全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (1) : 37～41
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0120037205
毛红椿群体遗传结构的 SSR分析
刘　军 1 , 陈益泰 1 , 姜景民 1 , 何贵平 1 , 余国民 2
(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400; 2. 浙江省龙泉市林业科学研究所 , 浙江 龙泉　323700)
摘要 :利用 SSR分子标记对分布在我国的 7个毛红椿群体进行了遗传结构研究。结果表明 :毛红椿群体具有较低水
平的遗传变异 ;毛红椿群体的等位基因的平均数为 6. 1,有效等位基因数平均为 2. 7,平均期望杂合度为 0. 600 6;毛
红椿群体遗传分化系数 ( FST )平均值为 0. 185 4,在 FST值的基础上估算毛红椿群体间的基因流 (Nm )为 1. 098 3。采
用平均距离方法 (UPGMA)对 7个群体进行了聚类 ,对各群体遗传距离与地理距离的相关分析表明 :群体间遗传距
离与地理距离显著相关。分析了毛红椿濒危的原因 ,并提出了保护策略。
关键词 :毛红椿 ; SSR;分子标记 ;遗传结构
中图分类号 : Q943 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008203212
基金项目 : 中国林业科学研究院院所基金 (R ISF6808)和浙江省重大科技专项 (2008C0200422)
作者简介 : 刘　军 (1977—) ,男 ,山东泰安人 ,助理研究员 ,主要从事珍贵阔叶树种遗传改良和种质资源方向的研究.
Study on Popula tion Genetic Structure in Toona c ilia ta
var. pubescens w ith SSR
L IU Jun1 , CHEN Yi2tai1 , J IANG J ing2m in1 , HE Gui2ping1 , YU Guo2m in2
(1. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　311400 , Zhejiang, China;
2. Research Institute of Longquan City, Zhejiang Province , Longquan　323700, Zhejiang, China)
Abstract: Population genetic structure of seven natural populations of Toona cilia ta var. pubescens was studied with
simp le sequence repeat ( SSR) markers. The results showed that a low level genetic diversity was detected in the
populations of T. cilia ta var. pubescens. Average number of alleles and effective number of alleles (N e ) were 6. 1
and 2. 7 respectively. The mean expected heterozygosity was 0. 600 6. The major of genetic genetic variation
occurred within populations, which could be concluded from the coefficient of genetic differentiation ( FST =
0. 185 4). The level of gene flow (Nm ) was 1. 098 3. Dendrogram based Neipis ( 1978 ) genetic distance was
analyzed with UPGMA. Significant correlation was found between geographical distance and genetic distance. The
reasons that result in endangered status were analyzed, and some conservation strategies were put forward.
Key words: Toona cilia ta var. pubescens; simp le sequence repeat ( SSR) ; markers; genetic structure
　　了解濒危物种的遗传结构和遗传多样性水平 ,
可以提高对群体动力学、适应和进化机制的认识 ,对
探讨物种濒危机制、指导迁地保护和引种栽培以及
群体的保护价值评估等有着重要意义 [ 1 - 2 ]。目前遗
传结构研究已成为保护遗传学研究的热点 [ 3 - 6 ]。
SSR分子标记是一种基于 DNA长度多态性的检测
技术 ,具有共显性、高度可重复性、高度丰富的多态
性等优点 ,是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、
进行分子标记辅助育种和系谱分 析 的 理 想
工具 [ 7 - 9 ]。
毛红椿 ( Toona cilia ta var. pubescens ( Franch. )
Hand. 2Mazz. )是楝科 (Meliaceae ) 香椿属 ( Toona
Roem. )植物 ,为落叶大乔木 ,雌雄同株 ,花较小 ,花
粉主要靠风力传播。果实为蒴果 ,成熟后自然开裂。
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
种子两侧具翅 ,翅为膜质 ,较轻 ,也主要依靠风力传
播 ,主要依靠种子进行有性繁殖。毛红椿生长迅速 ,
树干通直 ,素有“中国桃花心木 ”之称 ,材质曙红 ,木
纹美丽 ,是珍贵的用材树种 ,具有很高的经济价值和
开发前景。毛红椿主要分布于华南地区 ,在江西、浙
江、云南、广东、福建等省有分布。由于环境变化、人
为砍伐以及其天然更新比较慢 ,毛红椿数量不断减
少 ,根据调查 ,仅在江西、云南和浙江有其天然林分
布。在《中国植物红皮书 》和《国家重点保护野生植
物名录 (第一批 ) 》中 ,毛红椿被列为国家二级保护
濒危种 ,也被各分布省列为珍惜濒危树种 [ 10 - 11 ]。目
前毛红椿人工林的用种主要采自数量较少的天然林
和人工林 ,所以进行系统的良种选育和分子生物学
研究 ,扩大毛红椿的种植面积并研究其濒危原因 ,进
而采取积极有效的保护措施是非常必要的。目前 ,
国内尚没有关于毛红椿群体遗传学方面的研究报
道。本文利用 SSR分子标记技术 ,运用群体遗传学
原理 ,通过对 SSR标记位点的统计与分析 ,首次从
DNA水平上对毛红椿群体的遗传结构和遗传多样
性进行了研究 ,为毛红椿遗传资源的保存、测定、评
价和遗传育种提供实验依据。
1　材料和方法
1. 1　试验材料
2005年和 2006年对分布江西、浙江和云南三省
的 7个群体毛红椿进行实地调查 , 7个群体情况和
采样数量见表 1。采样时单株间原则上相距 50 m以
上 ,分单株采集母树中上部叶片 ,采下的叶片用硅胶
迅速干燥 ,硅胶与叶片的质量比为 10∶1。
表 1　毛红椿 7个群体地理位置和采样数量
群体 编号 经度 ( E) 纬度 (N) 海拔高度 /m 采样数量 /个
江西宜丰 YF 114°29′～114°45′ 28°30′～28°40′ 220～475 65
云南宾川 BC 100°16′～101°23′ 25°02′～25°22′ 1 404～1 820 60
云南元谋 YM 101°49′～101°52′ 25°17′～25°40′ 1 112～1 230 30
云南武定 WD 102°08′～102°12′ 25°47′～25°51′ 1 405～1 802 29
云南师宗 SZ 103°42′～104°34′ 24°21′～25°00′ 812～912 84
浙江仙居 XJ 120°32′～120°56′ 28°48′～28°56′ 600～820 27
浙江遂昌 SC 119°12′～119°23′ 28°30′～28°36′ 　510～1 220 25
1. 2　基因组 D NA的提取和 PCR扩增
用改良的 CTAB法提取基因组 DNA [ 10 ]。试验
中采用 15μL反应体系 ,成分 : 10 ×缓冲液 1. 5μL,
Taq酶 (2U·μL - 1 ) 0. 3μL, dNTP ( 2. 5 mmol·L - 1 )
1. 8 μL,引物 ( 10 μmol·L - 1 ) 0. 5 μL, DNA 模板
30 ng。用 B IO2RED MYCYLE PCR 基因扩增仪扩 增 ,反应程序 :先 94 ℃预变性 4 m in,然后进行 35个循环 (94 ℃变性 1 m in, 52、55 ℃退火 0. 5 m in, 72 ℃延伸 1 m in) ,最后 72 ℃延伸 10 m in。所用 SSR引物为本实验室设计并筛选的 8对重复性好、扩增谱带清晰且稳定的多态性引物 [ 10 ] ,引物的具体情况见表 2。
表 2　毛红椿基因组 8个微卫星位点的 PCR扩增引物
位点 GenBank登录号 引物序列 重复序列 退火温度 /℃ 等位基因大小 / bp
Tc01 DQ778303 F: TCAATGCAATTTAGGAGGAA R: TGCTTGTTGAACCCTGTG ( GA) 8 52 240～291
Tc02 DQ453904 F: TAGGAAAGGCAAGGTGGG R: GGGTGGTCGATGAGGGTT (AG) 14 55 109～120
Tc03 DQ453907 F: GATTACGCCAGGCAAACG R: TTGAATATGGGAGAAGGT (CT) 6 55 230～320
Tc04 DQ453906 F: GAAACCAGCAGGCAGAGC R: GAAGAAGGGTGAGCGAGA (AG) 10 55 110～230
Tc05 DQ453905 F: AGTAATAGCCTGTAGAGCAG R: AGAGTGGGGTGGTCGATGAG (AG) 13 55 120～242
Tc06 DQ453903 F: ACTCGTGACACTTAGCCTGTA R: CTGGCGTAATCATGGTCATAC ( TTTCTC) 7 55 121～231
Tc07 DQ453912 F: ATGGATGAGTGTGCGATAGG R: TGTGATGTAGGAGTCTGAAC ( TC) 7 55 182～280
Tc08 DQ453914 F: TGTCTCAGTTTATGCTGGCGT R: CTGCCCAATCAACAAGAG ( TC) 8 55 170～260
1. 3　扩增产物的检测
PCR扩增产物加入 5 μL 左右的上样缓冲液
( loading buffer) ,用 8%聚丙烯酰胺凝胶 ,电压 120 V
电泳。电泳缓冲液为 1 ×TBE,电压 120 V电泳 3 h
后 ,银染检测并用数码相机照相。
83
第 1期 刘 　军等 :毛红椿群体遗传结构的 SSR分析
1. 4　数据分析
微卫星是共显性标记 ,同一引物扩增产物中电
泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。用 A、B、
C、D、E⋯⋯按条带大小从大到小进行编号。群体遗
传多样性分析包括群体内遗传变异水平的检测 ,群
体间遗传分化等方面。采用 POPGENE version 1. 31
软件计算在物种水平和群体水平的观察等位基因数
目 (N a )、有效等位基因数目 (N e )、各位点的观察杂
合度 (Ho )和期望杂合度 (He )、固定指数 ( F IS )、基因
分化系数 ( FST )、基因流 (Nm )。基于 POPGENE软件
计算群体间 Nei’s无偏遗传距离 (1978)并进行聚类
分析 ,利用 Mantel检测计算群体间的遗传距离和地
理距离的相关程度。
2　结果与分析
2. 1　毛红椿遗传多样性分析
扩增 8个 SSR位点 ,其中 Tc06和 Tc07位点等
位基因数最多为 8个 , Tc02位点的等位基因数最少
为 4个 ,所有观察等位基因的平均数 A = 6. 1。有效
等位基因数从 1. 4 ( Tc02)到 3. 6 ( Tc07) ,平均有效
等位基因数 N e = 2. 7 (表 3)。从表 3可以看出 :观察
杂合度 (Ho )变化范围为 0. 334 4～0. 865 6,平均为
0. 627 5;期望杂合度 (He )的变化范围为 0. 292 2～
0. 719 9,平均为 0. 600 6。
表 3　毛红椿遗传多样度、F统计量
位点 等位基因数 (N a ) 有效等位基因数 (N e ) 固定系数 ( F IS ) 基因分化系数 ( FST ) 期望杂合度 (He ) 观察杂合度 (Ho )
Tc01 5 2. 7 - 0. 138 9 0. 269 0 0. 629 9 0. 596 9
Tc02 4 1. 4 - 0. 340 1 0. 114 9 0. 292 2 0. 334 4
Tc03 6 2. 0 - 0. 097 5 0. 063 1 0. 508 0 0. 537 5
Tc04 7 2. 9 - 0. 579 1 0. 183 0 0. 660 5 0. 865 6
Tc05 6 3. 3 - 0. 490 0 0. 419 2 0. 696 8 0. 602 0
Tc06 8 3. 5 - 0. 262 8 0. 102 5 0. 714 5 0. 806 5
Tc07 8 3. 6 0. 139 6 0. 063 1 0. 719 9 0. 618 7
Tc08 5 2. 4 - 0. 407 4 0. 213 1 0. 582 6 0. 658 6
平均数 6. 1 2. 7 - 0. 247 9 0. 185 4 0. 600 6 0. 627 5
标准差 1. 457 7 0. 766 7 0. 233 7 0. 121 7 0. 143 9 0. 162 7
　　对毛红椿 7个群体的遗传多样性进行比较 ,从
表 4可以看出 :云南元谋群体的遗传多样性最高 (He
= 0. 658 4) ,该群体的平均有效等位基因数为 2. 9。
云南师宗群体的遗传多样性最低 ,平均等位基因数
为 3. 8,有效等位基因平均为 2. 0, 期望杂合度 (He )
为 0. 430 4。根据期望杂合度度量 ,毛红椿 7个群体
遗传多样度从大到小依次为 :云南元谋 >浙江遂昌
>云南宾川 >江西宜丰 >云南武定 >浙江仙居 >云
南师宗。
表 4　毛红椿 7个群体遗传多样度比较
群体
平均等位
基因数
(N a )
有效等位
基因数
(N e )
期望
杂合度
(He )
观察
杂合度
(Ho )
YF 3. 4 2. 1 0. 492 0 0. 581 1
YM 4. 4 2. 9 0. 658 4 0. 632 4
BC 3. 3 2. 3 0. 502 5 0. 759 6
WD 3. 1 2. 2 0. 490 0 0. 684 8
SZ 3. 8 2. 0 0. 430 4 0. 592 6
XJ 2. 6 1. 9 0. 445 8 0. 596 8
SC 3. 0 2. 2 0. 518 4 0. 509 0
平均数 3. 36 2. 19 0. 505 4 0. 622 3
标准差 0. 585 1 0. 325 1 0. 074 3 0. 080 5
2. 2　毛红椿遗传分化系数和基因流
SSR位点上的变异量在群体间及群体内的分布
情况 ,采用 Neipis (1987)的 F统计量 ( FST )对群体的
遗传变异进行分析 ,群体间的基因流用 Nm (Nm =
(1 - FST ) /4 FST )表示。从表 3中可以看到 : FST从
0. 063 1到 0. 419 2,平均值为 0. 185 4,即有 18. 54%
的遗传变异存在群体之间 ,而有 81. 46%的遗传变
异存在于群体之内。在 FST值的基础上估算毛红椿
群体间的基因流 (Nm )为 1. 098 3。
2. 3　固定指数分析
固定指数 ( F IS )反映居群的基因流、近亲繁殖情
况等 , F IS值变化在 - 1与 1之间 , F IS值越小 ,杂合子
越多 ; F IS值越大 ,纯合子越高 ; F IS值为 0,则说明群体
是随机交配的 ,等位基因频率符合 Hardy2W einberg
平衡理论。从表 3中可以看出 : 8个位点中除了位
点 Tc07固定指数为正值外 ,其它位点的固定指数值
都为负数 ,平均值为 - 0. 247 9,表明毛红椿天然群
体平均杂合度较高。
2. 4　毛红椿群体间遗传相似性和遗传距离
为了进一步分析群体间的遗传分化程度 ,计算
93
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
了 Neipis的遗传一致度 I和遗传距离 D (表 5)。各群
体的遗传一致度 I为 0. 576 1～0. 987 7,遗传距离 D
为 0. 012 4～0. 551 4, 7个毛红椿群体间遗传距离均
比较大。其中 ,遗传距离最大的是浙江仙居与云南
师宗群体 ,遗传距离为 0. 551 4;江西宜丰与浙江仙
居群体间遗传距离最小 ,为 0. 012 4。对各群体遗传
距离与地理距离的相关分析表明 ,群体间遗传距离
与地理距离显著性相关 ( r = 0. 730, P < 0. 05)。
根据各群体间的 Neipis (1978)遗传距离 ,采用平
均距离方法 (UPGMA )对 7个毛红椿群体进行聚类
(图 1)。从聚类图可看出 :北部 3个群体江西宜丰、
浙江仙居和遂昌聚在一起 ;南部 4个居群云南元谋、
宾川、武定和师宗聚在一起。
表 5　群体间遗传相似性和遗传距离
群体 YF YM BC WD SZ XJ SC
YF 0. 755 3 0. 601 6 0. 618 5 0. 591 6 0. 987 7 0. 979 5
YM 0. 280 7 0. 766 9 0. 784 3 0. 740 9 0. 741 2 0. 748 5
BC 0. 508 1 0. 265 4 0. 931 4 0. 869 2 0. 587 9 0. 614 4
WD 0. 480 5 0. 242 9 0. 071 0 0. 928 6 0. 603 9 0. 629 3
SZ 0. 524 9 0. 299 9 0. 140 2 0. 074 1 0. 576 1 0. 592 1
XJ 0. 012 4 0. 299 5 0. 531 2 0. 504 3 0. 551 4 0. 942 9
SC 0. 020 7 0. 289 6 0. 487 1 0. 463 1 0. 524 0 0. 058 8
注 :上三角数据为遗传一致度 ,下三角数据为遗传距离。
图 1　毛红椿 7个群体 Neipis (1978)遗传距离的 UPGMA聚类
3　小结与讨论
3. 1　毛红椿群体的遗传多样性
本文首次运用 SSR分子标记对毛红椿 7个群体
遗传多样性进行分析 ,对比国外利用微卫星研究楝
科树种群体遗传变异的结果 ,如大叶桃花心木 (Sw i2
eten ia m acrophy lla King ) 期 望 杂 合 度 ( He ) 为
0. 657[ 12 ]、0. 851[ 13 ] ,圭亚那苦油楝 (Carapa gu ianen2
sis Aubl. )期望杂合度 (He )为 0. 667[ 14 ] ,同时比较国
内外利用 SSR分子标记研究林木群体遗传变异的结
果 ,长寿命多年生、远交、种子靠风力传播植物期望
杂合度 (He )平均值为 0. 647[ 15 ] ,毛红椿为长寿命多
年生、远交、种子靠风力传播植物 ,可以看出毛红椿
天然居群具有较低水平的遗传多样性 ,应加强对其
的保护。在研究的 7个群体中 ,云南元谋群体遗传
多样性最高 ,这与该群体内所有单株年龄都比较大
(有的在 200 a以上 )有关 ,有效地保存了该物种的
遗传信息 ;其次为浙江遂昌、云南宾川和江西宜丰群
体 ;云南师宗群体的遗传多样性最低 ,这可能与该群
体的人类活动频繁有关 ,人为干预比较严重 ,导致其
遗传多样性降低。
3. 2　毛红椿群体间的遗传分化
天然群体的遗传变异是基因流和选择作用的综
合结果。同种植物各个群体空间上的隔离、突变、环
境因子造成的选择差、随机遗传漂变、基因流的隔离
等都能导致群体基因结构的空间异质性 ,从而促进
群体分化。毛红椿群体间的遗传分化系数为
0. 185 4,明显低于远交物种和多年生物种的平均值
(GS T = 0. 22和 GS T = 0. 19) [ 15 ] ,有 18. 54%的遗传变
异存在群体之间 ,而有 81. 46%的遗传变异存在于
群体之内。在 FS T值的基础上估算毛红椿群体间的
基因流 (Nm )为 1. 098 3。群体间基因流大于 1,有效
地阻止遗传漂变的发生 [ 16 ]。
3. 3　毛红椿濒危原因和保护策略
根据华南各省的调查资料 ,毛红椿在华南各省
都有分布 ,现存天然群体数量较少。由于自然环境
的变化 ,各地林业部门又缺乏管理和保护 ,过度开
发 ,特别是旅游业的兴起 ,导致大量天然林被毁 ,毛
红椿分布区不断缩小 ,很多省份只有零星分布 ,天然
群体生境片段化 ;加上毛红椿天然林更新缓慢 ,最终
导致毛红椿数量不断减少。
种质资源保存的主要依据是种内遗传多样性 ,
因此了解物种遗传变异的空间分布格局对于制定科
学的保护策略具有重要作用。毛红椿群体的遗传多
样性主要存在于群体内 ,说明各群体有一定的独特
04
第 1期 刘 　军等 :毛红椿群体遗传结构的 SSR分析
性 ,可为基因资源的保护和利用提供依据和指导。
根据各群体期望杂合度显示结果 ,群体遗传多样性
大体遵循云南元谋 >浙江遂昌 >云南宾川 >江西宜
丰 >云南武定 >浙江仙居 >云南师宗的递减格局 ,
说明云南作为现代毛红椿天然群体分布中心 ,由于
数量相对较多 ,分布较为广泛 ,应加强对云南毛红椿
天然群体的保护。
参考文献 :
[ 1 ] Petit R J,Mousadik A E, Pons O. Identifying populations for conser2
vation on the basis of genetic markers [ J ]. Conserration B iology,
1998, 12: 844 - 855
[ 2 ] Grassi F, Cazzaniga E,M inuto L, et a l. Evaluation of biodiversity and
conservation strategies in Pancratium m aritim um L. for the Northern
Tyrrhenian Sea [ J ]. B iodiversity and Conservation, 2005, 14:
2159 - 2169
[ 3 ] W ang L, Guo J, Zhao G F. Genetic diversity of the endangered and
endem ic species Psathyrostachys huashanica natural populations
using simp le sequence repeats ( SSR s) markers [ J ]. B iochem ical
systematics and ecology, 2006, 34: 310 - 318
[ 4 ] England P R, U sher A V, W helan R J, et al. M icrosatellite diversity
and genetic structure of fragmented populations of the rare, fire2de2
pendent shrub Grevillea m acleayana [ J ]. Molecular Ecology, 2002,
11 (6) : 967 - 977
[ 5 ] Echt C S, Deverno L L, Anzidei M. Chlorop last m icrosatellites re2
veal population genetic diversity in red p ine, Pinus resinosa A it[ J ].
Molecular Ecology, 1998, 7 (3) : 307 - 316
[ 6 ] Hassanien H A, Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of N ile
tilap ia (O reochrom is n iloticus) revealed by DNA m icrosatellites[ J ].
Aquaculture Research, 2005, 36, (14) : 1450 - 1457
[ 7 ] Jarne P, Lagoda P J L. M icrosatellites from molecules to populations
and back[ J ]. Trends Ecol Evol, 1996, 11: 424 - 429
[ 8 ] Gup ta P K, Balyan I S, Sharma P C, et a l. M icrosatellites in p lants2
a new class of molecular markers[ J ]. Curr Sci, 1996, 70: 45 - 54
[ 9 ] Bottin L, Verhaegen D, Tassin J, et a l. Genetic diversity and popu2
lation structure of an insular tree Santalum autrocaledonicum in New
Caledonia archipelago[ J ]. Molecular Ecology, 2005, 14 (7) : 1979 -
1989
[ 10 ] 刘　军 ,孙宗修 ,陈益泰 ,等. 珍稀濒危树种毛红椿微卫星 DNA
分离及 SSR反应体系优化 [ J ]. 中国生物工程杂志 , 2006, 26
(12) : 50 - 55
[ 11 ] 楼炉焕 ,金水虎. 浙江古田山自然保护区种子植物区系分析
[ J ]. 北京林业大学学报 , 2000, 22 (5) : 33 - 39
[ 12 ] Novick R R, D ick C W , Lemes M R, et al. Genetic structure of
Mesoamerican populations of B ig2leaf mahogany ( Sw ieten ia m acro2
phylla) inferred from m icrosatellite analysis[ J ]. Molecular Ecolo2
gy, 2003, 12 (1) : 2885 - 2893
[ 13 ] LemesM R, Gribel R, Proctor J, et al. Population genetic structure
of mahogany ( Sw ieten ia m acrophylla King, Meliaceae) across the
B razilian Amazon, based on variation at m icrosatellite loci: imp li2
cations for conservation [ J ]. Molecular Ecology, 2003, 12 ( 11 ) :
2875 - 2883
[ 14 ] Dayanandan S, Dole J, Bawa K, et al. Population structure deline2
ated with m icrosatellite markers in fragmented populations of a trop2
ical tree, Carapa guianensis (Meliaceae) [ J ]. Molecular Ecology,
1999, 8 (10) : 1585 - 1592
[ 15 ] Nybom H. Comparison of different nuclear DNA markers for estima2
ting intraspecific genetic diversity in p lants [ J ]. Molecular Ecolo2
gy, 2004, 13 (5) : 1143 - 1155
[ 16 ] A llendorf F W. Isolation, gene flow, and genetic differentiation
among populations [M ] / / Schonewauld2Cox C M, Chamers S M,
MacB ryde B, et a l. Genetics and Conservation. Menlo Park, CA:
Benjam in / Cumm ing, 1983: 51 - 65
14