浓度咪唑的反应体系中测定 蕴葬郧砸
的催化活性袁以检测咪唑对 蕴葬郧砸催化活性的影响遥
圆摇 结果与分析
圆援 员 摇 日本落叶松 蕴葬郧砸 基因的克隆和表达模式
分析
摇 摇 以日本落叶松芽 糟阅晕粤 为模版袁利用引物 蕴葬鄄
郧砸鄄悦蕴员 辕 圆 克隆得到 蕴葬郧砸 的 糟阅晕粤 序列遥 该 糟阅晕粤
序列包含 员 远怨圆 遭责 的开放阅读框袁编码 缘远猿 个氨基
酸组成的蛋白袁预测分子量为 远员援 园远 噪阅葬遥 保守结构
域分析表明袁蕴葬郧砸 蛋白具有典型的 郧砸 蛋白结构
域袁表明克隆得到的基因是 郧砸 基因遥 多重序列比
对表明袁蕴葬郧砸和其他植物的 郧砸 蛋白具有较高的序
列相似性 渊图 员 冤袁序列相似性范围在 源猿援 缘豫
远愿郾 园豫之间渊表 圆冤遥
通过 砸栽鄄孕悦砸 研究了 蕴葬郧砸 在不同组织中的表
达分布遥 孕悦砸结果显示 蕴葬郧砸 在芽尧成熟针叶尧茎韧
苑圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
皮部和根韧皮部中均表达渊图 圆冤袁表明 蕴葬郧砸是组成
型表达基因袁可能在日本落叶松生长发育中起到重
要作用遥
摇 摇 在所有植物 郧砸蛋白中均保守的氨基酸残基用黑色背景标示遥 图中黑色箭头指示保守的 匀蚤泽残基遥 序列比对用以下序列构
建院孕贼郧砸员渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 载孕赃园园圆圆怨怨圆苑远冤袁粤贼郧砸员渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 晕孕赃员愿怨园缘怨冤袁在皂郧砸员渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 晕孕
赃园园员员源员缘源缘冤袁韵泽郧砸员渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 晕孕赃园园员园源愿源愿缘冤袁孕贼郧砸圆渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 载孕赃园园圆猿圆员缘员缘冤袁粤贼郧砸圆渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟鄄
糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 晕孕赃员怨员园圆远冤袁在皂郧砸圆渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 阅粤粤源猿缘园圆冤袁韵泽郧砸圆渊郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 晕孕赃园园员园源怨园缘苑冤
图 员摇 植物 郧砸的蛋白序列比对
愿圆
专刊 王摇 鑫等院日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究
表 圆摇 植物 郧砸蛋白的序列相似性分析
郧砸泽 蕴葬郧砸 韵泽郧砸圆 在皂郧砸圆 粤贼郧砸圆 孕贼郧砸圆 韵泽郧砸员 在皂郧砸员 粤贼郧砸员 孕贼郧砸员
蕴葬郧砸
韵泽郧砸圆 远远援 圆
在皂郧砸圆 远苑援 员 愿缘援 远
粤贼郧砸圆 远缘援 源 苑员援 圆 远愿援 远
孕贼郧砸圆 远愿援 园 苑员援 猿 苑园援 远 苑苑援 苑
韵泽郧砸员 源远援 员 源缘援 苑 源远援 园 源源援 苑 源缘援 缘
在皂郧砸员 源缘援 怨 源缘援 苑 源苑援 猿 源缘援 员 源远援 园 愿愿援 苑
粤贼郧砸员 源猿援 缘 源圆援 猿 源猿援 愿 源猿援 员 源猿援 远 苑园援 苑 苑圆援 员
孕贼郧砸员 源源援 圆 源猿援 远 源源援 愿 源猿援 猿 源源援 愿 苑源援 员 苑猿援 怨 苑怨援 愿
员院芽曰 圆院成熟针叶曰 猿院茎韧皮部曰 源院根韧皮
部
图 圆摇 蕴葬郧砸基因的表达模式
圆援 圆摇 蕴葬郧砸蛋白的亚细胞定位分析
首先用 栽葬则早藻贼孕 员援 员 杂藻则增藻则 软件对 蕴葬郧砸 蛋白的
亚细胞定位进行预测袁栽葬则早藻贼孕 员援 员 杂藻则增藻则 软件预测
蕴葬郧砸蛋白含有 远怨 个氨基酸的叶绿体转运肽袁表明
该蛋白可能定位于叶绿体遥 为了进一步确定 蕴葬郧砸
的亚细胞定位袁将 蕴葬郧砸 的 悦 末端与 藻郧云孕 蛋白融
合袁构建融合蛋白表达载体袁并转化拟南芥原生质体
使其瞬时表达遥 在激光扫描共聚焦显微镜下观察到
蕴葬郧砸鄄藻郧云孕荧光和叶绿体荧光具有相同的位置袁证
明 蕴葬郧砸确实定位到叶绿体渊图 猿冤遥
渊藻郧云孕荧光信号和叶绿素自发荧光信号通过激光扫描共聚焦显
微镜观察得到遥 白色的标尺长度为 员园 滋皂 遥冤
图 猿摇 蕴葬郧砸蛋白的亚细胞定位
圆援 猿摇 蕴葬郧砸蛋白三维结构建模
以人类 郧砸渊孕阅月院 员早则粤冤的 载 射线晶体结构为
模板渊图 源月冤袁利用 陨灶泽蚤早澡贼 陨陨蛋白结构模拟软件模拟
了 蕴葬郧砸蛋白的三维结构渊图 源粤冤遥 孕则燥枣蚤造藻鄄猿阅 校验
结果表明袁除了残基 员缘圆鄄员缘远 处评分为负值外袁其余
得分均为正值渊图 源悦冤袁这表明模拟结果有较高的可
信度遥 尽管 蕴葬郧砸和人类 郧砸 蛋白序列相似度不高
渊猿缘援 远豫 冤袁但是它们的三维结构却相对保守袁均含
有三个明显的结构域院包括两个 砸燥泽泽皂葬灶灶 卷曲结构
域袁以及一个与二聚体形成相关的界面结构域遥
粤和 月分别是模拟的 蕴葬郧砸蛋白结构与人类 郧砸的晶体结构曰悦院孕则燥鄄
枣蚤造藻鄄猿阅对模拟的 蕴葬郧砸蛋白结构的评估结果
图 源摇 蕴葬郧砸的三维结构模拟
圆援 源摇 蕴葬郧砸蛋白的生化特性分析
将去掉信号肽的成熟 蕴葬郧砸 蛋白的 糟阅晕粤 序列
与 责耘栽猿园葬载体连接袁 构建表达载体 责耘栽猿园葬 辕 蕴葬郧砸遥
将构建的表达载体 责耘栽猿园葬 辕 蕴葬郧砸 转化到大肠杆菌
月蕴圆员 感受态细胞中袁经 陨孕栽郧 诱导后发现袁成熟的
蕴葬郧砸蛋白能够在大肠杆菌中可溶性表达遥 通过镍
柱亲和层析纯化后袁获得纯化的重组蛋白渊图 缘冤遥
以 郧杂杂郧 和 晕粤阅孕匀 为底物对 蕴葬郧砸 进行了酶
学性质检测遥 结果表明院蕴葬郧砸 对 郧杂杂郧 和 晕粤阅孕匀
具有较高的催化活性袁活性值为 员员源援 猿源 依 圆援 员园 滋皂燥造
窑皂蚤灶 原员窑皂早 原员遥 动力学检测结果表明袁蕴葬郧砸 对底
怨圆
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
酝院分子量标准参照曰员院大肠杆菌 月蕴圆员 的总细胞提取物曰圆院含有
责耘栽猿园葬 辕 蕴葬郧砸质粒的大肠杆菌经诱导蛋白表达后的总细胞提取物曰
猿院表达重组 蕴葬郧砸蛋白的细胞经超声破碎和离心后的上清曰源院表达
重组 蕴葬郧砸蛋白的细胞经超声破碎和离心后的沉淀曰缘院纯化的 蕴葬郧砸
蛋白
图 缘摇 蕴葬郧砸蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
物 郧杂杂郧和 晕粤阅孕匀 的 运皂 值分别是 愿苑援 苑圆 滋皂燥造窑
蕴 原员和 圆援 苑远 滋皂燥造窑蕴 原员渊表 猿冤遥
蕴葬郧砸在反应体系的 责匀值范围为 苑援 园 怨援 园 时
具有较高的催化活性袁在 责匀值为 苑援 园 和 怨援 园 时袁蕴葬鄄
郧砸分别保持其最高催化活性的 远苑豫和 缘员豫渊图 远粤冤遥
蕴葬郧砸是一个热稳定的蛋白袁在 苑园益保温 猿园 皂蚤灶 后袁
仍保留其最高催化活性的 源远豫 遥 即使延长保温时
间至 员 澡袁蕴葬郧砸 仍然保持有最大活性的 圆员豫 渊图
远月冤遥
在反应体系中添加不同浓度的咪唑对 蕴葬郧砸 的
催化活性影响不大袁当反应体系中含有 怨园 皂皂燥造窑
蕴 原员的咪唑时袁蕴葬郧砸具有最高的催化活性袁活性值为
不添加咪唑时的 员援 圆远 倍遥
悦凿圆 垣 尧孕遭圆 垣和 悦怎圆 垣等金属离子对 蕴葬郧砸 的催化
活性具有明显的抑制袁当在反应体系中分别添加 缘园
滋皂燥造窑蕴 原员的 猿 种金属离子时袁蕴葬郧砸 的催化活性均
低于不添加 猿 种金属离子时催化活性的 圆园援 源豫 遥
蕴葬郧砸对 猿 种金属离子的响应不同袁例如袁当在反应
体系中添加 源园 滋皂燥造窑蕴 原员的 悦凿圆 垣时袁蕴葬郧砸 仍保留
有不添加 猿 种金属离子时催化活性的 怨园援 园豫 袁而在
反应体系中分别添加 源园 滋皂燥造窑蕴 原员的 孕遭圆 垣和 悦怎圆 垣
时袁蕴葬郧砸分别只保留有不添加 猿 种金属离子时催化
活性的 园援 远豫和 猿员援 愿豫 遥
表 猿摇 蕴葬郧砸及 匀缘圆愿匝突变体的酶学催化活性和动力学分析
郧砸泽 催化活性 辕渊滋皂燥造窑皂蚤灶 原员窑皂早 原员冤
郧杂杂郧
运皂 辕
渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
噪糟葬贼 辕
杂 原 员
噪糟葬贼 辕 运皂 辕
渊滋渊皂燥造窑蕴 原员冤 原员窑杂 原员冤
晕粤阅孕匀
运皂 辕
渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
噪糟葬贼 辕
杂 原 员
噪糟葬贼 辕 运皂 辕
渊滋渊皂燥造窑蕴 原员冤 原员窑杂 原员冤
宰蚤造凿鄄贼赠责藻 员员源援 猿源 依 圆援 员园 愿苑援 苑圆 依 远援 缘愿 员圆怨援 园远 员援 源苑 圆援 苑远 依 园援 圆愿 员员员援 源园 源园援 猿远
匀缘圆愿匝 园援 苑苑 依 园援 园员 员愿援 缘苑 依 园援 怨猿 园援 苑怨 园援 园源 园援 员缘 依 园援 园员 园援 远园 源援 园园
摇 摇 粤院责匀对 蕴葬郧砸和 匀缘圆愿匝突变体酶活性的影响曰月院不同浓度 悦凿圆 垣 尧孕遭圆 垣和 悦怎圆 垣离子对 蕴葬郧砸酶活性的影响曰悦院不同浓度咪唑对 蕴葬郧砸
和 匀缘圆愿匝突变体酶活性的影响曰阅院苑园益保温不同时间对 蕴葬郧砸和 匀缘圆愿匝突变体酶活性的影响
图 远摇 蕴葬郧砸和 匀缘圆愿匝突变体蛋白的酶活性分析
园猿
专刊 王摇 鑫等院日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究
圆援 缘摇 蕴葬郧砸中 匀蚤泽缘圆愿 的催化性质
多重序列比对发现 蕴葬郧砸 蛋白的第 缘圆愿 位 匀蚤泽
在所有的植物 郧砸 中均保守渊图 员冤遥 为了研究这个
氨基酸是否对 蕴葬郧砸 的催化性质发挥作用袁本研究
通过点突变将 蕴葬郧砸 蛋白的第 缘圆愿 位 匀蚤泽 置换为
郧造灶袁并对其酶学活性进行了鉴定遥 相对于野生型
蕴葬郧砸袁匀缘圆愿匝突变体蛋白的催化活性显著降低袁只
保留野生型蛋白活性的 园援 苑豫 遥 与野生型蛋白相
比袁匀缘圆愿匝突变体蛋白对 郧杂杂郧和 晕粤阅孕匀的亲和力
分别上升到 源援 苑 倍和 员苑援 圆 倍袁但对两种底物的催化
效率则分别下降到 圆援 苑豫和 员园援 园豫 遥
对 匀缘圆愿匝突变体蛋白在不同 责匀值下的催化活
性进行检测发现袁突变体蛋白催化的最适 责匀 值范
围由野生型的 苑援 园 怨援 园 变为 愿援 缘 员园援 园遥 相对于
野生型蛋白袁匀缘圆愿匝 突变体蛋白的热稳定性显著下
降袁在 苑园益保温 员缘 皂蚤灶后袁其活性便完全丧失袁而在
相同条件下野生型蛋白仍保留最高活性的 远怨援 远豫 遥
在反应体系中添加不同浓度的咪唑对 匀缘圆愿匝 突变
体蛋白的催化活性有显著影响袁在咪唑浓度为 园
员愿园 皂皂燥造窑蕴 原员范围内袁随着咪唑浓度的增加袁突变
体蛋白的催化活性持续升高袁当反应体系中含有
员愿园 皂皂燥造窑蕴 原员的咪唑时袁突变体蛋白的催化活性为
不加咪唑时的 缘援 员 倍遥
猿摇 讨论
植物在有氧代谢过程中会不断产生活性氧袁当
受到各种胁迫时植物体内的活性氧水平会大大升
高袁活性氧的积累会对植物造成损伤遥 抗坏血酸 原
谷胱苷肽循环是植物体内重要的活性氧清除机制袁
郧砸是这一循环中的重要酶类袁对于植物抵抗氧化胁
迫具有重要作用遥 日本落叶松是我国北方重要的针
叶造林树种袁但其生长受到各种胁迫的影响袁因此研
究日本落叶松中与胁迫相关的 郧砸 具有重要的理论
意义和应用价值遥
郧砸广泛存在于植物的叶绿体尧线粒体和细胞质
中遥 根据植物 郧砸的 晕末端序列袁砸燥怎澡蚤藻则 等将植物
郧砸分为两类院细胞器 郧砸 和细胞质 郧砸咱怨暂 遥 对拟南
芥 郧砸的研究表明袁虽然叶绿体 郧砸 仅贡献了总 郧砸
活性的 猿缘豫 袁但该基因缺失突变体在胚胎发育的早
期就已经死亡袁说明叶绿体 郧砸 对植物的正常生长
发育十分重要咱员园暂 遥 在本研究中袁通过亚细胞定位分
析袁发现 蕴葬郧砸 定位于叶绿体遥 叶绿体在进行光合
作用的过程中会不断产生活性氧袁因此 蕴葬郧砸 可能
在清除叶绿体产生的活性氧方面发挥重要作用遥 对
蕴葬郧砸的表达模式进行分析发现袁蕴葬郧砸 不仅在含有
叶绿体的芽尧针叶和茎韧皮部等部位表达袁而且在不
含有叶绿体的根韧皮部中也表达袁表明 蕴葬郧砸 不仅
在清除叶绿体产生的活性氧方面发挥重要作用袁在
其它代谢过程中可能也发挥作用遥
对 蕴葬郧砸 进行酶学性质分析发现袁 蕴葬郧砸 对
晕粤阅孕匀比对 郧杂杂郧有更高的亲和力袁并且酶发挥催
化活性的最适 责匀 值范围在 苑援 园 怨援 园 之间袁小麦袁
玉米袁豌豆等植物 郧砸与 蕴葬郧砸有着相似的动力学参
数和最适 责匀 值范围咱员员 原 员源暂 遥 这可能预示着在裸子
植物和被子植物中袁郧砸 有着相似的催化特性遥 蕴葬鄄
郧砸是热稳定蛋白袁在 苑园益保温 员 澡仍保留最高活性
的 圆员豫 遥 这预示着 蕴葬郧砸能够清除日本落叶松受到
高温胁迫时产生的活性氧袁蕴葬郧砸可能在日本落叶松
抵抗高温胁迫过程中发挥作用遥 与此类似袁对小鼠
肝脏和大肠杆菌 郧砸 的研究表明袁二者均为热稳定
蛋白咱员缘 原 员远暂 遥 因此袁在动植物和微生物中袁郧砸可能都
是热稳定性蛋白遥 重金属 悦怎圆 垣 尧悦凿圆 垣和 孕遭圆 垣对 蕴葬鄄
郧砸具有明显的抑制作用遥 与 蕴葬郧砸 相比袁虹鳟鱼
郧砸对这 猿 种金属离子的耐受性要高袁而人类 郧砸 对
这些离子则更为敏感咱员苑 原 员愿暂 袁这意味着不同生物 郧砸
对重金属离子的敏感性不同遥
蕴葬郧砸第 缘圆愿 位的 匀蚤泽在所有植物 郧砸中均高度
保守袁 在大肠杆菌 郧砸 的对应位点也是 匀蚤泽
渊匀蚤泽源猿怨冤袁说明这一位点在真核和原核生物中可能
都保守遥 根据 阅藻燥灶葬则葬蚤灶 等的研究袁大肠杆菌 郧砸 的
匀蚤泽源猿怨 可能在催化过程中在谷胱苷肽结合口袋内作
为质子的供体 辕受体袁将 匀蚤泽源猿怨 突变为 郧造灶 后袁
匀源猿怨匝突变体只保留约 员豫的野生型活性袁且其 噪糟葬贼
值大大降低咱员怨暂 遥 在本研究中袁将 蕴葬郧砸的 匀蚤泽缘圆愿 突
变为 郧造灶 后袁匀缘圆愿匝 突变体只保留约 园援 苑豫的野生
型活性袁且其 噪糟葬贼值也大大降低遥 因此袁在植物中袁对
应于 蕴葬郧砸 的 匀蚤泽缘圆愿 位点的 匀蚤泽 可能与大肠杆菌
郧砸中对应位点的 匀蚤泽源猿怨 具有相似的催化功能袁即
在催化过程中在谷胱苷肽结合口袋内作为质子的供
体 辕受体遥 将 蕴葬郧砸的 匀蚤泽缘圆愿 突变为 郧造灶 后袁匀缘圆愿匝
突变体的热稳定性降低袁说明这一位点还影响 郧砸
蛋白结构稳定性遥
本研究整合序列分析尧基因表达模式尧亚细胞定
员猿
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
位尧蛋白质三维结构以及酶学性质分析袁鉴定出日本
落叶松中编码具有较高催化活性和热稳定性的叶绿
体 郧砸蛋白袁为揭示 郧砸 在植物抗逆中的作用袁以及
利用 郧砸对植物进行遗传改良袁提高其抗氧化胁迫
的能力奠定了基础遥
参考文献院
咱员暂 砸葬燥 粤 杂 灾 悦袁 砸藻凿凿赠 粤 砸援 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻院 葬 责怎贼葬贼蚤增藻 则藻凿燥曾
则藻早怎造葬贼燥则赠 泽赠泽贼藻皂 蚤灶 责造葬灶贼 糟藻造造泽咱酝暂援 杂怎造枣怎则 粤泽泽蚤皂蚤造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 粤遭蚤燥贼蚤糟
杂贼则藻泽泽 蚤灶 孕造葬灶贼泽袁 晕藻贼澡藻则造葬灶凿泽院 杂责则蚤灶早藻则袁 圆园园愿院 员员员 原 员源苑
咱圆暂 运蚤皂 陨 杂袁 运蚤皂 再 杂袁 再燥燥灶 匀 杂援 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣则燥皂 韵则赠扎葬 泽葬鄄
贼蚤增葬 蚤灶糟则藻葬泽藻泽 葬糟择怎蚤则藻凿 贼燥造藻则葬灶糟藻 贼燥 葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽藻泽 蚤灶 葬 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠
皂燥凿蚤枣蚤藻凿 杂葬糟糟澡葬则燥皂赠糟藻泽 糟藻则藻增蚤泽蚤葬藻 泽贼则葬蚤灶咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠
葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员圆袁 圆圆渊员员冤院 员缘缘苑 原 员缘远苑
咱猿暂 云燥赠藻则 悦 匀袁 杂燥怎则蚤葬怎 晕袁 孕藻则则藻贼 杂袁 藻贼 葬造援 韵增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻
则藻凿怎糟贼葬泽藻 遭怎贼 灶燥贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 泽赠灶贼澡藻贼葬泽藻 造藻葬凿泽 贼燥 蚤灶糟则藻葬泽藻泽 蚤灶 葬灶贼蚤燥曾蚤鄄
凿葬灶贼 糟葬责葬糟蚤贼赠 葬灶凿 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 责澡燥贼燥蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 蚤灶 责燥责造葬则 贼则藻藻泽咱 允暂 援
孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨缘袁员园怨渊猿冤院 员园源苑 原 员园缘苑
咱源暂 悦澡藻灶 再 孕袁 载蚤灶早 蕴 孕袁 宰怎 郧 允袁 藻贼 葬造援 孕造葬泽贼蚤凿蚤葬造 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻
枣则燥皂 匀葬赠灶葬造凿蚤葬 增蚤造造燥泽葬 蚤泽 葬灶 藻灶澡葬灶糟藻则 燥枣 责燥憎凿藻则赠 皂蚤造凿藻憎 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
蚤灶 憎澡藻葬贼 渊栽则蚤贼蚤糟怎皂 葬藻泽贼蚤增怎皂冤咱允暂 援 孕造葬灶贼 葬灶凿 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园苑袁
源愿渊员圆冤院 员苑园圆 原 员苑员圆
咱缘暂 吴摇 涛袁张俊红袁韩素英袁等援 日本落叶松小 砸晕粤 文库构建及其
皂蚤糟则燥砸晕粤 鉴定咱允暂 援林业科学研究袁 圆园员圆袁圆缘渊远冤院 远苑苑 原 远愿源
咱远暂 栽葬灶早 在 载袁 再葬灶早 匀 蕴援 云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 凿蚤增藻则早藻灶糟藻 葬灶凿 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 责则燥责藻则贼蚤藻泽
燥枣 凿藻澡赠凿则燥葬泽糟燥则遭葬贼藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶泽 枣则燥皂 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬
咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠 砸藻责燥则贼泽袁 圆园员猿袁 源园院 缘员园缘 原 缘员员源
咱苑暂 再燥燥 杂 阅袁 悦澡燥 再 匀袁 杂澡藻藻灶 允援 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 皂藻泽燥责澡赠造造 责则燥贼燥责造葬泽贼泽院 葬
增藻则泽葬贼蚤造藻 糟藻造造 泽赠泽贼藻皂 枣燥则 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 咱 允暂 援 晕葬鄄
贼怎则藻 孕则燥贼燥糟燥造泽袁 圆园园苑袁 圆渊苑冤院 员缘远缘 原 员缘苑圆
咱愿暂 酝葬增蚤泽 砸 阅袁 杂贼藻造造憎葬早藻灶 耘援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 泽怎遭怎灶蚤贼 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 早造怎贼葬鄄
贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣则燥皂 遭葬噪藻则泽爷赠藻葬泽贼咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽鄄
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早造怎贼葬则藻凿燥曾蚤灶 泽赠泽贼藻皂泽咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠袁 圆园园远袁缘苑
渊愿冤院 员远愿缘 原 员远怨远
咱员园暂 酝葬则贼赠 蕴袁 杂蚤葬造葬 宰袁 杂糟澡憎葬则扎造葬灶凿藻则 酝袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 晕粤阅孕匀鄄凿藻责藻灶凿鄄
藻灶贼 贼澡蚤燥则藻凿燥曾蚤灶 泽赠泽贼藻皂 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼藻泽 葬 枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 遭葬糟噪怎责 枣燥则 糟赠贼燥泽燥造蚤糟
早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽咱允暂 援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 晕葬贼蚤燥灶葬造
粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 圆园园怨袁 员园远渊圆圆冤院 怨员园怨 原 怨员员源
咱员员暂 蕴葬泽糟葬灶燥 匀 砸袁 悦葬泽葬灶燥 蕴 酝袁 酝藻造糟澡蚤燥则则藻 酝 晕袁 藻贼 葬造援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造
葬灶凿 皂燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶 燥枣 憎澡藻葬贼 糟澡造燥则燥责造葬泽贼蚤糟 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻鄄
凿怎糟贼葬泽藻咱允暂 援 月蚤燥造燥早蚤葬 责造葬灶贼葬则怎皂袁 圆园园员袁源源渊源冤院 缘园怨 原 缘员远
咱员圆暂 运葬造贼鄄栽燥则则藻泽 宰袁 月怎则噪藻 允 允袁 粤灶凿藻则泽燥灶 允 酝援 悦澡造燥则燥责造葬泽贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻
则藻凿怎糟贼葬泽藻院 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 责则燥责藻则贼蚤藻泽咱 允暂 援 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤葬 孕造葬灶贼葬则怎皂袁
员怨愿源袁 远员渊圆冤院 圆苑员 原 圆苑愿
咱员猿暂 悦燥灶灶藻造造 允 孕袁 酝怎造造藻贼 允 耘援 孕藻葬 糟澡造燥则燥责造葬泽贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻院
责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨愿远袁愿圆
渊圆冤院 猿缘员 原 猿缘远
咱员源暂 酝葬澡葬灶 允 砸袁 月怎则噪藻 允 允援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤鄄
燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣则燥皂 糟燥则灶 皂藻泽燥责澡赠造造 糟澡造燥则燥责造葬泽贼泽 咱 允暂 援 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤葬
孕造葬灶贼葬则怎皂袁 员怨愿苑袁 苑员渊猿冤院 猿缘圆 原 猿缘愿
咱员缘暂 蕴佼孕耘在鄄月粤砸耘粤 允袁 蕴耘耘 悦 再援 酝燥怎泽藻鄄造蚤增藻则 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻
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咱员远暂 砸藻泽糟蚤早灶燥 酝袁 孕藻则澡葬皂 砸 晕援 杂贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 贼澡藻 晕粤阅孕匀鄄遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣
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咱员苑暂 悦燥遭葬灶 栽 粤袁 杂藻灶贼怎则噪 酝袁 悦蚤枣贼糟蚤 酝袁 藻贼 葬造援 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 泽燥皂藻 皂藻贼葬造 蚤燥灶泽
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咱员愿暂 栽藻噪皂葬灶 月袁 韵扎凿藻皂蚤则 匀袁 杂藻灶贼怎则噪 酝袁 藻贼 葬造援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟鄄
贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣则燥皂 则葬蚤灶遭燥憎 贼则燥怎贼 渊韵灶糟燥则澡赠灶糟澡怎泽
皂赠噪蚤泽泽冤 造蚤增藻则 葬灶凿 蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 藻枣枣藻糟贼泽 燥枣 皂藻贼葬造 蚤燥灶泽 燥灶 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
咱允暂 援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠 孕葬则贼 悦院 栽燥曾蚤糟燥造燥早赠
驭 孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠袁 圆园园愿袁 员源愿渊圆冤院 员员苑 原 员圆员
咱员怨暂 阅藻燥灶葬则葬蚤灶 酝 孕袁 月藻则则赠 粤袁 杂糟则怎贼贼燥灶 晕 杂袁 藻贼 葬造援 粤造贼藻则灶葬贼蚤增藻 责则燥贼燥灶
凿燥灶燥则泽 辕 葬糟糟藻责贼燥则泽 蚤灶 贼澡藻 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 贼澡藻 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 则藻鄄
凿怎糟贼葬泽藻 燥枣 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤院 贼澡藻 则燥造藻 燥枣 澡蚤泽贼蚤凿蚤灶藻鄄源猿怨 葬灶凿 贼赠则燥泽蚤灶藻鄄怨怨
咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨愿怨袁 圆愿渊圆缘冤院 怨远园圆 原 怨远园苑
圆猿